天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞體內(nèi)外增殖的影響及機(jī)制研究

張丹丹，翟云良，季 芳，張亞云，夏 揚(yáng)，李 全，王恒斌

天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞體內(nèi)外增殖的影響及機(jī)制研究

張丹丹，翟云良#，季 芳，張亞云，夏 揚(yáng)，李 全，王恒斌*

雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009

探究天佛參口服液對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞與裸鼠移植瘤增殖的作用以及相關(guān)作用機(jī)制。采用Cell Titer-Glo發(fā)光法檢測(cè)天佛參口服液對(duì)9種不同基因突變表型的肺癌細(xì)胞系增殖的抑制作用；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡的影響；采用Western blotting法考察天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。裸鼠sc A549細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，考察天佛參口服液對(duì)小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。天佛參口服液抑制A549細(xì)胞增殖，呈劑量相關(guān)性；天佛參口服液阻滯A549細(xì)胞周期于G0/G1期和G2/M期（＜0.05、0.01），并且1%天佛參口服液可以顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡（＜0.01）；天佛參口服液顯著抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、Raf、絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen extracellular signal-regulated kinase，MEK）以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）蛋白的磷酸化水平（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2.25 mL/kg天佛參口服液對(duì)裸鼠移植瘤模型的腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)具有顯著抑制作用（＜0.05）。天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制EGFR活性和下調(diào)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。

天佛參口服液；肺癌；A549細(xì)胞；增殖；裸鼠移植瘤模型；抗腫瘤

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤之首。近年來我國肺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的80%～85%[1-2]，其中30%～70%的患者確診時(shí)已處于晚期，5年生存率僅為17.7%[3]。因此大部分肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，化療成為臨床晚期肺癌患者的主要治療手段，而晚期肺癌患者由于化療藥物的各種不良反應(yīng)及繼發(fā)的耐藥情況極易導(dǎo)致化療失敗。天佛參口服液是一種已被批準(zhǔn)生產(chǎn)的抗癌中成藥，由西洋參、蟾酥、天冬、倒卵葉五加、獼猴桃根、沙棘、土貝母、佛手8味中藥制成，具有扶正祛邪、養(yǎng)陰益氣、清熱解毒、消核散結(jié)的功效，主治惡性腫瘤所致的氣陰兩虛型及氣滯、血瘀、痰凝、毒聚等兼見癥候。臨床研究表明，天佛參口服液聯(lián)合化療藥治療NSCLC療效明顯，可以降低化療藥的不良反應(yīng)，并提升晚期肺癌患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期[4-7]。本研究以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，探究天佛參口服液對(duì)其體內(nèi)外增殖的作用及作用機(jī)制，以期為天佛參口服液用于治療/輔助治療肺癌及其抗腫瘤活性提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人非小細(xì)胞肺癌NCI-H2228細(xì)胞、人大細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞、A549細(xì)胞、人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌NCI-H23細(xì)胞、人肺癌腺癌NCI-H1792細(xì)胞和人肺退行性癌Calu-6細(xì)胞購自美國ATCC；人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；人非小細(xì)胞肺腺癌NCI-H157細(xì)胞購自北京銀紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房中，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，照明12 h/d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)控制與監(jiān)督委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2018-027）。

1.3 試劑

天佛參口服液（體外實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)批號(hào)1404281、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)批號(hào)1805031）由常熟雷允上制藥有限公司生產(chǎn)，本品含西洋參不得少于0.35 mg/mL [以人參皂苷Rb1（C54H92O23）計(jì)]；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清、胰酶購自美國Hyclone公司；Cell Titer-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司；磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（phosphorylated epidermal growth factor receptor，p-EGFR）抗體、EGFR抗體、p-b-Raf抗體、b-Raf抗體、磷酸化絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated mitogen extracellular signal-regulated kinase，p-MEK）抗體、MEK抗體、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）抗體、ERK抗體、β-actin抗體、二抗均購自美國CST公司；PE-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司；PBS溶液、RNAse A溶液（不含DNAse）購自北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（PI）購自美國Sigma公司。

