核轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1在結(jié)直腸癌中的表達及其與預后的關(guān)系

何承志，戚文靜，王輝，杜天明，王智輝，王向陽

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院胃腸外科，湖北武漢430000）

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在所有腫瘤中排第3 位，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，2020年新診斷病例190 萬例，死亡93.5 萬例[1]。由于生活和飲食習慣的改變，過去10年中我國結(jié)直腸癌發(fā)病率迅速上升[2-3]。轉(zhuǎn)移仍是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，約60%的結(jié)直腸癌患者發(fā)展成轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[4],轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌5年生存率僅13.9%[5-6]。 核 轉(zhuǎn) 錄 因 子 HMBOX1 （homeoboxcontaining 1，HMBOX1）是2006年分離并鑒定的轉(zhuǎn)錄因子，基因包含21 個外顯子，長度在160 kb，定位于染色體8p21.2，屬于同源框基因成員，其特征在于含有同源框結(jié)構(gòu)域[7]，HMBOX1 在多種正常組織中表達，包括胰腺、大腦、胎盤、前列腺、胸腺、睪丸等[8]。研究報道同源框基因在多種腫瘤中表達異常，調(diào)控細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及細胞自我更新[9-10]。在膠質(zhì)瘤[11]和卵巢癌[12]中HMBOX1異常低表達，且低表達與上述腫瘤預后差相關(guān)。然而，HMBOX1 在結(jié)直腸癌中的表達及與預后的關(guān)系尚未見報道。本研究探討HMBOX1 在人結(jié)直腸癌組織中的表達及預后特征。

1 材料與方法

1.1 組織標本納入和排除標準

納入2012年1月—2014年1月在我院胃腸外科結(jié)直腸癌切除術(shù)后癌組織標本90 例，其中男59 例，女31 例，I～II 期26 例，III～IV 期64 例，其中15 例為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。納入標準：⑴術(shù)后經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌；⑵按NCCN 指南原則治療；⑶患者病歷資料完整且具有完整隨訪資料。排除標準：患者隨訪或臨床資料缺失者。本研究標本采集自病理組織樣本庫并經(jīng)醫(yī)院批準。

1.2 臨床資料收集和隨訪

收集患者性別、腫瘤部位、年齡、轉(zhuǎn)移等一般臨床資料，采用TNM 分期（第8 版）[13]對病理組織切片再評估以準確確定TNM 分期。隨訪方案：術(shù)后采用門診或電話方式隨訪，隨訪頻次為3 個月或半年/次。截止日期為2020年1月，術(shù)后至腫瘤首次復發(fā)或隨訪截止時間定義為無瘤生存時間。術(shù)后至患者死亡或隨訪截止時間定義為總生存時間。共4 例失訪，在生存曲線上表示為截斷值。

1.3 免疫組化

對4 μm 厚的石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織切片行免疫組織化學染色。將切片在二甲苯中脫石蠟并在梯度乙醇中再水合。用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并用3%山羊血清阻斷非特異性結(jié)合。隨后，將HMBOX1 一抗（1∶200，英國Abcam 公司） 于組織切片上孵育，4 ℃下孵育過夜。將磷酸鹽緩沖鹽水孵育的切片設定為陰性對照。將切片與過氧化物酶綴合的二抗一起溫育。二氨基聯(lián)苯胺用作色原體，蘇木素復染后，在200 倍顯微鏡下觀察計數(shù)，在鏡下10 個視野下取平均值。

1.4 免疫組化評分

評估HMBOX1 染色，選擇每個載玻片中的至少10 個隨機視野并由兩位病理大夫獨立評估。陽性細胞的百分比評分如下：0% 細胞染色=0 分；1%～10%細胞染色=1 分；11%～50%細胞染色=2 分；51%～100%細胞染色=3 分。染色強度評分如下：陰性染色=0 分；弱染色=1 分；中度染色=2 分；重度染色=3 分。最終免疫評分=染色百分比評分×染色強度評分。根據(jù)免疫染色評分結(jié)果將患者分為兩組：染色總評分0～4 分定義為HMBOX1 低表達組；染色總評分6～9 分定義為HMBOX1 高表達組。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有分析均使用SPSS 17.0 軟件進行。兩組間的比較使用t檢驗，χ2檢驗評估臨床病理特征與HMBOX1 表達間的關(guān)系。Cox 比例風險回歸分析模型分析影響結(jié)直腸癌患者預后的危險因素，Kaplan-Meier 生存曲線和對數(shù)秩檢驗分析結(jié)直腸癌患者預后差異，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HMBOX1在結(jié)腸癌組織中的表達

