基于GC-IMS氣味檢測辨識側(cè)柏葉炒炭程度研究

石典花，戴衍朋，盧 琪，孫立立，張學(xué)蘭，張 軍*

基于GC-IMS氣味檢測辨識側(cè)柏葉炒炭程度研究

石典花1, 2，戴衍朋1，盧 琪1，孫立立1，張學(xué)蘭2*，張 軍1*

1. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

從氣味變化角度對側(cè)柏葉炒炭程度進(jìn)行辨識。采用氣相色譜-離子遷移譜法（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）對側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭的氣味進(jìn)行檢測，采用直觀、聚類、指紋圖譜法對其進(jìn)行比較和定性分析。通過氣味分析可明顯區(qū)分開側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭，5-甲基糠醛、2-庚醇和2-乙酰呋喃可作為側(cè)柏葉炒適中炭的標(biāo)志物。側(cè)柏葉炒炭后氣味發(fā)生了明顯的變化，且與炮制程度相關(guān)，研究結(jié)果可為辨識炭藥炮制程度研究提供了一定的思路。

側(cè)柏葉；炒炭；側(cè)柏炭；氣相色譜-離子遷移譜；氣味；指紋圖譜；5-甲基糠醛；2-庚醇；2-乙酰呋喃；炭藥；炮制

側(cè)柏葉為柏科側(cè)柏屬植物側(cè)柏(L.) Franco的枝梢及葉[1]，是歷代臨床常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。側(cè)柏葉炮制始于宋代，炮制方法主要有炒黃、炒炭等[2]。金元時期出現(xiàn)煮法，燒灰存性的方法進(jìn)一步延伸，清代在總結(jié)前人基礎(chǔ)上，逐漸形成了成熟的炒炭方法并流傳至今。

側(cè)柏葉主要含黃酮類、揮發(fā)油及鞣質(zhì)類等成分，主用于清熱涼血、止咳祛痰、治療血熱妄行的出血證，炒炭后其寒涼之性減弱，偏重于收澀止血，主用于治療熱邪不盛的出血證[3-4]。課題組通過前期市場調(diào)研及收集側(cè)柏炭，發(fā)現(xiàn)目前市售炒炭飲片質(zhì)量多不合格，炒炭程度大部分較《中國藥典》2020年版規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要重[5]，這可能與現(xiàn)行藥典收載炭藥標(biāo)準(zhǔn)相對不完善有關(guān)[6]。因此亟需對中藥炭藥類質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升研究。

前期本課題組對側(cè)柏炭內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提升研究[7]，對不同炮制程度側(cè)柏炭外觀色澤進(jìn)行了數(shù)據(jù)化處理和標(biāo)準(zhǔn)研究[8]，實際上側(cè)柏葉炒炭后不僅外觀色澤發(fā)生了較明顯的變化，相應(yīng)的其氣味亦發(fā)生了較明顯變化，最突出的是側(cè)柏葉原有清香氣炒炭后消失了，新產(chǎn)生了焦香氣，因此，可將氣味的變化用于炮制品質(zhì)量的控制，由此嘗試建立一種采用氣味識別的方法進(jìn)行側(cè)柏炭炮制火候和質(zhì)量的鑒定。

氣相-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是近年來新興的檢測方法，其原理是揮發(fā)性有機(jī)物經(jīng)色譜柱預(yù)分離后，由載氣（氮氣或空氣）帶入電離反應(yīng)區(qū)，載氣分子和樣品分子在離子源的作用下發(fā)生一系列電離和離子-分子反應(yīng)，使樣品分子帶上電荷形成分子離子。在電場驅(qū)使下，這些離子通過周期性開啟的離子門進(jìn)入漂移區(qū)。在與逆流的中性漂移氣體分子不斷碰撞過程中，由于這些離子在電場中各自遷移速率不同，使得不同的離子得到分離，從而達(dá)到分離和檢測的目的。該技術(shù)在中藥氣味檢測方面應(yīng)用廣泛，包括中藥品種鑒別[9-10]、生長期識別[11-12]、干燥程度[13]、炮制加工前后比較分析[14-16]、儲存期[17-18]研究等。本研究將GC-IMS用于側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭的氣味檢測，將傳統(tǒng)氣味鑒別經(jīng)驗客觀數(shù)據(jù)化，以期找出側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭間的氣味差異物質(zhì)，并將其作為有效判別側(cè)柏炭炮制程度和控制其質(zhì)量的新標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果可為建立側(cè)柏炭新的質(zhì)控方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FlavourSpec?氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；RH-800型榮浩全能粉碎機(jī)，永康市榮浩工貿(mào)有限公司。

1.2 試藥

5批側(cè)柏葉采自濟(jì)南燕子山等地，見表1，陰干過元胡篩，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定，為柏科植物側(cè)柏(L.) Franco的干燥枝梢和葉。5批炒適中側(cè)柏炭為上述側(cè)柏葉，按照確定的最佳炒炭工藝炒制[4]；5批炒輕側(cè)柏炭和5批炒重側(cè)柏炭為上述側(cè)柏葉按照炒輕炭和炒重炭制備工藝制備[4]。