1.4 儀器

1300系列A2生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Optec倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；Envision多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）；Guava EasyCyte流式細(xì)胞儀（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 藥物配制

體外實(shí)驗(yàn)以天佛參口服液作為原液（濃度視為100%），每次使用前用無菌的3%蔗糖水溶液稀釋成需要的濃度，再經(jīng)培養(yǎng)基稀釋成終濃度分別為10.000 00%、3.330 00%、1.110 00%、0.370 00%、0.123 00%、0.041 20%、0.013 70%、0.004 57% 8個(gè)濃度梯度進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，用蒸餾水將天佛參口服液原液稀釋成4.44、2.22倍的濃度分別用于低、高劑量組的動(dòng)物給藥，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

各細(xì)胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為70%時(shí)，進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 Cell Titer-Glo法檢測(cè)9種不同基因突變表型的肺癌細(xì)胞系活力

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后接種于96孔板中，180 μL/孔，其中A549細(xì)胞接種密度為1×103/孔，NCI-H2228細(xì)胞接種密度為4×103/孔，其余細(xì)胞接種密度為2×103/孔，培養(yǎng)24 h。由于天佛參口服液的溶劑為3%蔗糖，因此用3%蔗糖水溶液將天佛參口服液進(jìn)行稀釋，最高濃度取天佛參口服液原液的10%，并進(jìn)行3倍梯度稀釋，每個(gè)濃度取20 μL加入到受試細(xì)胞中，3%蔗糖水溶液處理組為對(duì)照孔。處理72 h后，棄去培養(yǎng)基，加入25 μL Cell Titer-Glo?試劑，室溫振蕩混勻2 min，靜止10 min后，采用酶標(biāo)儀讀取Luminescence熒光信號(hào)，使用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算天佛參口服液對(duì)細(xì)胞增殖抑制的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。

2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定A549細(xì)胞周期分布

將A549細(xì)胞以2.5×105/孔接種于6孔板中，37 ℃過夜培養(yǎng)。加入終濃度分別為0.030%、0.060%、0.125%、0.250%、0.500%的天佛參口服液，對(duì)照組加入3%蔗糖水溶液，處理24 h后用胰酶消化并收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞樣品用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2遍，用70%乙醇-PBS溶液吹散細(xì)胞，4 ℃固定過夜；用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2遍，盡量去除殘留的乙醇；樣品用含50 μg/mL RNase-A和PI的染液進(jìn)行染色，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，通過FlowJo 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定A549細(xì)胞凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2.5×105/孔接種于6孔板中，37 ℃過夜培養(yǎng)。加入終濃度分別為0.01%、0.10%、1.00%的天佛參口服液，對(duì)照組加入3%蔗糖水溶液，處理24 h后用胰酶消化并收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞樣品用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2遍，重懸于50 μL結(jié)合液中，每管加入2.5 μL PE- Annexin V試劑和2.5 μL 7-AAD試劑；對(duì)照組加入200 μL結(jié)合液，均分成4等份：1份不加任何染料，1份加入2.5 μL PE-Annexin V試劑，1份加入2.5 μL 7-AAD試劑，另1份加入2.5 μL PE-Annexin V試劑和2.5 μL 7-AAD試劑。溫和混勻，避光室溫孵育15 min，每份樣品加入150 μL結(jié)合液混勻，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6 Western blotting法檢測(cè)A549細(xì)胞p-EGFR、EGFR、p-b-Raf、b-Raf、p-MEK、MEK、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板中，每組樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。加入終濃度分別為0.001%、0.010%、0.100%的天佛參口服液，對(duì)照組加入3%蔗糖水溶液，分別處理0、10、20、30、45、60、90、120、240 min，用胰酶消化并收集細(xì)胞，收集的細(xì)胞樣品用預(yù)冷的PBS溶液清洗1次，加入細(xì)胞裂解液（1% NP-40、20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、137 mmol/L NaCl、10%甘油、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑），冰上裂解15 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉，分別加入p-EGFR、EGFR、p-b-Raf、b-Raf、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗后，X光曝光顯影，采用Image J灰度分析軟件進(jìn)行定量分析。

