以茶皂素為天然乳化劑制備水飛薊素納米乳及其理化性質(zhì)考察

鄧 茂，李小芳，陳慧娟，謝 龍，張旭敏，劉 凱

以茶皂素為天然乳化劑制備水飛薊素納米乳及其理化性質(zhì)考察

鄧 茂，李小芳*，陳慧娟，謝 龍，張旭敏，劉 凱

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

以茶皂素為天然乳化劑制備水飛薊素納米乳（silymarin nanoemulsion，SM-NE）。使用高速剪切聯(lián)合高壓均質(zhì)法制備SM-NE，以平均粒徑、粒度多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）、分層指數(shù)和外觀為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)處方和制備工藝進(jìn)行優(yōu)化；以摩爾增溶比（molar solubilization ratio，MSR）和膠束-水分配系數(shù)（m）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)探究了茶皂素對(duì)水飛薊素的增溶能力；對(duì)最佳處方和工藝制備的SM-NE進(jìn)行了理化性質(zhì)和穩(wěn)定性考察。SM-NE的最佳處方為水飛薊素用量0.15%，茶皂素用量為0.3%，油相用量為5%，最佳制備工藝為剪切速率16 000 r/min，剪切時(shí)間3 min，均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8次；茶皂素對(duì)水飛薊素增溶參數(shù)值MSR和m分別為0.011 1和2.31；制得的SM-NE的平均粒徑為（204.1±2.8）nm，PDI為0.058±0.007，電導(dǎo)率為（117.8±0.9）μs/cm，pH值為7.31±0.10，濁度為（59.75±1.10）cm?1，水飛薊素溶解度為（1.22±0.05）mg/mL；穩(wěn)定性結(jié)果顯示，SM-NE具有良好的離心穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。以茶皂素為天然乳化劑成功制備了穩(wěn)定的SM-NE，茶皂素是一種潛在的用于水飛薊素新型綠色納米制劑生產(chǎn)的天然增溶劑。

納米乳；茶皂素；水飛薊素；理化性質(zhì)；增溶；高速剪切聯(lián)合高壓均質(zhì)法

水飛薊素（silymarin，SM）是從水飛薊(L.) Gaertn.的果實(shí)中提取的一種黃酮木脂素類混合物，其成分包括水飛薊賓（silybin）、異水飛薊賓（isosilybin）、水飛薊寧（silydianin）和水飛薊亭（silychristin）等，且其中水飛薊賓含量最 高[1-2]。因水飛薊素具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)血脂和降血糖等藥理，被廣泛用于各種疾病的治療研究，如肝臟疾病、炎癥性腸病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病以及聯(lián)用降低抗癌藥物副作用等[3-7]。然而，水飛薊素不僅難溶，且口服后快速與腸道或肝臟細(xì)胞結(jié)合，由肝臟迅速排泄到膽汁中，導(dǎo)致其口服生物利用度很低，極大地限制了其臨床應(yīng)用[8]。因此，提高水飛薊素溶解度一直是研究者的關(guān)注點(diǎn)，目前用于水飛薊素增溶的方法有納米混懸劑、納米膠束等[9-10]。

納米乳（nanoemulsion，NE）是在亞微米尺寸范圍內(nèi)的膠體微粒系統(tǒng)，可用作藥物分子的載體，通常它們的大小在10～200 nm。納米乳作為藥物輸送系統(tǒng)可提高藥物溶解度、生物利用度、降低不良反應(yīng)和毒性反應(yīng)，相比其他納米制劑有著更好的物理穩(wěn)定性[11-13]。通常，納米乳是由油相、水相、乳化劑和助乳化劑組成。乳化劑是保證納米乳穩(wěn)定性的決定性因素，而常用的乳化劑主要有合成表面活性劑和天然表面活性劑。研究表明，合成表面活性劑有著慢毒性和不可避免的一系列生物安全性隱患[14-15]。因此，近年來(lái)天然表面活性劑受到廣泛的關(guān)注，也成為了研究熱點(diǎn)。

