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    瑤藥材搜山虎的化學(xué)成分研究

    2021-11-08 07:50:36周艷林劉曲山覃柳馨周澤陽王曉艷陳曉雙鄒節(jié)明奉建芳2
    中草藥 2021年21期
    關(guān)鍵詞:扭體腫痛藥材

    王 剛,鄒 準(zhǔn),周艷林,劉曲山,覃柳馨,周澤陽,王曉艷,陳曉雙,鄒節(jié)明*,奉建芳2, *

    瑤藥材搜山虎的化學(xué)成分研究

    王 剛1, 2, 3,鄒 準(zhǔn)1,周艷林1,劉曲山1,覃柳馨3,周澤陽3,王曉艷3,陳曉雙3,鄒節(jié)明1*,奉建芳2, 3*

    1. 桂林三金藥業(yè)股份有限公司,廣西 桂林 541004 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200

    研究搜山虎(嶺南花椒的根和莖)的化學(xué)成分,為雙虎腫痛寧酊劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。利用AB-8大孔樹脂、硅膠、制備色譜進(jìn)行成分分離,并結(jié)合核磁共振氫譜、碳譜和質(zhì)譜鑒定化合物結(jié)構(gòu);采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞對(duì)化合物進(jìn)行抗炎活性的研究;采用小鼠醋酸扭體法、熱板法對(duì)分離得到的成分進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性的研究。從搜山虎根中共分離得到10個(gè)化合物,分別鑒定為胡蘆巴堿(1)、甲芬那酸(2)、4-羥基肉桂酸(3)、小檗堿(4)、橙皮苷(5)、新綠原酸(6)、白藜蘆醇(7)、芥子酸(8)、脯氨酸(9)和甘草次酸(10)??寡谆钚匝芯拷Y(jié)果表明,化合物2、4~7、10能夠顯著抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的釋放。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,化合物2、4、7能夠顯著降低小鼠扭體次數(shù),顯著提高痛閾值。所有化合物均為首次從該植物及花椒屬植物中分離得到,化合物2、4、7具有很好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。

    嶺南花椒;抗炎;鎮(zhèn)痛;甲芬那酸;小檗堿;白藜蘆醇

    搜山虎是蕓香科植物嶺南花椒Huang的根和莖,主要產(chǎn)于廣西、廣東和江西等地[1]?!稄V西本草選編》《廣西藥用植物名錄》等本草論著均有記載,又名地蜈蚣、爬山虎、過山龍,性微寒,歸脾胃經(jīng),具有化瘀行氣、消腫止痛、舒筋活絡(luò)、驅(qū)風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、消積滯、通大便、降火的作用,用于治療全身筋骨疼痛、坐骨神經(jīng)痛,跌打損傷、外傷出血等癥狀[2-3]。有研究表明搜山虎中含有生物堿、氨基酸、酚類化合物、香豆素、萜類內(nèi)酯化合物等[4]。但具體成分均未明確,因此不利于搜山虎的質(zhì)量控制。

    雙虎腫痛寧酊劑是桂林三金藥業(yè)股份有限公司研制開發(fā)的一種非處方藥,臨床用于跌打損傷、扭傷、摔傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等疾病的治療,并可作骨折及脫臼復(fù)位等手術(shù)局部麻醉止痛用。搜山虎作為雙虎腫痛寧酊劑的君藥,是發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的主要藥味之一。搜山虎在廣西壯、瑤族民間醫(yī)中有廣泛的臨床應(yīng)用,也是靖西、恭城端午藥市上常見交易藥材,但相關(guān)基礎(chǔ)研究十分薄弱,開展其化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究,將為該民族藥資源的可持續(xù)開發(fā)利用,指導(dǎo)臨床合理用藥,促進(jìn)新藥開發(fā)和民族藥現(xiàn)代化提供依據(jù)。并有助于雙虎腫痛寧酊劑、古威活絡(luò)酊等臨床常用中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升。本研究以60%的乙醇為溶劑,利用滲漉法提取,結(jié)合硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化,通過波譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。從搜山虎中共分離得到10個(gè)化合物,分別鑒定為胡蘆巴堿(trigonelline,1)、甲芬那酸(mefenamic acid,2)、4-羥基肉桂酸(4-hydroxycinnamic acid,3)、小檗堿(berberine,4)、橙皮苷(hesperidin,5)、新綠原酸(neochlorogenic acid,6)、白藜蘆醇(resveratrol,7)、芥子酸(erucic acid,8)、脯氨酸(proline,9)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid,10)。以上所有成分均為首次從搜山虎中分離得到,也是首次從花椒屬植物中分離得到。體內(nèi)外活性研究表明,化合物2、4~7、10具有顯著的抗炎活性,化合物2、4、7具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

