未明原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中SLC25A13基因變異特征

方玲娟，林小春，徐彰，黃開(kāi)宇，陳檜平，閆秀梅

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童消化科，浙江 溫州 325027

Citrin缺陷?。–itrin deficiency, CD）由SLC25A13基因變異導(dǎo)致編碼Citrin蛋白缺失和功能異常引起的一種常染色體隱性遺傳性疾病。臨床上主要包含CD缺陷所致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency, NICCD）[1]、CD所致的生長(zhǎng)發(fā)育落后和血脂異常（failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD）[2]和成人發(fā)病瓜氨酸血癥II型（adult-onset type II citrullinemia, CTLN2）[3]三種類(lèi)型[4]。

NICCD是一種泛種族疾病，尤其以東南亞國(guó)家多見(jiàn)，我國(guó)多省市均有NICCD的報(bào)道，各地發(fā)病率、SLC25A13基因變異特征及攜帶率均存在一定的差異。迄今為止，浙江省關(guān)于嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中SLC25A13基因變異的相關(guān)文獻(xiàn)僅有3篇，共報(bào)道了6例NICCD患兒，其中1例合并膽道閉鎖。本研究分析溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院就診的未明原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中SLC25A13基因的變異特征，了解本地區(qū)的疾病譜特征，為臨床診療提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2016年1月至2020年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童消化科住院的未明原因嬰兒膽汁淤積癥病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡小于1歲；②結(jié)合膽紅素升高（血清總膽紅素高于85 μmol/L，結(jié)合膽紅素占總膽紅素的20%以上；或者血清總膽紅素低于85 μmol/L，結(jié)合膽紅素大于17 μmol/L）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①除外肝外膽道疾病，包括膽道閉鎖、膽道囊腫或腫瘤等；②除外持續(xù)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）低于50 U/L和（或）總膽汁酸（total bile acid, TBA）低于10 μmol/L；③除外感染（包括細(xì)菌感染，如尿路感染、敗血癥等，以及血清學(xué)陽(yáng)性病毒感染，如弓形蟲(chóng)、風(fēng)疹病毒、EB病毒、單純皰疹病毒、HIV、梅毒螺旋體感染等），但未排除巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染患兒，因?yàn)镃MV感染在嬰兒中常見(jiàn)，感染后其預(yù)后與未感染患兒無(wú)明顯差異，且存在CMV感染并不能排除其他病因，尤其是遺傳性病因；④排除甲狀腺功能低下、靜脈營(yíng)養(yǎng)史等。

1.2 方法 經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患兒家屬簽署知情同意書(shū)后，留取患兒及其父母親的外周EDTA抗凝血 2 mL，抽提基因組DNA。先證者基因組DNA樣本進(jìn)行二代測(cè)序（包括膽汁淤積性肝病Panel或者全外顯子組測(cè)序），并加測(cè)SLC25A13基因常見(jiàn)的兩個(gè)大片段熱點(diǎn)變異位點(diǎn)c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb。再根據(jù)二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果，對(duì)患兒及其父母DNA標(biāo)本進(jìn)行SLC25A13基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.1 二代測(cè)序（next generation sequencing, NGS）及一代驗(yàn)證：采用液相捕獲試劑盒捕獲，通過(guò)NGS儀IlluminaHiSeq 2000（美國(guó)Illumina公司）完成高通量測(cè)序，測(cè)序平均深度不小于200。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因序列生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)再進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。此部分分別委托北京邁基諾基因檢測(cè)公司和北京金準(zhǔn)基因檢測(cè)公司完成。