2.7 裸鼠移植瘤模型

BALB/c裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為模型組和天佛參口服液高、低劑量（4.50、2.25 mL/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的1/2、1/4倍）組，每組6只。造模當(dāng)天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以預(yù)冷的0.9%的氯化鈉溶液制備成5×106/mL細(xì)胞懸液備用。BALB/c裸鼠用75%乙醇消毒右側(cè)腋下皮膚，每只裸鼠右腋sc 0.2 mL A549細(xì)胞懸液[19]，造模后24 h開始給藥。以給藥當(dāng)天為第1天，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)48 d。第10天腫瘤開始陸續(xù)出現(xiàn)，于接種第20天（即給藥第19天）開始使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑（mm）和短徑（mm），并計(jì)算腫瘤體積。每2～4天測(cè)1次，保持1周測(cè)2次。動(dòng)物給藥第48天進(jìn)行安樂死，剝離腫瘤稱定質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

腫瘤體積＝1/2×腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2

抑瘤率＝(模型組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 天佛參口服液對(duì)不同肺癌細(xì)胞系增殖的抑制作用

如圖1和表1所示，天佛參口服液對(duì)9種不同基因突變表型的肺癌細(xì)胞系均存在不同程度的抑制作用，其中以N-Ras突變的NCI-H1299細(xì)胞和K-Ras突變的A549細(xì)胞對(duì)天佛參口服液最敏感，IC50分別為0.012%和0.013%，并且濃度超過0.3%的天佛參口服液能夠完全抑制并殺死9種不同基因突變表型的肺癌細(xì)胞系。

圖1 天佛參口服液對(duì)不同肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

表1 天佛參口服液對(duì)不同肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用 (n =2)

3.2 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞增殖抑制與細(xì)胞周期分布密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步檢測(cè)不同濃度天佛參口服液對(duì)其敏感細(xì)胞株A549的細(xì)胞周期分布影響，結(jié)果如圖2和表2所示，A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度天佛參口服液處理24 h后，與對(duì)照組比較，0.030%天佛參口服液組G0/G1期細(xì)胞顯著增加（＜0.01），而0.060%、0.125%、0.250%、0.50%天佛參口服液組G2/M期細(xì)胞顯著增加（＜0.01），表明低濃度的天佛參口服液能夠使A549細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，而濃度超過0.06%的天佛參口服液能夠明顯阻滯A549細(xì)胞于G2/M期，并成劑量相關(guān)性。

3.3 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。與對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞存在明顯的抗凋亡現(xiàn)象。如圖3和表3所示，0.10%、1.00%天佛參口服液顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡（＜0.05），表明高濃度的天佛參口服液能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并呈劑量相關(guān)性。

圖2 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

表2 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響(, n = 3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01，表3同

*<0.05**<0.01control group, same as table 3

圖3 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

表3 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

3.4 天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步闡明TFS抗腫瘤的作用機(jī)制，檢測(cè)了天佛參口服液對(duì)增殖信號(hào)通路Ras/Raf/MEK/ ERK磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用。首先觀察了0.5%天佛參口服液處理A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)該細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中EGFR、Raf、MEK、ERK蛋白磷酸化的作用，結(jié)果如圖4-A所示，0.5%天佛參口服液處理細(xì)胞A549 10 min時(shí)，MEK和ERK蛋白磷酸化水平開始降低；處理30 min時(shí)EGFR和b-Raf蛋白磷酸化水平開始降低，并于45 min時(shí)降低最明顯，天佛參口服液對(duì)Raf、MEK及ERK蛋白磷酸化的抑制作用一直持續(xù)2 h左右，隨后作用緩慢減弱，于作用4 h時(shí)MER和ERK的磷酸化水平開始上調(diào)。隨后觀察了不同濃度天佛參口服液處理A549細(xì)胞2 h對(duì)該細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，結(jié)果如圖4-B所示，與對(duì)照組比較，不同濃度天佛參口服液作用2 h后均能夠不同程度地下調(diào)A549細(xì)胞中EGFR、Raf、MEK及ERK激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化水平，并且存在一定的劑量相關(guān)性，且0.1%天佛參口服液抑制作用最顯著（＜0.05、0.01），表明天佛參口服液抑制A549細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能與調(diào)控EGFR活性及其下游信號(hào)通路Ras/Raf/MEK/ERK有關(guān)。