    1 儀器與材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    Bruker AM-600 MHz核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司);Waters Q-TOF Premier質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);安捷倫1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);AB-8大孔樹脂(天津市海光化工有限公司);C18制備色譜柱(250 mm×20 mm,5 μm,日本YMC公司);CP214分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司);硅膠(100~200、200~300目,青島海洋化工廠);GF254高效薄層板(青島海洋化工廠);其他試劑皆為分析純(天津大茂試劑有限公司);高效液相流動(dòng)相為色譜純(Thermo Fisher公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);96孔板(美國(guó)Thermo Fisher公司);Synergy H1酶標(biāo)儀(美國(guó)博騰公司);RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司);YP5002電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)。

    1.2 藥品

    研究所用的搜山虎藥材(標(biāo)本號(hào)20180201)采自廣西桂林,經(jīng)桂林三金藥業(yè)股份有限公司鄒節(jié)明教授鑒定為蕓香科植物嶺南花椒Huang的根和根莖,樣本存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心天然藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室。

    雙虎腫痛寧酊(批號(hào)180501,桂林三金藥業(yè)股份有限公司);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%,美國(guó)Sigma公司);胎牛血清(批號(hào)19460202,浙江天杭生物科技股份有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基 [批號(hào)SH40007.03,??寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司];腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(批號(hào)201906)、BCA試劑盒(批號(hào)A81911151),杭州聯(lián)科生物有限公司。

    1.3 動(dòng)物及細(xì)胞

    SPF 級(jí)昆明種小鼠,體質(zhì)量18~20 g,雌雄兼用,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)單位為廣西中醫(yī)藥大學(xué),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)為DW20210311-021,動(dòng)物飼養(yǎng)在溫濕度可控的動(dòng)物中心,自由攝食及飲水。

    RAW264.7單核細(xì)胞購(gòu)買于上海元和生物有限公司。

    2 方法

    2.1 提取與分離

    取搜山虎根粉10 kg,用60%乙醇滲漉提取,收集提取液,減壓濃縮回收溶劑,得棕黑色浸膏190 g。取上述浸膏,用AB-8大孔樹脂柱色譜進(jìn)行梯度洗脫,洗脫溶劑分別為水及20%、45%、65%、85%乙醇溶液。65%乙醇洗脫部分(50 g)經(jīng)正己烷-醋酸乙酯系統(tǒng)分離,反相C18柱色譜(流動(dòng)相為1%甲酸水-甲醇)分離得到化合物1(17.2 mg,R=24.1 min)、3(122.6 mg,R=36.3 min)、7(23.1 mg,R=42.1 min)、8(10.1 mg,R=27.6 min);85%乙醇洗脫部分(80 g)經(jīng)正己烷-醋酸乙酯系統(tǒng)分離,反相C18柱色譜(流動(dòng)相為水-甲醇)分離得到化合物2(142.2 mg,R=68.4 min)、4(12.1 mg,R=49.8 min)、5(7.7 mg,R=52.1 min)、6(17.2 mg,R=37.5 min)、9(8.3 mg,R=18.5 min)和10(6.6 mg,R=53.6 min)。