2.3 新發(fā)變異L603P的致病性分析 該變異位點(diǎn)位于SLC25A13基因的第17號(hào)外顯子，通過(guò)檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)，均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)。通過(guò)檢索多個(gè)人類(lèi)遺傳變異體數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在不同地區(qū)不同人群中的等位基因變異頻率極低：在千人數(shù)據(jù)庫(kù)中為0；在EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)中不同人群中均為0；在GnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中東亞和南亞人群為0，歐洲人群中則為1.8/10萬(wàn)。對(duì)該變異位點(diǎn)氨基酸保守性分析顯示此位點(diǎn)氨基酸在不同物種間具有高度保守性，見(jiàn)表2。另外，多個(gè)變異功能預(yù)測(cè)軟件分析均顯示該位點(diǎn)變異為致病性變異。具體如下：在Mutation Taster分析中顯示該位點(diǎn)變異可顯著影響功能，為致病性變異，其分值為0.871（分值越接近1，功能影響越大）；在SIFT分析中顯示為有害變異，分值＜0.001（＜0.05提示為有害變異）；在Provean分析中提示為有害變異，分值為-6.73（≤-2.5提示為有害變異）；在Polyphen2分析中提示為有害變異，分值為0.832（＞0.8提示為有害變異）；在M-CAP和CADD分析中均提示為致病性變異，分值分別為0.304（＞0.025提示為致病性）和28.2（＞20提示為致病性）。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 30例中10例進(jìn)行了膽汁淤積性肝病Panel檢測(cè)（包含SLC25A13基因），18例進(jìn)行了全外顯子檢測(cè)，另有2例直接進(jìn)行SLC25A13基因全部外顯子檢測(cè)。同時(shí)所有病例都加測(cè)了中國(guó)人群中常見(jiàn)的大片段變異位點(diǎn)c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的檢測(cè)。共發(fā)現(xiàn)12例患兒攜帶SLC25A13基因變異，其中2例純合變異，5例復(fù)合雜合變異，5例雜合變異，見(jiàn)表1。SLC25A13基因的總檢出率為40%（12/30）。在8例存在明顯瓜氨酸血癥的病例中均檢測(cè)到存在SLC25A13基因致病性變異，其中2例純合、4例復(fù)合雜合以及2例雜合。還有4例雖然不存在血氨基酸代謝異常，仍檢出SLC25A13基因致病性變異，包括1例復(fù)合雜合變異和3例雜合變異。另外3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患兒均未檢出到SLC25A13基因變異。共檢測(cè)到19個(gè)致病性變異位點(diǎn)，7個(gè)不同的變異類(lèi)型，包括中國(guó)人群中最常見(jiàn)的4個(gè)致病性變異，分別為c.852_855delTATG，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb，以及2個(gè)次常見(jiàn)致病性變異c.1177+1G＞A和c.1399C＞T，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)未報(bào)道的新發(fā)變異位點(diǎn)c.1808T＞C，p.L603P。其中c.852_855delTATG占總檢出致病性變異的52.63%（10/19），c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占總檢出致病性變異的10.53%。4個(gè)常見(jiàn)致病性變異占總檢出致病性變異的84.21%（16/19），4個(gè)常見(jiàn)致病性變異和2個(gè)次常見(jiàn)致病性變異占總檢出致病性變異的94.73%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間兩兩比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 一般資料 共30例未明原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒納入本研究，其中男18例，女12例。除1例患兒父母為近親婚配外，其余所有患兒的父母均非近親。其中29例患兒進(jìn)行了血氨基酸質(zhì)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)8例瓜氨酸升高伴或者不伴其他氨基酸升高（如甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸），3例甲硫氨酸升高，1例酪氨酸升高，另外17例未見(jiàn)明顯氨基酸代謝異常。

1.2.3 判讀方法：測(cè)序結(jié)果利用SeqScape 2.0軟件進(jìn)行分析，然后利用DNAMAN5.1.5軟件（LynnonBiosof，美國(guó)）與SLC25A13基因序列（Ensembl Genome Browser：ENSG0000004864）進(jìn)行比對(duì)。變異類(lèi)型根據(jù)人類(lèi)基因組變異學(xué)會(huì)（http://varnomen.hgvs.org/）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行命名。致病性分析根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）發(fā)布的序列變異的解釋標(biāo)準(zhǔn)指南進(jìn)行[5]。SLC25A13基因Ensembl參考序列為ENSG00000004864，Genbank參考序列為NM_014251.3。編碼的氨基酸Ensembl參考序列為ENSP00000265631.1，Genbank參考序列為NP_055066.1。檢測(cè)到的變異通過(guò)檢索PubMed、HGMD、ClinVar等在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。已知的致病性變異、經(jīng)典剪接位點(diǎn)變異、無(wú)義和框移變異均被認(rèn)為是致病的。對(duì)新發(fā)的錯(cuò)義變異分別進(jìn)行人群變異頻率分析、氨基酸同源性分析、變異功能預(yù)測(cè)分析等，以確定其致病性。

2.4 瓜氨酸代謝異常與基因譜的相關(guān)性 在12例檢測(cè)到SLC25A13基因變異的患兒中，共8例入選瓜氨酸血癥組，3例入選非瓜氨酸血癥組。另外1例由于血氨基酸檢測(cè)時(shí)患兒膽汁淤積癥已完全緩解，轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常，參考意義不大，故不適合入組分析。對(duì)比瓜氨酸血癥組和非瓜氨酸血癥組中的基因變異類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)2組基本以非錯(cuò)義變異為主，基因變異類(lèi)型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；比較2組間等位基因變異數(shù)量，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸血癥組中等位基因變異的數(shù)量顯著高于非瓜氨酸血癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。