A-0.5%天佛參口服液作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 B-不同劑量天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.5 天佛參口服液對(duì)裸鼠移植瘤模型體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響

如圖5和表4所示，給藥48 d期間，與模型組比較，天佛參口服液高、低劑量（4.50、2.25 mL/kg）對(duì)小鼠體質(zhì)量均沒有明顯影響；天佛參口服液高、低劑量對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，抑瘤率分別達(dá)到27.7%、36.7%；與模型組比較，天佛參口服液低劑量組小鼠瘤質(zhì)量顯著降低（＜0.05）。

與模型組比較：*P＜0.05

表4 天佛參口服液對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤抑制率的影響()

與模型組比較：*＜0.05

*<0.05model group

4 討論

天佛參口服液源于關(guān)中名醫(yī)李新民教授經(jīng)過長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐，反復(fù)論證而總結(jié)出的抗癌經(jīng)驗(yàn)方。近年來，諸多藥理研究和臨床研究表明天佛參口服液對(duì)喉癌[8]、胃癌、肝癌、宮頸癌[9]等多種腫瘤細(xì)胞均具有良好的抑制作用，尤其臨床用于肺癌的治療起到很好的效果，能夠提高患者免疫功能，改善晚期肺癌患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量。此外，天佛參口服液與化療藥聯(lián)用可以減輕化療引起的不良反應(yīng)，達(dá)到增效減毒效應(yīng)，經(jīng)臨床實(shí)踐證明為安全有效的治療非小細(xì)胞肺癌的中成藥[10]，但是其抑癌機(jī)制尚未闡明。本研究首先通過體外增殖實(shí)驗(yàn)全面地觀察天佛參口服液對(duì)9種不同基因突變來源的肺癌細(xì)胞系（Calu-6、A549、NCI-H1299、NCI-H23、NCI-H460、NCI-H2228、NCI-H157、NCI-H1792、NCI-H1975）的生長(zhǎng)抑制作用，篩選出天佛參口服液的敏感肺癌細(xì)胞系為A549和NCI-H1299細(xì)胞。合理的細(xì)胞有絲分裂及增殖是生物生存的基礎(chǔ)，而細(xì)胞周期失控導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖成為腫瘤，選取A549細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)低濃度的天佛參口服液（0.03%）能夠?qū)549細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，高濃度的天佛參口服液（0.06%～0.50%）可以阻滯其細(xì)胞周期于G2/M期，此外濃度超過0.1%的天佛參口服液可以明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞出現(xiàn)晚期凋亡，提示天佛參口服液可能通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗肺癌作用。

EGFR是一種具有酪氨酸酶活性的膜表面受體，在NSCLC中常發(fā)生突變，其突變后導(dǎo)致的酪氨酸激酶域過度激活是肺腫瘤發(fā)生的原因[11]，EGFR也是目前NSCLC靶向治療中最重要的靶點(diǎn)之一，EGFR能夠介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，其主要機(jī)制是通過EGFR配體本身同源二聚化或異源二聚化啟動(dòng)信號(hào)通路，從而引起機(jī)體內(nèi)部的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路為EGFR介導(dǎo)的下游信號(hào)通路中最重要且作用最廣泛的通路[12]，其主要涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[13]。當(dāng)Ras激活時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜大量分泌并活化下游分子Raf激酶，并激發(fā)了一系列蛋白激酶激活和磷酸化，磷酸化的Raf和活化MEK可進(jìn)一步激活ERK，活化的ERK從Ras-Raf-MEK-ERK復(fù)合體上分離，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，在此發(fā)生磷酸化并激活細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、下調(diào)基因從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）和髓細(xì)胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）活性，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]。因此該通路的過度激活在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[15]。Western blotting結(jié)果顯示，天佛參口服液能夠抑制EGFR活性，并下調(diào)其下游信號(hào)通路中Raf、MEK以及ERK蛋白的磷酸化水平，且處理細(xì)胞45 min時(shí)作用最強(qiáng)。由此推斷天佛參口服液中的有效成分能夠通過抑制EGFR活性，降低Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑瘤效果。