    2.2 ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6水平

    用0.5%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,接種于24孔板,接種密度為6×105個(gè)/孔,于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用搜山虎60%乙醇提取物、化合物1~9(給藥劑量為80 μg/mL)處理細(xì)胞1 h后,加入LPS(1 μg/mL)共培養(yǎng)20 h,取上清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行炎癥因子TNF-α和IL-6檢測(cè)。另外,設(shè)置對(duì)照組(不用LPS和藥物孵育)和LPS組(1 μg/mL LPS孵育)。

    2.3 小鼠醋酸扭體致痛實(shí)驗(yàn)

    昆明種小鼠110只,雌雄各半,隨機(jī)分成11組,每組10只,分別為對(duì)照組(水)、陽性對(duì)照組(雙虎腫痛寧酊劑)、搜山虎藥材60%乙醇提取物組、化合物1~9(100 mg/kg),對(duì)照、陽性對(duì)照及搜山虎藥材60%乙醇提取物組按1.6 mL/只涂于小鼠4足,化合物1~9組小鼠按照0.4 mL/只分別涂于小鼠4足。給藥后30 min,ip 0.6%冰醋酸,0.2 mL/只,同時(shí)用秒表計(jì)時(shí),記錄小鼠15 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)扭體(反應(yīng)指標(biāo)為腹部?jī)?nèi)凹、后肢伸展、抬高臀部),記錄ip冰醋酸后15 min內(nèi)扭體總次數(shù),并計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。

    2.4 小鼠熱板鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

    篩選出合格昆明種小鼠110只[痛閾值在5~30 s(以小鼠舔后足反應(yīng)為疼痛反應(yīng)指標(biāo))且無跳躍反應(yīng)的合格小鼠],隨機(jī)分成11組,每組10只,分別為對(duì)照組(水)、陽性對(duì)照組(雙虎腫痛寧酊劑)、搜山虎藥材60%乙醇提取物組、化合物1~9(100 mg/kg),對(duì)照、陽性對(duì)照及搜山虎提取物組按1.6 mL/只涂于小鼠4足。給藥完成0.5、1.0、1.5 h后,分別測(cè)定各組小鼠痛閾值,計(jì)算痛閾抑制率。

    痛閾抑制率=(給藥組小鼠平均痛閾值-對(duì)照組小鼠平均痛閾值)/對(duì)照組小鼠平均痛閾值

    3 結(jié)果

    3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1:白色粉末。分子式C7H7NO2,ESI-MS/: 136.238 2 [M-H]?。碘化汞鉀沉淀試驗(yàn)、碘-碘化鉀沉淀試驗(yàn)、苦味酸沉淀試驗(yàn)均呈陽性反應(yīng)[5]。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 9.20 (1H, s, H-2), 8.89 (1H, d,= 6.0 Hz, H-4), 8.74 (1H, d,= 7.9 Hz, H-6), 8.05~7.98 (1H, m, H-5), 4.36 (3H, s, -CH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 162.4 (C-7), 146.4 (C-6), 145.1 (C-2), 144.4 (C-4), 140.7 (C-3), 127.1 (C-5), 48.1 (-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[6],故鑒定化合物1為胡蘆巴堿。

    化合物2:白色粉末。分子式C15H15NO2,ESI- MS/: 240.122 9 [M-H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.98 (1H, s, -COOH), 9.45 (1H, s, -NH), 7.89 (1H, dd,= 8.1, 1.5 Hz, H-3), 7.33~7.28 (1H, m, H-5), 7.14~7.09 (2H, m, H-5′, 6′), 7.05~7.00 (1H, m, H-4′), 6.69 (2H, dd,= 11.9, 4.3 Hz, H-4, 6), 2.29 (3H, s, 7′-CH3), 2.10 (3H, s, 8′-CH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 170.7 (C-1), 149.2 (C-2), 138.8 (C-3), 138.4 (C-4), 134.7 (C-5), 132.2 (C-6), 131.7 (C-7), 126.9 (C-8), 126.5 (C-9), 122.7 (C-10), 116.7 (C-11), 113.6 (C-12), 111.7 (C-13), 20.7 (C-14), 14.1 (C-15)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[7-9],故鑒定化合物2為甲芬那酸。