免疫組化示HMBOX1 主要定位于結(jié)直腸癌細胞核及胞漿中，組化染色陽性。90 例患者中，HMBOX1 高表達組有54（60.0%）例，HMBOX1 低表達組有36（40.0%）例，HMBOX1 在結(jié)直腸癌癌組織中典型組化染色結(jié)果見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織中HMBOX1免疫組織化學染色（×200）Figure 1 Immunohistochemical staining of HMBOX1 in colorectal cancer tissues (×200)

2.2 結(jié)直腸癌組織中HMBOX1 表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，HMBOX1 高表達與TNM 分期、N 分類、M 分類及分化程度明顯有關(guān)（均P<0.05），而與患者年齡、性別和T 分類無明顯關(guān)系（均P>0.05）（表1）。

表1 HMBOX1表達與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Associations between clinicopathologic characteris‐tics and HMBOX1 expression[n(%)]

2.3 HMBOX1的表達與患者預后間的關(guān)系

HMBOX1 高表達組1、3、5年無瘤生存率分別為90.0%、50.5%、18.3%，HMBOX1 低表達組1、3、5年無瘤生存率分別為93.6%、67.4%及34.2%，HMBOX1 高表達組無瘤生存率低于HMBOX1 低表達組（均P<0.01）（圖2A）。HMBOX1 高表達組1、3、5年總生存率分別為92.0%、 63.4%、 22.6%，HMBOX1 低表達組1、3、5年總生存率分別為95.3%、75.1%及36.1%，HMBOX1 高表達組總生存率低于HMBOX1 低表達組（均P<0.01）（圖2B）。

圖2 不同HMBOX1表達狀態(tài)結(jié)直腸癌患者的生存分析Figure 2 Survival analysis of colorectal cancer patients with different HMBOX1 expressions

2.4 影響無瘤生存率的危險因素分析

單因素分析表明， III～IV 期、 N2、 M1及HMBOX1 高表達為影響無瘤生存率的危險因素（均P<0.05）， 多因素分析表明， III～IV 期、 M1及HMBOX1 高表達是影響無瘤生存率的獨立危險因素（均P<0.05）（表2）。

表2 影響無瘤生存率的危險因素分析Table 2 Analysis of risk factors for tumor-free survival

2.5 影響總生存率的危險因素分析

單變量分析顯示，III～IV 期、M1、低分化及HMBOX1 高表達為影響總生存率的危險因素（均P<0.05），而多因素分析顯示，III～IV 期、低分化及HMBOX1 高表達是影響總生存率的獨立危險因素（均P<0.05）（表3）。

表3 影響總生存率的危險因素分析Table 3 Analysis of risk factors for overall survival

3 討 論

現(xiàn)代腫瘤學認為，結(jié)直腸癌的發(fā)生是一系列環(huán)境因素、不良生活方式及遺傳因素相互作用的結(jié)果。諸如，吸煙、缺乏運動、喝酒、肥胖、高脂低纖維素飲食等[14-15]。慢性炎癥-發(fā)育不良-腺瘤-腺癌是結(jié)直腸癌發(fā)生的一般病理過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的抑制、甲基化及DNA損傷修復錯配[16-17]。結(jié)直腸癌癌變過程涉及眾多關(guān)鍵分子的突變或表達異常，包括Ras[18]、P21[19]、P53[20]、HMBOX1[21]等。

HMBOX1 是與DNA 損傷修復過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，屬于同源框基因成員之一，最初發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)節(jié)免疫功能和干細胞分化[22-23]，后來發(fā)現(xiàn)其與維持端粒長度有關(guān)[21]。HMBOX1 主要在腎小管中表達，在正常胃組織中，HMBOX1 主要位于壁細胞中，提示HMBOX1可能與機體的正常功能有關(guān)。HMBOX1 是一種轉(zhuǎn)錄因子，只有從胞漿轉(zhuǎn)運入胞核才能發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能，在不同類型的組織或腫瘤中可能有不同的表達模式，即存在異質(zhì)性[8]。在腎透明細胞癌[8]、胰腺癌[8]組織中呈高表達。在胃癌組織中，HMBOX1 呈高表達且主要定位于癌細胞核內(nèi)，HMBOX1 陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TNM 分期呈負相關(guān)，且與胃癌術(shù)后患者總生存時間呈負相關(guān)。值得注意的是，HMBOX1 蛋白在胃癌組織中主要定位于細胞核，而在正常胃黏膜主要定位于胞漿[24]。與之不同，在肝癌組織中HMBOX1 呈低表達，且miR-548a-5p 通過靶向HMBOX1 的mRNA 的3 端非編碼區(qū)抑制HMBOX1 的翻譯,從而抑制肝癌細胞HepG2 的凋亡[8]。在膠質(zhì)瘤中HMBOX1 也呈低表達，且與WHO 分級、Karnofsky 評分及微血管密度相關(guān)[11]。在高級別漿液性卵巢癌及細胞系中，HMBOX1 呈低表達，HMBOX1 可抑制卵巢癌細胞增殖，并通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL，促進凋亡蛋白Bad、Bax、caspase-3及P53表達誘導細胞凋亡[12,21]。