天然表面活性劑主要包括多糖、蛋白質(zhì)、磷脂和皂苷等，它們具有生物降解性，低毒性環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[16]。茶皂素（tea saponins，TS）是一種從茶籽（茶樹種子）中提取得到的五環(huán)三萜化合物，其結(jié)構(gòu)中具有親水性糖基和疏水性糖苷配基，因此其可作為天然表面活性劑，具有乳化、潤(rùn)濕和分散等作用[17]。茶皂素作為一種天然表面活性劑已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、石油、食品和化妝品方面有著廣泛的研究[18-21]。且已有研究證明其可作為穩(wěn)定劑制備納米混懸劑用于難溶性藥物的增溶[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)以茶皂素為天然乳化劑制備水飛薊素納米乳（silymarin nanoemulsion，SM-NE），探究其作為天然表面活性劑制備SM-NE從而提高水飛薊素溶解度的可行性，為開發(fā)安全的水飛薊素綠色新劑型奠定了基礎(chǔ)，也為取代合成表面活性劑提供了新的方向。

1 儀器與材料

1.1 儀器

NICOMP 380ZLS型激光粒度測(cè)定儀，美國(guó)PSS粒度儀公司；SJIA-10N-50型冷凍干燥機(jī)，寧波市雙嘉儀器有限公司；UV-6100型紫外分光光度儀，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；C25實(shí)驗(yàn)室分散乳化均質(zhì)機(jī)，上海恒川機(jī)械設(shè)備有限公司；AH100D高壓均質(zhì)機(jī)，加拿大ATS公司；DDS-11C電導(dǎo)率儀，PHs-2F pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JEM 1200EX透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.2 材料

水飛薊賓對(duì)照品，批號(hào)MUST-18101702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.89%，成都曼思特生物科技有限公司；水飛薊素原料藥（批號(hào)GL20200508，質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%）、茶皂素（批號(hào)GL20200429，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%），西安小草植物科技有限責(zé)任公司；油酸、蓖麻油（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；辛癸酸甘油酯（食品級(jí)）棕櫚酸異丙酯（日化級(jí)），山東優(yōu)索化工科技有限公司；中鏈三酰甘油（MCT，食品級(jí)），美國(guó)Now Foods公司；甘露醇、乳糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜級(jí)），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；冰醋酸（色譜級(jí)），成都市科龍化工試劑廠；去離子水是由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 水飛薊素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm；流動(dòng)相為甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（48∶52）；柱溫為40 ℃；體積流量1.0 min/mL；進(jìn)樣量10 μL[9]。理論塔板數(shù)按水飛薊賓色譜峰計(jì)算不低于5000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取水飛薊賓對(duì)照品10.56 mg于50 mL量瓶中，加入適量甲醇后超聲使其溶解，再加甲醇定容至刻度線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為211.2 mg/L的水飛薊賓對(duì)照品溶液[23]。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密稱取一定量的水飛薊素原料藥于50 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，加甲醇定容至刻度線，搖勻，即得供試品溶液1。

精密吸取1 mL SM-NE于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋后超聲15 min，加甲醇至刻度線，搖勻，制成供試品溶液2。

另取空白納米乳，按照供試品溶液2的配制方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液1、供試品溶液2、陰性對(duì)照溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)后，注入高效液相色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示，水飛薊賓雙峰保留時(shí)間分別為8.30、8.90 min，陰性對(duì)照不產(chǎn)生干擾，被測(cè)成分沒(méi)有受到其他組分的影響，且峰形良好。

圖1 水飛薊賓對(duì)照品 (A)、水飛薊素原料藥 (B)、SM-NE樣品 (C) 和空白納米乳 (D) 的HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取配制好的水飛薊賓對(duì)照品溶液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度線，充分搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)后按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以水飛薊賓對(duì)照品的質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積（）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為＝21.328－5.733 6，2＝0.999 9，結(jié)果表明水飛薊賓在2.112～211.200 mg/L具有良好的線性關(guān)系。

2.1.6 水飛薊素原料藥中水飛薊賓的測(cè)定 精密稱取一定量的水飛薊素原料藥于50 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解后，加甲醇定容到刻度線，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)至液相樣品瓶中，制備成供試品溶液1，平行制備3份，按照“2.1.1”項(xiàng)下的HPLC條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明3份水飛薊素原料藥樣品中水飛薊賓的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.84%、17.40%、18.25%，平均值為17.83%。因此，擬定水飛薊素原料藥中水飛薊賓的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是17.83%。