    化合物3:白色粉末。分子式C9H8O3,ESI-MS/: 163.263 4 [M-H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.47 (2H, d,= 8.1 Hz, H-2, 6), 6.79 (2H, d,= 7.9 Hz, H-3, 5), 6.29 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 168.4 (C-9), 160.1 (C-4), 144.6 (C-7), 130.7 (C-6), 130.6 (C-6), 125.7 (C-1), 116.4 (C-3), 116.2 (C-5), 115.8 (C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[10-12],故鑒定化合物3為4-羥基肉桂酸。

    化合物4:白色粉末。分子式C17H17N,ESI-MS/: 236.312 2 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 9.91 (1H, s, H-8), 8.97 (1H, s, H-13), 8.20 (1H, d,= 9.2 Hz, H-11), 8.01 (1H, d,= 9.0 Hz, H-12), 7.80 (1H, s, H-1), 7.09 (1H, s, H-4), 6.17 (2H, s, -O-CH2-O-), 4.95 (2H, t,= 6.3 Hz, H-6), 4.10 (3H, s, -OCH3), 4.07 (3H, s, -OCH3), 3.23~3.19 (2H, t,= 6.4 Hz, H-5);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 150.9 (C-3), 150.3 (C-10), 148.2 (C-2), 145.9 (C-8), 144.1 (C-9), 137.9 (C-13a), 133.5 (C-12a), 127.2 (C-4a), 124.0 (C-11), 121.9 (C-8a), 120.9 (C-13b), 120.7 (C-13), 108.9 (C-1), 62.4 (9-OCH3), 57.5 (10-OCH3), 55.6 (C-6), 26.8 (C-5)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[13-14],故鑒定化合物4為小檗堿。

    化合物5:白色粉末。分子式C28H34O15,ESI-MS/: 611.125 6 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.02 (1H, s, 5-OH), 9.09 (1H, s, 3′-OH), 6.97~6.92 (2H, m, H-2′, 5′), 6.90 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6′), 6.16~6.11 (2H, m, H-6, 8), 5.50 (1H, ddd,= 10.9, 7.7, 3.0 Hz, H-2), 5.39 (1H, d,= 5.1 Hz, H-1′), 5.17 (2H, dd,= 10.7, 5.2 Hz, H-1′′′, 2′′), 4.98 (1H, t,= 8.2 Hz, H-1″), 4.52 (1H, s, H-3?), 3.77 (3H, s, 4′-OCH3), 3.57~3.52 (1H, m, H-6″), 3.32~3.25 (2H, m, H-5″′, 3″), 3.24~3.20 (1H, m, H-3), 3.19~3.10 (2H, m, H-4″, 4?), 1.09 (3H, dd,= 6.1, 3.5 Hz, 6?-CH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 197.5 (C-4), 165.6 (C-7), 163.5 (C-5), 163.0 (C-9), 148.4, (C-4′), 146.9 (C-3′), 131.4 (C-1′), 118.4 (C-6′), 114.6 (C-2′), 112.5 (C-5′), 103.8 (C-10), 101.1 (C-1′′′), 99.9 (C-1′), 96.8 (C-6), 96.0 (C-8), 78.8 (C-2), 76.7 (C-5′′), 76.0 (C-2′′), 73.4 (C-4′′′), 72.5 (C-3′′), 71.2 (C-4′′), 70.7 (C-3′′′), 70.1 (C-2′′′), 68.8 (C-5′′′), 66.5 (C-6′′), 56.1 (-OCH3), 42.5 (C-3), 18.3 (-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[15-16],故鑒定化合物5為橙皮苷。

