具超二倍體特征的多發(fā)性骨髓瘤患者染色體核型分析

黃河，林泓豆，郭文堅(jiān)，李倩

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1．血液內(nèi)科；2．檢驗(yàn)科

隨著新藥及新治療方式的出現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）患者的總體生存期（overall survival, OS）明顯延長；大部分MM患者都存在染色體核型改變，而這些細(xì)胞遺傳學(xué)異常（cytogenetic abnormality, CA）對疾病的發(fā)病機(jī)制、臨床癥狀、分期、藥物療效和預(yù)后有著重要的指導(dǎo)意義，尤其是蛋白酶體后時(shí)代（2017年7月進(jìn)口硼替佐米萬珂納入我國醫(yī)保，隨后國產(chǎn)硼替佐米陸續(xù)上市），CA已明確成為MM危險(xiǎn)度分層的重要指 標(biāo)[1-4]。超二倍體是指除正常染色體組以外，還有一條或幾條額外的染色體或染色體片段的細(xì)胞或個(gè)體，研究表明近45%的MM患者中可發(fā)現(xiàn)超二倍體，且該變化往往提示較好的預(yù)后，但仍有研究對其預(yù)后意義存在爭議[5-6]。本研究對溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科33例初發(fā)或復(fù)發(fā)具超二倍體核型的MM病例進(jìn)行染色體及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）表達(dá)研究，為MM的治療及預(yù)后提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2009年6月至2018年7月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院收治的150例初發(fā)或復(fù)發(fā)的MM患者，均未接受過移植或CAR-T治療。其中33例為超二倍體核型（染色體數(shù)≥47且＜75），7例亞二倍體（染色體數(shù)≤44），109例二倍體（染色體數(shù)=46），1例近四倍體（染色體數(shù)＞75）。所有MM患者診斷符合張之南等主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[7]，分期分型按照《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2017年修訂）》[8]。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析：取患者骨髓液6～8 mL，于20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃采用短期培養(yǎng)法培養(yǎng)24～48 h，收集細(xì)胞，采用R帶技術(shù)顯帶，每例標(biāo)本分析20個(gè)分裂相。核型分析按照 《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2009）》描述核型。

1.2.2 FISH檢測：選擇數(shù)目異常常見的CSP3/7、D7S522/CSP7、D5S23D5S721/CSF1R、13/21、18XY探針，及位點(diǎn)和融合基因探針：RB1/D13S319 （13q14）、C-MYC（8q24）、IGH（14q32）、P53/1q21（17p13.1/1q21）、PML/RARɑ（15q21/17q21）、BCR/ABL（22q11/9q34）及CCND1/IGH（11q13/14q32）檢測基因。染色體分析剩余的標(biāo)本，滴片，37 ℃在2×枸櫞酸鈉（saline sodium citrate, SSC）緩沖液中老化30 min，后70%、85%、100%乙醇中梯度脫水各2 min。自然晾干，加探針蓋上蓋玻片，封膠封片，78 ℃變性5 min，39 ℃孵箱雜交過夜。揭去蓋玻片，46 ℃在2×SSC中洗5 min，46 ℃在2×SSC 0.1%的Np-40洗5 min，70%、85%、100%乙醇中梯度脫水各2 min，自然晾干。加DAPI復(fù)染，蓋上蓋玻片4 ℃保存。熒光顯微鏡油鏡下選取分散較好的、完整的細(xì)胞分裂周期間期和中期分裂相細(xì)胞至少200個(gè)。結(jié)果判讀：觀察細(xì)胞核內(nèi)熒光信號并計(jì)數(shù)，有2個(gè)熒光信號點(diǎn)為正常，多于2個(gè)信號點(diǎn)為擴(kuò)增，僅見1個(gè)信號點(diǎn)為缺失。使用日本尼康80-A1熒光顯微鏡拍攝圖像，使用圖像分析軟件AI（Gene Company Limited）進(jìn)行分析。相關(guān)的濾色片包括：DAPI，ORANGE，GREEN，AQUA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 預(yù)后生存分析采用Mantel-Cox法構(gòu)建生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 本研究在150例MM患者中共檢出超二倍體患者33例，發(fā)生率為22%。超二倍體患者年齡49～82歲，中位年齡66歲；男女性別比例9:2，其中28例為初發(fā)，5例為復(fù)發(fā)。23例為IgG型或IgG輕鏈型，5例為IgA輕鏈型，1例IgD輕鏈型。DS分期： I、II期45.5%（15/33），III期54.5%（18/33）；ISS分期：I、II期60.6%（20/33），III期39.4%（13/33）；RISS分 期：I、II期81.8%（27/33），III期18.2%（6/33）。對150例MM患者隨訪至2021年5月，超二倍體患者與非超二倍體患者（包括亞二倍體，二倍體及近四倍體）OS率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.735），中位生存時(shí)間分別為18.5個(gè)月和15個(gè)月，見圖1。