目前，裸鼠移植瘤模型已被廣泛應(yīng)用于抗肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌等腫瘤藥物的篩選中[16-19]。課題組前期在Lewis肺癌小鼠移植瘤模型上，發(fā)現(xiàn)天佛參口服液劑量在2.25～4.50 mL/kg時(shí)抑瘤效果較好，為了避免雌性小鼠性周期對(duì)造模和藥效的影響，本研究采用雄性BALB/c裸鼠皮下接種A549細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型來評(píng)估天佛參口服液（2.25、4.50 mL/kg）對(duì)A549細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果顯示低劑量（2.25 mL/kg）的天佛參口服液能夠抑制A549細(xì)胞移植瘤模型的腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)。

綜上，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明天佛參口服液對(duì)A549細(xì)胞具有抗腫瘤活性，可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來抑制A549細(xì)胞增殖，作用機(jī)制主要與抑制EGFR的活性、下調(diào)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。本研究為天佛參口服液臨床用于抗腫瘤治療或輔助治療提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Tianfoshen Oral Liquid on proliferation of A549 cellsand

ZHANG Dan-dan, ZHAI Yun-liang, JI Fang, ZHANG Ya-yun, XIA Yang, LI Quan, WANG Heng-bin

Lei Yun Shang Pharmaceutical Group Co., Ltd., Suzhou 215009, China

To investigate the effect and related mechanism of Tianfoshen Oral Liquid (天佛參口服液) on cell proliferation in A549 cells and lung cancer mice transplantable tumor in model animals.Cell Titer-Glo assay was used to detect the inhibitory effect of Tianfoshen Oral Liquid on proliferation of nine different gene mutation phenotypes of lung cancer cell lines; Flow cytometry was applied to determine the effect of Tianfoshen Oral Liquid on cell cycle and apoptosis of A549 cells; Western blotting was used to explore the effect of Tianfoshen Oral Liquid on expression of proliferation-related proteins in A549 cells. Nude mice were sc A549 cells to establish nude mice xenograft tumor model, the effect of Tianfoshen Oral Liquid on growth of subcutaneous xenograft tumors in mice was investigated.Tianfoshen Oral Liquid inhibited the proliferation of A549 cells, with dose-dependent; Tianfoshen Oral Liquid blocked the A549 cell cycle in G0/G1and G2/M phases (< 0.05, 0.01), and 1% Tianfoshen Oral Liquid significantly induced apoptosis of A549 cells (< 0.01); Tianfoshen Oral Liquid significantly inhibited epidermal growth factor receptor (EGFR), Raf, mitogen extracellular signal-regulated kinase (MEK) and extracellular regulated protein kinase (ERK) protein phosphorylation levels (< 0.05, 0.01), showing a dose-dependent. The results ofexperiments showed that 2.25 mL/kg Tianfoshen Oral Liquid had a significant inhibitory effect on tumor growth in nude mice transplanted tumor models (< 0.05).Tianfoshen Oral Liquid has a significant inhibitory effect on growth of A549 cellsand, and its mechanism may be related to the inhibition of EGFR activity and down-regulation of Ras/Raf/MEK/ERK signal pathway expression.

Tianfoshen Oral Liquid; lung cancer; A549 cells; proliferation; nude-mice transplanted tumor model; anti-cancer

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6568 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.015

2021-04-14

張丹丹（1988—），女，博士，主要從事中藥藥理毒理基礎(chǔ)研究。E-mail: zhangdandan@lys.cn

王恒斌（1972—），男，高級(jí)工程師，主要從事中藥新藥開發(fā)及上市后研究。E-mail: wanghengbin@lys.cn

#共同第一作者：翟云良（1988—），男，碩士，主要從事中藥藥理及臨床研究。E-mail: zhaiyunliang@lys.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]