    化合物6:白色粉末。分子式C16H18O9,ESI-MS/: 353.341 1 [M-H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.28 (1H, s, -COOH),7.46 (1H, d,= 15.8 Hz, H-β), 7.07~6.95 (2H, m, H-6′, 2′), 6.77 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.20 (1H, d,= 15.9 Hz, H-α), 5.34~4.82 (2H, m, H-3, 5), 3.87 (1H, dd,= 12.1, 5.7 Hz, H-8′), 3.55 (1H, d,= 2.7 Hz, H-4), 2.51 (1H, dt,= 3.6, 1.8 Hz, H-6), 2.06~1.84 (4H, m, 2×-CH2);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 176.5 (-COOH), 166.6 (-C=O), 148.6 (C-4′), 146.0 (C-β), 144.9 (C-3′), 126.2 (C-1′), 121.6 (C-6′), 116.3 (C-5′), 115.5 (C-α), 115.1 (C-2′), 73.4 (C-1), 71.4 (C-4), 67.7 (C-3), 56.5 (C-5), 35.6 (C-2), 19.0 (C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17-18],故鑒定化合物6為新綠原酸。

    化合物7:白色粉末。分子式C14H12O3,ESI-MS/: 229.244 1 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.42~7.37 (2H, m, H-2′, 6′), 6.93 (1H, d,= 16.3 Hz, H-1), 6.82 (1H, d,= 16.3 Hz, H-1′), 6.78~6.74 (2H, m, H-3′, 5′), 6.39 (2H, d,= 2.1 Hz, H-2, 6), 6.13 (1H, t,= 2.1 Hz, H-4);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 159.0 (C-3′), 157.7 (C-6), 139.7 (C-1′), 128.5 (C-3), 128.3 (C-2), 128.3 (C-4), 126.1 (C-1), 116.0 (C-5), 104.7 (C-2′), 102.2 (C-4′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19-20],故鑒定化合物7為白藜蘆醇。

    化合物8:白色粉末。分子式C11H12O5,ESI-MS/: 223.122 1 [M-H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.13 (1H, s, -COOH), 7.50 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.99 (2H, s, H-1, 6), 6.42 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 3.80 (6H, s, 2×-CH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 168.4 (-COOH), 148.5 (C-3, 5), 145.3 (C-β), 138.5 (C-4), 125.1 (C-1), 116.5 (C-α), 106.5 (C-2, 6), 56.6 (-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[21-22],故鑒定化合物8為芥子酸。

    化合物9:白色粉末。分子式C5H9NO2,ESI-MS/: 115.146 1 [M-H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 8.66 (1H, s, -COOH), 3.64 (1H, dd,= 8.3, 5.4 Hz, H-2), 3.29~3.13 (2H, m, 5-CH2), 2.07~1.86 (2H, m, 3-CH2), 1.84~1.60 (2H, m, 4-CH2);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 169.8 (-COOH), 61.2 (C-2), 45.6 (C-5), 29.4 (C-3), 24.4 (C-4)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[23-24],故鑒定化合物9為脯氨酸。

    化合物10:白色粉末。分子式C34H50O7,ESI-MS/: 569.076 1 [M-H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.18 (1H, s, -COOH), 5.40 (1H, s, H-12), 3.02 (1H, d,= 10.9 Hz, H-3), 2.58 (2H, dt,= 12.9, 3.1 Hz, H-1), 2.33 (1H, s, H-9),1.31 (3H, m, H-27), 1.25 (3H, td,= 14.1, 3.7 Hz, H-29), 1.15 (3H, d,= 12.0 Hz, H-25), 1.11 (3H, d,= 8.9 Hz, H-23), 1.03 (3H, d,= 6.0 Hz, H-26), 0.96 (2H, dd,= 13.7, 2.6 Hz), 0.91 (3H, s, H-26), 0.76 (3H, s, H-24), 0.70 (3H, d,= 8.6 Hz, H-28);13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 199.5 (C-11), 178.1 (C-29), 170.1 (C-13), 127.7 (C-12), 77.1 (C-3), 61.6 (C-9), 54.6 (C-5), 48.5 (C-18), 45.3 (C-8), 43.5 (C-20), 43.4 (C-14), 41.1 (C-19), 39.2 (C-4), 39.0 (C-1), 38.0 (C-22), 37.1 (C-10), 32.6 (C-7), 32.0 (C-17), 30.8 (C-21), 28.9 (C-28), 28.6 (C-30), 28.3 (C-23), 27.4 (C-2), 26.5 (C-16), 26.3 (C-15), 23.5 (C-27), 18.8 (C-26), 17.6 (C-6), 16.7 (C-25), 16.5 (C-24)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[25-26],故鑒定化合物10為甘草次酸。