美國(guó)、加拿大、澳大利亞等國(guó)制定并完善了礦業(yè)生態(tài)補(bǔ)償相關(guān)措施。例如美國(guó)的“濕地融資計(jì)劃”，澳大利亞的“環(huán)境凈收益計(jì)劃”，加拿大要求礦業(yè)主與政府簽署“損益協(xié)議書(shū)”，做好利益分配和生態(tài)補(bǔ)償[13]。同時(shí)還著重對(duì)廢棄礦山進(jìn)行改造，發(fā)展礦山公園和礦業(yè)旅游。

國(guó)家政府應(yīng)該加大對(duì)女性就業(yè)的政策幫扶，通過(guò)政治手段和法律手段規(guī)范就業(yè)體制，完善對(duì)女性就業(yè)的權(quán)益保護(hù)；社會(huì)要發(fā)揮媒體的宣傳效應(yīng)，加大對(duì)女性就業(yè)的正面宣傳，引導(dǎo)女大學(xué)畢業(yè)生更加自信更加清楚的面對(duì)社會(huì)客觀形式，提高自身能力，保持清醒的意識(shí)，客觀擇業(yè)。各應(yīng)聘單位一定要客觀公平公正公開(kāi)的進(jìn)行合法招聘，避免性別歧視和人為設(shè)置“就業(yè)壁壘”，根據(jù)理工科女大學(xué)畢業(yè)生的特點(diǎn)為她們?cè)O(shè)定一批能夠發(fā)揮她們自身最大商業(yè)價(jià)值的競(jìng)聘崗位。

2 結(jié)果

證明 定義如下：對(duì)任意x ∈ X, = (x → 1) → 1).首先證明是X的猶豫模糊濾子.顯然， ? 對(duì)任意x ∈ X都成立，即(HF1)成立.對(duì)任意x,y ∈ X, 由命題1.1和引理2.1知，

1.2.2 熱點(diǎn)變異c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的檢測(cè)：①位點(diǎn)c.1638_1660dup23bp：這是一段23 bp序列的重復(fù)，在該位點(diǎn)的兩端設(shè)計(jì)引物（F：CAGGAGAGGCATGGTTGCATTTCCC；R：GACTTAC GAATTGCTACAGCGATGG），PCR片段長(zhǎng)度為480 bp，用普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增再送去一代測(cè)序即可。目標(biāo)區(qū)域序列為GAGATTACAGGTGGCTGCCCGGG，如樣本沒(méi)有出現(xiàn)23 bp的重復(fù)，判定為野生型（negative），反之則為變異型（positive）。②位點(diǎn)IVS16ins3kb：這是一段3 kb的片段插入變異，在該位點(diǎn)的兩端設(shè)計(jì)引物（F：GGAGCAGACATCTTGCACAC；R：TGATGAGAATG TATCAACTCC），如果有插入，PCR之后會(huì)出現(xiàn)大于 3 kb的條帶；如果沒(méi)有插入，結(jié)果只有703 bp的條帶。為了確認(rèn)這一結(jié)果，再對(duì)PCR產(chǎn)物片段偏大的樣本進(jìn)行一代測(cè)序，如果樣本出現(xiàn)了3 kb的堿基插入，判定為變異型（positive）。

企業(yè)在資金使用的過(guò)程中，需要進(jìn)行嚴(yán)格的科學(xué)論證，不能盲目擴(kuò)大規(guī)模，防止資金斷流，讓企業(yè)陷入經(jīng)營(yíng)困境。對(duì)于中小型餐飲企業(yè)而言，提升企業(yè)自身經(jīng)營(yíng)實(shí)力，發(fā)展品牌效益，是企業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。

不錯(cuò)，簡(jiǎn)東亮是李若的房東，當(dāng)初李若到廣州來(lái)打拼的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)房租貴得要命，她繞來(lái)繞去地找朋友，就租到了簡(jiǎn)東亮的房子。他貸款買(mǎi)的50平的兩居室，月供要還20年，路漫漫其修遠(yuǎn)兮，出租個(gè)房間給李若也是為了緩解一下房貸壓力。