2.2 SM-NE的制備

SM-NE的制備方法為高速剪切-高壓均質(zhì)法[24]。將處方量的油相置于燒杯中，加入精密稱取的處方量的水飛薊素原料藥，超聲使其混勻于油相；將處方量的去離子水置于另一燒杯中，并加入精密稱取處方量的茶皂素，超聲使茶皂素充分溶解，作為水相。將水相倒入油相，邊倒邊攪拌，隨后進(jìn)行高速剪切，制得粗乳液，將粗乳液轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機(jī)在一定壓力下進(jìn)行高壓均質(zhì)數(shù)次，即得SM-NE。

2.3 粒徑和粒度多分散系數(shù)（PDI）的測(cè)定

在室溫下，用去離子水將0.12 mL的納米乳稀釋至25 mL，并通過(guò)粒度分析儀、測(cè)定粒徑和PDI。測(cè)定結(jié)果均為平行測(cè)定3次的平均值。

2.4 SM-NE的處方篩選

2.4.1 分層指數(shù)的計(jì)算 將制備的SM-NE置于相同規(guī)格的密封玻璃瓶中，且在室溫下靜置。定期觀察樣品的分層，絮凝和沉淀現(xiàn)象，并記錄乳液層的高度，從而計(jì)算SM-NE的分層指數(shù)。

分層指數(shù)＝(0－H)/0

0、H分別為0、時(shí)刻乳液層的高度

2.4.2 油相種類的篩選 精密稱取處方量的水飛薊素原料藥，分別加入5%油相（蓖麻油、油酸、棕櫚酸異丙酯、MCT、辛癸酸甘油酯），依照前述“2.2”項(xiàng)下方法制備SM-NE，室溫下靜置30 min后，觀察其外觀，測(cè)定其平均粒徑和PDI；并且以離心2 h后的乳液分層指數(shù)為穩(wěn)定性指標(biāo)，考察了不同種類油相對(duì)乳液平均粒徑、PDI和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果如表1所示，不同油相制備的乳液外觀不一，并且平均粒徑、PDI、分層指數(shù)也不同。蓖麻油和油酸為油相制備所得乳液，粒徑較大且離心分層指數(shù)較大。棕櫚酸異丙酯和辛癸酸甘油酯為油相制備的乳液雖然粒徑比較小，但PDI偏大，且分層指數(shù)相比MCT較大。MCT為油相制備的乳液粒徑和PDI都較小，且離心穩(wěn)定性最佳，因此最終選擇MCT作為SM-NE的油相。

2.4.3 油相用量對(duì)SM-NE的影響 MCT作為油相制備SM-NE，以外觀、平均粒徑和PDI為指標(biāo)，考察MCT不同用量（體積分?jǐn)?shù)，1%、3%、5%、7%、9%）對(duì)乳液的影響，制備方法同“2.2”項(xiàng)。結(jié)果如表2所示，隨著油相用量的增加，乳液粒徑呈逐漸增加的趨勢(shì)，而PDI為先減小后增大。從外觀上來(lái)看，當(dāng)油相用量達(dá)7%及以上時(shí)，乳液表面有油珠漂浮，明顯油相乳化不完全，對(duì)乳液穩(wěn)定性將會(huì)造成不好的影響。因此，綜合對(duì)平均粒徑、PDI和外觀等的考慮，最終選擇油相MCT用量為5%。

表1 油相種類對(duì)SM-NE的影響(, n = 3)

表2 油相用量對(duì)SM-NE的影響(, n = 3)

2.4.4 乳化劑（茶皂素）用量對(duì)SM-NE的影響 精密稱取處方量的水飛薊素原料藥于燒杯中，加入5%的油相MCT，再分別精密稱取不同用量的茶皂素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%），加入處方量去離子水中，按“2.2”項(xiàng)方法制備SM-NE，測(cè)定平均粒徑和PDI，結(jié)果如表3所示。隨著茶皂素用量的增加，粒徑逐漸減小，但可明顯看出，當(dāng)其用量達(dá)到0.4%時(shí)，粒徑減小趨勢(shì)放緩。乳液PDI主要呈先減小后增大趨勢(shì)。因此，出于對(duì)粒徑和PDI以及輔料用量的考慮，選擇茶皂素用量為0.3%。