    3.2 ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6水平

    搜山虎60%乙醇提取物和分離得到化合物的抗炎活性研究如表1所示。結(jié)果表明,在LPS的作用下,RAW264.7細(xì)胞釋放的TNF-α和IL-6明顯升高,搜山虎60%乙醇提取物能夠顯著降低上清液中TNF-α和IL-6的含量。另外從藥材中分離得到的化合物2、4~7、10能夠顯著抑制細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6。而化合物1、3、8、9與RAW264.7細(xì)胞孵育后,細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的分泌量與LPS誘導(dǎo)組接近(>0.05),說明這些化合物對(duì)TNF-α和IL-6的分泌沒有抑制作用。

    表1 搜山虎藥材提取物及不同成分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6水平的影響()

    與LPS組比較:*<0.05**<0.01

    *< 0.05**< 0.01LPS group

    3.3 小鼠醋酸扭體致痛實(shí)驗(yàn)

    小鼠醋酸扭體致痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,與對(duì)照組相比,雙虎腫痛寧酊劑能夠顯著降低小鼠扭體次數(shù),抑制率為74.2%。60%乙醇提取的搜山虎亦能減少小鼠的扭體次數(shù),抑制率為36.1%,但小于雙虎腫痛寧酊劑。另外從搜山虎藥材中分離得到的化合物2、4、7能夠顯著降低小鼠扭體次數(shù)。抑制率由高到低排序依次為雙虎腫痛寧酊劑>甲芬那酸(2)>白藜蘆醇(7)>小檗堿(4)>搜山虎60%乙醇提取物?;衔?、3、5、6、8、9對(duì)小鼠醋酸扭體無影響。

    3.4 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

    小鼠熱板法鎮(zhèn)痛反應(yīng)的研究結(jié)果(表3)表明,與對(duì)照組相比,給藥后30、60、90 min雙虎腫痛寧酊劑組、甲芬那酸組和白藜蘆醇組的痛閾值顯著升高(<0.05、0.01)。給藥后60、90 min搜山虎乙醇提取物組的痛閾值顯著升高(<0.05)。給藥后90 min小檗堿組的痛閾值顯著升高(<0.05)。痛閾值抑制率由高到低分別為雙虎腫痛寧酊劑>甲芬那酸(2)>白藜蘆醇(7)>搜山虎60%乙醇提取物>小檗堿(4)?;衔?、3、5、6、8、9對(duì)小鼠熱板鎮(zhèn)痛無作用。

    表2 雙虎腫痛寧酊劑、搜山虎藥材提取物及不同成分對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響()

    與對(duì)照組比較:*<0.05**<0.01,下表同

    *< 0.05**< 0.01control group, same as Table below

    表3 雙虎腫痛寧酊劑、搜山虎藥材提取物及不同成分對(duì)小鼠熱板法鎮(zhèn)痛的影響()

    4 討論

    采用現(xiàn)代色譜技術(shù)手段對(duì)瑤藥材搜山虎進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究,共得到了10個(gè)化合物,包括2個(gè)生物堿類化合物、3個(gè)苯丙素類化合物、1個(gè)黃酮類化合物、1個(gè)皂苷類化合物、1個(gè)氨基酸、1個(gè)多酚類化合物、1個(gè)芳基烷酸類化合物,均為首次從搜山虎中分離得到,也是首次從花椒屬植物中分離得到。