圖1 超二倍體與非超二倍體MM患者OS

2．2 染色體核型分析 所示超二倍體均具備染色體三體性，常見增多的染色體按檢出率從大到小依次為+5（23/33），+3（18/33），+19（17/33），+9（16/ 33），+2、+4、+7、+11（均13/33），+10（12/33）、+6、+14、+18、+21（均11/33），+8（10/33），具體染色體核型分布見表1和圖2，與目前文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)較常見增加的染色體大致一致，包括3、5、7、9、11、18、19和21號染色體[9-11]，但常見增加表達(dá)的15號染色體這里僅為5例，發(fā)生率為15.2%。圖3為1例近四倍體MM患者R顯帶核型圖，可見17、18、X染色體呈二倍體，1、10、11、12、13、14號染色體呈三倍體，2、3、4、5、6、7、8、9、15、16、19、20、21、22號染色體呈四倍體。

圖2 超二倍體MM患者染色體增加構(gòu)成與分布

圖3 1例近四倍體MM患者骨髓染色體核型圖

表1 患者核型特征

續(xù)表1

2.3 FISH檢測結(jié)果 33例超二倍體MM骨髓標(biāo)本用探針進(jìn)一步行FISH檢測，如圖4所示檢出異常有ABL信號擴(kuò)增（20/33，60.6%），PML信號擴(kuò)增（16/33，48.5%），1q21信號擴(kuò)增（15/33，45.5%），RB1缺失（10/33，30.3%），CCND1擴(kuò)增（8/33，24.2%），IGH擴(kuò)增（3/33，9.1%），IGH易位（2/33，6.1%），C-MYC重排（2/33，6.1%），P53擴(kuò)增（2/33，6.1%）。

圖4 超二倍體MM患者骨髓FISH檢測異常分布

2．4 復(fù)發(fā)超二倍體核型特征 在超二倍體MM患者中，有4例為復(fù)發(fā)患者，其中1例60個(gè)月中復(fù)發(fā)2次。初發(fā)時(shí)為二倍體，復(fù)發(fā)時(shí)為超二倍體，增加的三體有常見2、3、4、5、7、8、9、10、11、15、16、18、19、20、21號染色體。僅其中1例雙輕鏈表達(dá)的MM初治為超二倍體，復(fù)發(fā)后表現(xiàn)為正常二倍體核型。見表2。

表2 4例復(fù)發(fā)超二倍體MM患者核型比較

3 討論

染色體不穩(wěn)定是MM的常見特征，細(xì)胞遺傳學(xué)對預(yù)后的重要指導(dǎo)意義已達(dá)成共識，國際骨髓瘤工作組（International Myeloma Working Group, IMWG）在此基礎(chǔ)上定義了高?；颊?。目前對CA的分析除傳統(tǒng)的常規(guī)核型（conventional chromosome, CC）檢測技術(shù)外，還有FISH、高通量基因組分析單核苷酸（single nucleotide polymorphism, SNP）、比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）、基因表達(dá)分析技術(shù)等。本研究主要是以CC技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合FISH檢測，分析2009至2018年期間我院現(xiàn)存資料較完整的MM患者細(xì)胞遺傳學(xué)異常情況。本研究發(fā)現(xiàn)提示預(yù)后較好的超二倍體在MM患者中較常見，且存在染色體三體性，同時(shí)往往合并多樣的基因異常表達(dá)，包括基因擴(kuò)增、易位及缺失等；但因樣本量較少，故其對臨床的指導(dǎo)意義相對有限。本研究患者為蛋白酶體抑制劑廣泛應(yīng)用前時(shí)期，故未將當(dāng)前一線治療方案療效與CA的相關(guān)性進(jìn)行探討。