2.4.5 高速剪切速率的確定 精密稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的水飛薊素原料藥加入5%油相MCT，稱取0.3%茶皂素于一定量去離子水中，在不同的剪切速率（10 000、13 000、16 000、19 000、22 000 r/min）下剪切，按“2.2”項(xiàng)下方法制備SM-NE，測(cè)定其平均粒徑和PDI。結(jié)果如表4所示，當(dāng)剪切速率為16 000 r/min時(shí)，所制備的SM-NE的平均粒徑和PDI都較小，證明體系中的乳滴大小均勻，粒徑分布范圍窄。當(dāng)剪切速率大于16 000 r/min后，SM-NE的平均粒徑和PDI都有少量增加?？赡苁且?yàn)榧羟兴俾蔬^(guò)快造成泡沫太多，影響下一步的均質(zhì)操作。因此，選擇剪切速率為16 000 r/min。

表3 乳化劑用量對(duì)SM-NE平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.4.6 均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)的確定 精密稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的水飛薊素原料藥加入5%油相，稱取0.3%茶皂素于一定量去離子水中，在不同壓力（20、40、60、80、100、120 MPa）下，按“2.2”項(xiàng)下方法制備SM-NE，測(cè)定其平均粒徑和PDI。結(jié)果如表5所示，隨著均質(zhì)壓力的增加，SM-NE的平均粒徑和PDI呈減小的趨勢(shì)，但當(dāng)壓力加到100 MPa時(shí)，SM-NE的平均粒徑和PDI呈平穩(wěn)趨勢(shì)，沒(méi)有繼續(xù)減小。因此，考慮到能耗和儀器損耗，以及均質(zhì)壓力過(guò)大乳液的溫度升高，對(duì)乳液的穩(wěn)定性可能產(chǎn)生不良影響，選擇均質(zhì)壓力為100 MPa。

表4 剪切速率對(duì)SM-NE的影響(, n = 3)

表5 均質(zhì)壓力對(duì)SM-NE的影響(, n = 3)

隨后考察了均值次數(shù)（4、6、8、10、12、14次），結(jié)果SM-NE的粒徑分別為（217.3±3.2）、（205.4±1.4）、（202.5±2.8）、（200.8±2.2）、 （197.6±2.4）、（204.0±1.7）nm，PDI分別為 0.065±0.023、0.074±0.028、0.051±0.023、0.067±0.008、0.079±0.021、0.046±0.004，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，SM-NE的平均粒徑和PDI逐漸減小，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)到8次時(shí)，SM-NE的平均粒徑和PDI已經(jīng)比較小，且繼續(xù)增加均質(zhì)次數(shù)，平均粒徑和PDI沒(méi)有明顯的減小。因此，同樣考慮到能耗和儀器損耗，以及均質(zhì)壓力過(guò)大乳液的溫度升可能造成不良影響，選擇均質(zhì)次數(shù)為8次。

2.4.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)得到的最佳處方和制備工藝條件制備了3批SM-NE，分別測(cè)定其平均粒徑和PDI。結(jié)果見表6，根據(jù)結(jié)果可知，在單因素考察得到的最優(yōu)處方和制備工藝條件下，制備得到的SM-NE平均粒徑和PDI小，即SM-NE中的乳滴粒徑小且分布范圍窄。綜上，單因素考察得到的最佳處方和制備工藝可行，具有良好的重現(xiàn)性。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(, n = 3)

2.5 茶皂素的增溶能力考察

2.5.1 增溶能力評(píng)價(jià) 通常，表示增溶劑增溶能力的參數(shù)主要有摩爾增溶比（molar solubilization ratio，MSR）和膠束-水分配系數(shù)（m）[25]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇這2個(gè)參數(shù)來(lái)探究茶皂素對(duì)水飛薊素的增溶能力。

（1）MSR：MSR是用來(lái)量化增溶劑對(duì)給定增溶物的增溶效果[26]。它可以定義為每物質(zhì)的量添加到溶液中的增溶劑中溶解的被增溶物的量。

MSR＝(S－CMC)/(C－CMC)

C表示增溶劑溶液濃度（mol/L）（C＞CMC），CMC表示增溶劑溶液濃度達(dá)到臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）時(shí)的濃度，S、CMC分別代表增溶劑溶液濃度為C、CMC時(shí)溶質(zhì)的表觀溶解度（mol/L）；以增溶劑溶液濃度（C）對(duì)溶質(zhì)濃度（）作圖，線段斜率即為MSR