    組織損傷誘發(fā)疼痛和炎癥反應(yīng),二者相互因果,形成炎癥性疼痛[27-28]。炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí),細(xì)胞分泌大量的TNF-α、IL-6等細(xì)胞因襲,這些因子可以延長(zhǎng)炎癥的時(shí)間,增加炎癥的強(qiáng)度,促進(jìn)疼痛級(jí)別的升高[29]。本研究發(fā)現(xiàn)搜山虎醇提物能夠有效的降低TNF-α和IL-6的分泌,說明該搜山虎能夠通過抑制炎癥因子的分泌來產(chǎn)生抗炎作用。另外從藥材中分離得到的化合物2、4~7、10能夠顯著抑制細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6,說明這些化合物可能為搜山虎抗炎的藥效成分。另外在鎮(zhèn)痛的體內(nèi)研究中,發(fā)現(xiàn)搜山虎藥材醇提物和雙虎腫痛寧酊的鎮(zhèn)痛作用非常明顯,而分離得到的化合物2、4、7具有一定的鎮(zhèn)痛作用,表明搜山虎入藥鎮(zhèn)痛作用存在多組分整體協(xié)同效果。本研究結(jié)果為闡明白搜山虎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了依據(jù),在保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性、有效性和安全性方面具有重要意義。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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    Study on chemical constituents fromet

    WANG Gang1, 2, 3, ZOU Zhun1, ZHOU Yan-lin1, LIUQu-shan1, QIN Liu-xin3, ZHOU Ze-yang3, WANG Xiao-yan3, CHEN Xiao-shuang3, ZOU Jie-ming1, FENG Jian-fang2, 3

    1. Guilin San jin Pharmaceutical Company Limited, Guilin 541004, China 2. Jiang xi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. Guang xi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China

    Identificationthe chemical constituents ofetis an important work for evaluating the potential pharmacodynamicsubstances and controlling the quality of Shuanghu zhongtong ning tincture.The compounds were isolated by AB-8 macroporous resin, silica gel column chromatography and preparative chromatography. And the structural analysis was performed with NMR and UPLC-Q-TOF and their anti-inflammatory activity and analgesic effects were investigated.Ten compounds were isolated fromHuang and identified as trigonelline (1), mefenamic acid (2), 4-hydroxycinnamic acid (3), berberine (4), hesperidin (5), neochlorogenic acid (6), resveratrol (7), erucic acid (8), proline (9) and glycyrrhetinic acid (10). The anti-inflammatory experiment indicated that compound 2, 4—7, 10 exhibited significant biological activities, which suppressed the release of TNF-α and IL-6. In addition, compound 2, 4, 7 had significant analgesic effects on rats by a reduced writhing and increased the pain threshold.All the compounds were isolated fromfor the first time. Compounds 2, 4 and 7 exhibited significantly anti-inflammatory activity and analgesic effects.

    Huang; anti-inflammatory; analgesic; mefenamic acid;berberine; resveratrol

    R284.1

    A

    0253 - 2670(2021)21 - 6466 - 07

    10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.003

    2021-07-09

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(82060641);中國(guó)博士后面上基金資助項(xiàng)目(2019M653814XB);廣西科技基地和人才專項(xiàng)(2018AD19035);廣西自然科學(xué)基金課題(2018JJB140377、2018JJB140325);廣西中青年教師提升項(xiàng)目(2019KY0338);廣西一流學(xué)科建設(shè)開放性課題(2019XK127);廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題(2018MS003)。

    王 剛,男,碩士生導(dǎo)師,副研究員,從事藥物新制劑、新劑型研究與開發(fā)。E-mail: 99329388@qq.com

    鄒節(jié)明,男,博士生導(dǎo)師,教授級(jí)高級(jí)工程師,從事中藥新藥研究。E-mail: zjm@sanjin.com.cn

    奉建芳,男,博士生導(dǎo)師,研究員,從事中藥新型給藥系統(tǒng)研究。E-mail: fengjianfang@vip.163.com

    [責(zé)任編輯 王文倩]

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