目前已有較多大樣本研究對染色體數(shù)異常與MM預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行探討，認(rèn)為超二倍體發(fā)生率較高，且提示較好的預(yù)后。對于超二倍體，認(rèn)為其常見特征是一組一致的奇數(shù)染色體，染色體3、5、7、9、11、15、19和21的三體性在MM的發(fā)生率為50%～60%；而18號染色體在大多數(shù)情況下存在于二倍體中，其在超二倍體中以三體形式出現(xiàn)的情況很少 見[5，9，12-13]。近年YANG等[12]用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)97例MM患者中40例為超二倍體，且以5、7、9、11、15和17號染色體三體的形式出現(xiàn)，而增加的染色體也與預(yù)后相關(guān)。超二倍體合并存在高危CA時(shí)則預(yù)后欠佳，如del（17p），t（4；14），+1q[14-15]。一項(xiàng)對1 970例初診MM的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，存在超二倍體或t（11；14）時(shí)，兩者并不能改善同時(shí)具有不良預(yù)后事件MM患者的預(yù)后[如t（4；14），t（14；16），t（14；20）]，并且認(rèn)為超二倍體發(fā)生于IGH易位事件前[16]； 但是另一項(xiàng)我國針對201例MM患者的細(xì)胞遺傳學(xué)分析認(rèn)為，超二倍體異?？筛纳凭哂懈呶＜?xì)胞遺傳學(xué)患者的不良預(yù)后，且僅有高危遺傳學(xué)異常但不為超二倍體的患者預(yù)后最差[17]。另外較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為亞二倍體異常提示不良預(yù)后，并且超單倍體是MM中一種新的高危細(xì)胞遺傳學(xué)亞群[18]。而近四倍體發(fā)生率較低，且多合并染色體結(jié)構(gòu)異常，及異?；虻谋磉_(dá)，故其與預(yù)后的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究，但認(rèn)為其預(yù)后不佳[16]，如本文中1例近四倍體患者，其OS僅為5個(gè)月。人們發(fā)現(xiàn)較其他類型染色體異常，具有染色體三體性特征的MM患者OS最佳，以+3，+5預(yù)后較好，+21預(yù)后相對較差，且予以RD（lenalidomide+dexamethasone）化療療效顯著[19]。此外，本研究列出的4例復(fù)發(fā)MM患者中，3例初診時(shí)染色體為二倍體，復(fù)發(fā)后染色體數(shù)為超二倍體，提示可能復(fù)發(fā)時(shí)患者的細(xì)胞遺傳學(xué)表達(dá)較初發(fā)時(shí)更復(fù)雜，但這與患者預(yù)后的相關(guān)性仍需更多的臨床數(shù)據(jù)支持。

本研究對象發(fā)病較早，蛋白酶體抑制劑可及性較差時(shí)期，故未對治療進(jìn)行探討；另當(dāng)時(shí)所及的CA檢測技術(shù)有限，且樣本量較小，故所得研究結(jié)論有一定的局限性，如相較超二倍體與非超二倍體的MM患者并未獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的OS率。超二倍體患者所增加的三體染色體特征基本與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致，但其與MM患者的分期、分型及臨床癥狀并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。所增加的染色體往往合并多種基因的擴(kuò)增性表達(dá)，通過進(jìn)一步的FISH檢測也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因的異常表達(dá)，如所提示不良預(yù)后的1q21擴(kuò)增，同時(shí)也有ABL、PML及CCND1擴(kuò)增，但目前的研究僅提示上述擴(kuò)增與染色體損傷修復(fù)相關(guān)，并無大樣本的數(shù)據(jù)證明其在血液腫瘤中的預(yù)后指導(dǎo)意義。此外，RB1缺失也較常見，另外我們也發(fā)現(xiàn)了IGH易位與IGH擴(kuò)增，但因總體樣本量關(guān)系，并未將其與預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行探討。