（2）m：m是指被增溶物在膠束與水相間有機(jī)物的分配量比值，可表示為m＝m/a，式中m為溶質(zhì)在增溶劑膠束中的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)，a為溶質(zhì)在水相中的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)[27]。m可以計(jì)算為m＝MSR/(1＋MSR)，a可以計(jì)算為a＝CMC·w，w是水的摩爾體積（w＝0.018 05 L/mol），因此，m的計(jì)算公式還可以表示為以下等式。

m＝55.4 MSR/CMC(1＋MSR)

2.5.2 增溶能力考察 分別精密稱量不同量的茶皂素、十二烷基硫酸鈉（SDS）或聚山梨酯-80（T80）分別置于10 mL的西林瓶中（SDS和T80作為對(duì)照組），分別加入5 mL去離子水，使之配成一系列濃度高于CMC的增溶劑溶液，再分別向不同濃度的增溶劑溶液中加入過(guò)量的水飛薊素原料藥，超聲溶解2 h后，置于（25±1）℃恒溫水浴振蕩12 h，達(dá)到溶解平衡后，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，分別精密量取1 mL上清液于10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋到刻度線，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，用HPLC法分析樣品中水飛薊素的含量。每個(gè)濃度平行3組。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，得到不同濃度增溶劑溶液中水飛薊素的最大溶解度，如表7所示。

根據(jù)表7結(jié)果，以平均藥物濃度（mean）為縱坐標(biāo)，增溶劑溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)作圖，所得直線斜率即為增溶劑的MSR。增溶劑的增溶趨勢(shì)圖如圖2所示，根據(jù)MSR計(jì)算得到m，各增溶劑的MSR和m值見表8。根據(jù)結(jié)果可知，對(duì)于水飛薊素的增溶能力，3種增溶劑的MSR：茶皂素＞SDS＞T80，lnm：茶皂素＞SDS＞T80，而3種增溶劑的CMC為T80＞SDS＞茶皂素?？梢姼髟鋈軇〤MC的大小規(guī)律與lnm的大小規(guī)律剛好相反。從圖2可以看出，不同增溶劑對(duì)水飛薊素的增溶量隨著其濃度變化呈不同斜率的線性增加，可見增溶劑的種類對(duì)增溶效果有著顯著的影響。Jyotsna等[25]提出增溶劑之間的增溶能力差異可能歸因于它們的結(jié)構(gòu)，且具有較低CMC值的增溶劑具有較高的增溶能力，本實(shí)驗(yàn)的增溶結(jié)果剛好與這一規(guī)律相符。此外，對(duì)于溶解在增溶劑膠束內(nèi)核中心（由疏水鍵端形成）的被增溶物，其增溶量會(huì)隨著膠束直徑或者聚集數(shù)的增加而增加，所以增溶量會(huì)隨著增溶劑溶液濃度的增加呈線性增加[28]。總的來(lái)說(shuō)，天然增溶劑茶皂素對(duì)水飛薊素的增溶效果比合成增溶劑SDS或T80對(duì)水飛薊素的增溶效果好。

表7 298 K下水飛薊素在不同濃度增溶劑溶液中的最大溶解量(, n = 3)

圖2 在298 K下水飛薊素在不同濃度增溶劑溶液 (茶皂素、SDS、T80)中的溶解趨勢(shì)

表8 在298 K下水飛薊素在不同增溶劑溶液中的MSR和lnKm

2.6 理化性質(zhì)考察

2.6.1 SM-NE的類型鑒別 選用染色法進(jìn)行納米乳的類型鑒別[29]。分別取等量的SM-NE于2支相同規(guī)格的試管中，分別取適量的亞甲基藍(lán)（水溶性染料）和蘇丹紅（油溶性染料）加入試管中，觀察2種染料在納米乳中的擴(kuò)散速度。結(jié)果為亞甲基藍(lán)在SM-NE中的擴(kuò)散速度大于蘇丹紅在SM-NE的擴(kuò)散速度，可見SM-NE為O/W型納米乳。

2.6.2 SM-NE的外觀 通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察了SM-NE的外觀形態(tài)。將適量的SM-NE稀釋后滴在銅網(wǎng)上，在5～6 min后吸去多余的乳液，并加入1%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，5 min后吸去多余的染液，將晾干的銅網(wǎng)置于TEM下觀察并拍照。結(jié)果如圖3所示，可見SM-NE液滴呈圓球狀，大小均勻，形態(tài)良好。