3 討論

SLC25A13基因變異所致NICCD在新生兒期及嬰兒早期常表現(xiàn)為血氨基酸異常，尤其以瓜氨酸血癥為最典型[6-7]。通常為了提高SLC25A13基因變異篩查效益，多以血氨基酸明顯異常作為主要篩選指標(biāo)，進(jìn)行高頻致病性變異的篩查[2，6，8-9]。本研究中在8例存在明顯瓜氨酸血癥的病例中均檢測(cè)到存在SLC25A13基因變異，可見(jiàn)瓜氨酸血癥在NICCD病例中具有高度特征性，是臨床識(shí)別NICCD的重要指標(biāo)，與既往研究[6]一致。本研究中3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患兒均未檢出到SLC25A13基因變異，與既往研究[6]不一致。另外，本研究中4例雖然不存在血氨基酸代謝異常，仍檢出SLC25A13基因變異，提示對(duì)于臨床不存在氨基酸代謝異常的膽汁淤積病例需要保持警惕，要考慮NICCD的可能性，以免發(fā)生漏診，延誤診治。另外，本研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸血癥患兒中等位基因變異的數(shù)量明顯高于非瓜氨酸血癥患兒，提示等位基因變異數(shù)量越多對(duì)Citrin蛋白功能影響越大，故越易導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)瓜氨酸血癥。近幾年，多個(gè)研究[6，10-12]表明， 雖然瓜氨酸血癥在NICCD中具有特征性，但是在新生兒期以及嬰兒期仍然存在血氨基酸代謝篩查陰性的NICCD患兒，這部分病例容易誤診、漏診，對(duì)于缺乏典型臨床表現(xiàn)的病例，需考慮采用NGS進(jìn)行基因檢測(cè)。

研究發(fā)現(xiàn)日本最常見(jiàn)的致病性變異類(lèi)型是c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[13]，而韓國(guó)人群中最常見(jiàn)的致病性變異類(lèi)型是IVSl6ins3kb、c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[14]。LIN等[10]報(bào)道的中國(guó)人群中最常見(jiàn)致病性變異為：c.852_855delTATG（58.33%）、IVSl6ins3kb（10.04%）、c.1638_1660dup（8.52%）、c.615+5G＞A（7.58%），且存在地區(qū)差異，c.852_855delTATG在南方高，北方低，而IVSl6ins3kb在南方低，北方高。基因變異的地區(qū)差異可能與人種遷移及祖先來(lái)源有關(guān)。本研究先證者中檢出的變異類(lèi)型中，以4種高頻變異最常見(jiàn)，其中c.852_855delTATG占總檢出變異的52.63%，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占總檢出變異的10.53%，與LIN等[10]的研究相一致，本研究中的病例來(lái)源于溫州，溫州地處浙南地區(qū)，位于北回歸線以南，變異特征與地理區(qū)域分布相吻合。國(guó)內(nèi)報(bào)道了多個(gè)不同地區(qū)關(guān)于SLC25A13基因變異研究，從中國(guó)北部到中國(guó)南部，從中國(guó)東部到中國(guó)西部，c.852_855delTATG變異在總變異中的頻率為46.57%～58.33%，可以看到該變異占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，近半數(shù)的病例攜帶c.852_855delTATG變異。LU等[13]報(bào)道中國(guó)正常人群中c.852_855delTATG等位基因攜帶率為1.08%（45/4169），對(duì)于我國(guó)龐大的人口基數(shù)來(lái)說(shuō)，c.852_855delTATG變異位點(diǎn)攜帶者數(shù)量相當(dāng)可觀，需要重視，尤其是有關(guān)優(yōu)生優(yōu)育方面，減少或避免遺傳代謝病嬰兒的出生。

本研究是溫州地區(qū)，乃至浙江地區(qū)首個(gè)CD的隊(duì)列研究，SLC25A13基因變異總檢出率為40%，提示Citrin缺陷是嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中的重要病因，亦是嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中居首位的遺傳性代謝性病因。隨著對(duì)CD的認(rèn)識(shí)逐步加深，研究的進(jìn)一步深入，新發(fā)變異逐步被發(fā)現(xiàn)。本研究檢測(cè)到一個(gè)新發(fā)變異c.1808T＞C，p.L603P，該變異位點(diǎn)為罕見(jiàn)變異位點(diǎn)，變異功能預(yù)測(cè)分析提示為致病性變異，新變異的發(fā)現(xiàn)豐富了SLC25A13基因變異譜。以上發(fā)現(xiàn)為NICCD確診提供了可靠依據(jù)，也為相應(yīng)家庭的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究的不足之處在于3例患兒存在SLC25A13基因單個(gè)雜合變異，且未提示存在明顯瓜氨酸血癥，無(wú)法確診NICCD。本研究?jī)H對(duì)已知常見(jiàn)的大片段的插入或缺失變異進(jìn)行檢測(cè)，可能遺漏罕見(jiàn)、未報(bào)道到的，甚至是內(nèi)含子區(qū)域的大片段的插入或缺失變異。另外，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的變異，僅進(jìn)行變異功能預(yù)測(cè)，未進(jìn)行體外功能研究，未來(lái)可以對(duì)新變異的功能改變進(jìn)一步進(jìn)行研究。

SLC25A13基因變異所致CD是未明顯原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中居首位的遺傳代謝性病因，以c.852_855delTATG，p.M285Pfs*2為最常見(jiàn)變異類(lèi)型。新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)豐富了SLC25A13基因的變異譜。