本研究經(jīng)免疫組化發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中HMBOX1 在細胞核及胞漿中表達陽性，HMBOX1 已被證實是一種抑制性轉(zhuǎn)錄因子，在細胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，HMBOX1 在結(jié)直腸癌細胞核中的特定位置可能與HMBOX1 在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HMBOX1 高表達者比例為60%，HMBOX1 低表達者比例為40%。研究[24]報道在胃癌中，HMBOX1 較鄰近癌旁組織上調(diào)表達[9,24]。本研究發(fā)現(xiàn)HMBOX1 高表達與結(jié)直腸癌患者低分化、晚期TNM 分期、N 分類和M 分類顯著相關(guān)，提示HMBOX1 高表達組患者腫瘤分化程度低且處于TNM晚期。HMBOX1 高表達與結(jié)直腸癌患者年齡、性別和T 分類間無統(tǒng)計學相關(guān)性，提示其表達不受上述因素影響。文獻[8]報道肝癌中HMBOX1 低表達與肝癌患者晚期臨床分期相關(guān)，結(jié)果與本研究相反，其可能原因為HMBOX1 在不同腫瘤中表達具有異質(zhì)性。

HMBOX1 高表達組預后均顯著差于HMBOX1 低表達組，提示高低表達組患者無瘤生存率和總生存率存在差異。這與胃癌[24]中的結(jié)果一致。然而，文獻報道結(jié)果不盡一致，卵巢癌[12]中HMBOX1 低表達與卵巢癌預后不良顯著相關(guān)，這與本研究結(jié)果相反。HMBOX1 異常表達與膠質(zhì)瘤預后無明顯相關(guān)性[11]，其可能原因為HMBOX1 在癌癥中的臨床預后意義依據(jù)腫瘤類型而異。本研究Cox 比例風險回歸分析中單因素和多因素分析均顯示HMBOX1 高表達是影響結(jié)直腸癌術(shù)后患者無瘤生存率和總生存率的獨立危險因素。 這與文獻報道結(jié)果一致，在胃癌中，HMBOX1 高表達是胃癌獨立危險因素[24]。

在結(jié)直腸癌中HMBOX1 表達影響預后的機制尚不清楚，可能原因如下：文獻報道同源框基因的表達改變在腫瘤進展的不同階段可發(fā)揮促進或抑制腫瘤發(fā)生和進展的雙重作用[25]，HMBOX1 作為同源框基因之一，細胞增殖的影響可能基于腫瘤類型不同而異。HMBOX1 高表達與TNM 分期相關(guān)，且顯著降低結(jié)直腸癌患者的生存時間。在胃癌細胞系中，上調(diào)HMBOX1 表達可通過促進細胞周期，促進胃癌細胞增殖和遷移[24]。另一個機制可能是HMBOX1 參與癌癥干細胞自我更新的維持和調(diào)節(jié)，并參與血管生成[26]。HMBOX1 高表達與血管內(nèi)皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子β 及CD133 表達相關(guān)，而血管內(nèi)皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子β 及CD133 均與腫瘤新生血管生長的促進因子，而高密度腫瘤血管生成則是結(jié)直腸癌癌細胞生長的重要條件之一[27-29]。

本研究存在如下局限性：本研究為單中心回顧性研究，研究病例數(shù)目較少，尚需要結(jié)合TCGA或GEO 預后數(shù)據(jù)庫或多中心大樣本研究進一步驗證；本研究并未探討HMBOX1 影響結(jié)直腸癌患者預后的分子機制，也是進一步的研究方向。

總之，結(jié)直腸癌中HMBOX1 表達與結(jié)直腸癌患者較差組織學分化、TNM 分期密切相關(guān)，HMBOX1 高表達組患者預后差于HMBOX1 低表達組患者，HMBOX1 表達是影響結(jié)直腸癌術(shù)后患者預后的獨立危險因素。