2.6.3 電導(dǎo)率的測(cè)定 按照最佳處方和制備工藝平行制備3批SM-NE，室溫下靜置2 h后測(cè)定其電導(dǎo)率。測(cè)得SM-NE的電導(dǎo)率平均值分別為（117.4±1.2）、（118.4±0.9）、（118.7±1.3）μs/cm（＝3）。

2.6.4 pH值的測(cè)定 按照最佳處方和制備工藝平行制備3批SM-NE，室溫下靜置2 h后測(cè)定其pH值。測(cè)得SM-NE的pH平均值分別為7.27±0.30、7.41±0.10、7.25±0.20（＝3）。

2.6.5 濁度的測(cè)定 按最佳處方和制備工藝制備SM-NE，用去離子水將SM-NE稀釋1000倍，室溫下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在680 nm處的透過(guò)率，根據(jù)公式計(jì)算濁度[30]。所有測(cè)量重復(fù)3次。

圖3 SM-NE的TEM圖

＝/?ln(0/)＝/?ln(1/)

表示濁度，表示光程長(zhǎng)度，表示稀釋倍數(shù)，0表示光透過(guò)參比測(cè)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度，表示光透過(guò)被測(cè)樣品后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度，代表透光率

根據(jù)以上公式計(jì)算得到SM-NE的濁度平均值為（59.75±1.10）cm?1（＝3）。

2.6.6 SM-NE中水飛薊素溶解度測(cè)定 按最佳處方和制備工藝平行制備3份SM-NE，用HPLC法測(cè)定SM-NE中水飛薊素的質(zhì)量濃度，樣品溶液配制方法同“2.1.2”項(xiàng)供試品溶液2。結(jié)果顯示SM-NE中水飛薊素的溶解度為（1.22±0.05）mg/mL，水飛薊素在水中的溶解度為0.038 mg/mL?？梢娝w薊素在SM-NE中的溶解度提高了約30倍，SM-NE達(dá)到了良好的增溶作用。

2.7 離心穩(wěn)定性考察

按照最佳處方和制備工藝平行制備3批SM-NE，分別取6 mL于離心管中，在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min，觀察SM-NE的外觀，并測(cè)定離心前后SM-NE的吸光值（），計(jì)算SM-NE的離心穩(wěn)定常數(shù)（，值越大，離心穩(wěn)定性越好），評(píng)價(jià)SM-NE的離心穩(wěn)定性[31]。

＝1/0

0為納米乳離心后的值，1為納米乳離心前的值

SM-NE離心后任呈乳白色，沒(méi)有分層、絮凝、破乳和凝結(jié)等不穩(wěn)定現(xiàn)象。SM-NE離心前的0＝0.321±0.003，離心后的1＝0.306±0.002，＝95.3%。SM-NE的外觀和含量均未收到離心的影響，可見以茶皂素為天然乳化劑制備的SM-NE有著良好的離心穩(wěn)定性。

2.8 儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察

根據(jù)最佳處方和制備工藝，制備6份SM-NE并分別在室溫和4 ℃各放置3份靜置90 d，觀察外觀，并于第0、15、30、60、90 d測(cè)定SM-NE的平均粒徑和PDI，每份樣品平行測(cè)定3次取平均值。儲(chǔ)存穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示。在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中，常溫和4 ℃下儲(chǔ)存的SM-NE均沒(méi)有出現(xiàn)分層、聚結(jié)和破乳等不穩(wěn)定現(xiàn)象。在常溫和4 ℃下，SM-NE的粒徑有少量增長(zhǎng)（≤20 nm）。SM-NE的PDI在常溫下有一定增大，但在4 ℃下沒(méi)有明顯增大?？梢姡圆柙硭貫槿榛瘎┲苽涞腟M-NE在常溫和4 ℃下穩(wěn)定性良好，證明茶皂素作為天然乳化劑可以用于制備儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好的SM-NE。

表9 SM-NE的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 (n = 3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用高速剪切聯(lián)合高壓均質(zhì)這一高能乳化法制備SM-NE，并且成功制備了粒徑小、粒徑分布均勻且質(zhì)地均勻的SM-NE，同時(shí)也避免了低能乳化法存在的有機(jī)溶劑殘留和輔料量大等問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)探究了茶皂素作為天然增溶劑制備SM-NE的可能性，并對(duì)所制備的SM-NE進(jìn)行了理化性質(zhì)和穩(wěn)定性考察。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以茶皂素為乳化劑成功制備了SM-NE，通過(guò)單因素考察得到了SM-NE的最佳處方（水飛薊素用量0.15%，茶皂素用量0.3%，油相用量5%）和最佳制備工藝（剪切速率16 000 r/min，剪切時(shí)間3 min，均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8次），這一結(jié)果為本課題組進(jìn)一步使用效應(yīng)面法優(yōu)化處方和制備工藝奠定了基礎(chǔ)。增溶能力考察結(jié)果顯示，茶皂素對(duì)水飛薊素有著良好的增溶效果，可以替代合成增溶劑用于SM-NE的制備，而含量測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論（水飛薊素在SM-NE中的溶解度約是其在水中溶解度的30倍）。穩(wěn)定性結(jié)果顯示茶皂素穩(wěn)定的SM-NE有著良好的離心穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可見茶皂素可用于穩(wěn)定性要求高的載藥納米乳制備。

總的來(lái)說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了茶皂素作為天然乳化劑制備水飛薊素新型綠色納米制劑的可行性，這為新型綠色納米制劑的發(fā)展提供了新的選擇和方向。研究表明雖然茶皂素對(duì)皮膚和眼部有輕微的刺激作用，但對(duì)腸胃有保護(hù)作用且無(wú)明顯毒性作用[32-33]。此外，茶皂素已被證明是安全、環(huán)保及來(lái)源廣泛易得的[34]。綜上，茶皂素作為增溶劑替代合成增溶劑用于口服納米乳制劑的生產(chǎn)是可行的，但對(duì)于茶皂素進(jìn)一步的體內(nèi)外生物相容性、體內(nèi)安全性等的研究是必要的。本課題組將對(duì)茶皂素穩(wěn)定的SM-NE的藥理活性和安全性進(jìn)行研究，以期為以茶皂素為增溶劑的水飛薊素新型綠色制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of silymarin nanoemulsion with tea saponins as natural emulsifiers and investigation of its physicochemical property

DENG Mao, LI Xiao-fang, CHEN Hui-juan, XIE Long, ZHANG Xu-min, LIU Kai

Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Key Laboratory of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province, Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology, College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

The tea saponins (TS) were used as a natural emulsifier to prepare silymarin nanoemulsion (SM-NE).The SM-NE was prepared by high-speed shear combined with high-pressure homogenization. The particle size, polydispersity index (PDI), delamination index and appearance were the main evaluation indicators. The optimal prescription and process parameters were screened out by single factor test; Molar solubilization ratio (MSR) and micelle-water partition coefficient (m) were used as evaluation indexes to explore the solubilization ability of TS to silymarin. The physicochemical property and stability of the SM-NE prepared by the optimal prescription and process parameters were studied.The best prescription of SM-NE was 0.15% of silymarin, 0.3% of TS, and 5% of oil phase. The shear rate and time were 16 000 r/min and 3 min, the homogenization pressure and times were 100 MPa and 8. The solubilization parameters MSR and Km of TS to silymarin were 0.0111 and 2.31 respectively. The mean particle size of the prepared SM-NE was (204.1 ± 2.8) nm, PDI was 0.058 ± 0.007, conductivity was (117.8 ± 0.9) μs/cm, pH was 7.31 ± 0.10, turbidity was (59.75 ± 1.10) cm?1, and solubility of silymarin was (1.22 ± 0.05) mg/mL. The stability results showed SM-NE had good centrifugal stability and storage stability.Using TS as the natural emulsifier, the stable SM-NE was successfully prepared. TS is a potential natural solubilizer for the production of n new green nano-pharmaceutics of silymarin.

nanoemulsion; tea saponins; silymarin; physicochemical property; solubilization; high-speed shear combined with high- pressure homogenization

R283.6

A

0253 - 2670(2021)21 - 6528 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.010

2021-05-26

四川省科技廳項(xiàng)目（2019YFS0113）；四川省科技廳項(xiàng)目（2020095）

鄧 茂，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型、新技術(shù)。Tel: 15723436257 E-mail: DengmaoL@stu.cdutcm.edu.cn

李小芳，女，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型、新技術(shù)。Tel: 13808195110 E-mail: lixiaofang@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]