表1 側(cè)柏葉及側(cè)柏炭來源

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

色譜柱為FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm）；根據(jù)前期測定中藥常規(guī)經(jīng)驗參數(shù)及優(yōu)選確定系統(tǒng)條件為柱溫40 ℃；載氣N2；離子遷移探測器溫度45 ℃；分析時間35 min。進(jìn)樣體積200 μL；孵育時間20 min；孵育溫度80 ℃；進(jìn)樣針溫度85 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。E1漂移氣體積流量150 mL/min；E2氣相載氣體積流量：0～2 min，2 mL/min；2～30 min，150 mL/min。

2.2 分析軟件

儀器配套分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和3款插件以及GC×IMS Library Search，可分別從不同角度分析樣品。見表2。

2.3 樣品測定

精密稱取側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭各1 g，直接置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，80 ℃孵育20 min后進(jìn)樣；每種樣品平行2份，分別以a、b表示。側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭氣相離子流圖見圖1。

2.4 檢測結(jié)果分析

2.4.1 直觀分析 采用Reporter插件直接對比側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭揮發(fā)性有機(jī)物，結(jié)果見圖2，其中縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時間，橫坐標(biāo)代表離子遷移時間。整個圖背景為藍(lán)色，橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為RIP峰（反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理）。RIP峰兩側(cè)的每1個點代表1種揮發(fā)性有機(jī)物。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。由圖2可見，側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭揮發(fā)性有機(jī)物差異較明顯。為更加明顯比較不同樣品的差異，選取生品譜圖作為參比，其他樣品譜圖扣減參比。如二者揮發(fā)性有機(jī)物一致，則扣減后為白色，紅色則代表該物質(zhì)濃度高于參比，藍(lán)色代表該物質(zhì)濃度低于參比。結(jié)果見圖3，與生品相比，不同炒制程度側(cè)柏炭揮發(fā)性有機(jī)物差異很明顯。

表2 分析軟件、插件及作用

圖1 側(cè)柏葉(PC5a)及不同炒制程度側(cè)柏炭(PCCq5a、PCCs5a、PCCz5a)的GC-IMS圖

2.4.2 聚類分析 選取所有峰進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果見圖4。其中綠色點代表側(cè)柏葉，紅色點為炒輕炭，藍(lán)色點為炒適中炭，黃色點為炒重炭，可以看出，生品、炒輕炭可非常明顯的與炒適中炭、炒重炭區(qū)分開；同時可看出炒適中炭和炒重炭之間存在的差異要比與生品和炒輕炭之間的差異小。

2.4.3 指紋圖譜分析 因揮發(fā)性有機(jī)物峰太多，難以找到差異和規(guī)律，故框選揮發(fā)性有機(jī)物峰形成指紋圖譜進(jìn)行對比（Gallery Plot插件）。結(jié)果見圖5。其中圖中每行代表1個側(cè)柏葉或側(cè)柏炭中選取的全部信號峰，每列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在側(cè)柏葉和不同炮制程度側(cè)柏炭中的信號峰，從圖中可以看出側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭的完整揮發(fā)物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異。

圖2 側(cè)柏葉(PC5a) 及不同炒制程度側(cè)柏炭(PCCq5a、PCCs5a、PCCz5a) 的揮發(fā)性有機(jī)物直接對比圖

圖3 以側(cè)柏葉(PC5a) 作參比扣減的不同炒制程度側(cè)柏炭(PCCq5a、PCCs5a、PCCz5a) 差異圖

由圖5可見，紅框中物質(zhì)為側(cè)柏葉中含量較高；綠色框中物質(zhì)是炒輕側(cè)柏炭中含量較高；黃框中物質(zhì)為炒適中炭中含量較高；棕色框中物質(zhì)為炒重炭中含量較高。使用NIST保留指數(shù)與離子遷移譜漂移時間對揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行二維定性，匹配NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定，結(jié)果見表3，其中序號與指紋譜圖中峰編號一一對應(yīng)，因離子遷移譜的特點，對萜烯類物質(zhì)的檢測方面因遷移時間不一出現(xiàn)單體、二聚體及多聚體現(xiàn)象，因此表中多次出現(xiàn)同一化合物，經(jīng)篩選側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭中共辨識出36種揮發(fā)性化合物。紅色框（生品）、綠色框（炒輕炭）、黃色框（炒適中炭）及棕色框（炒重炭）中化合物編號見表4。

圖5 側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜對比

表3 側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭中揮發(fā)性有機(jī)物辨識

續(xù)表3

表4 側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭的特征物質(zhì)編號

結(jié)合表3和表4中數(shù)據(jù)，辨識出側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭特征物質(zhì)，其中生品辨識出醋酸乙酯、α-蒎烯、2,3-戊二酮、()-2-己烯-1-醇、環(huán)己酮、丙酸、正丙醇、正己醇、2-己醇、甲基異丁基酮、()-2-庚醛、乙醇等12種特征物質(zhì)，炒輕炭辨識出二甲基二硫、丁酸、2,3-丁二醇、2-甲基丁酸、α-蒎烯、苯乙酮、檸檬烯、戊醛、糠醛等9種特征物質(zhì)，炒適中炭共辨識出5-甲基糠醛、2-庚醇和2-乙酰呋喃3種特征物質(zhì)，而炒重炭僅辨識出苯甲醛1種特征物質(zhì)，這些特征物質(zhì)中僅生品和炒輕炭中有1種物質(zhì)重復(fù)出現(xiàn)了。由此可采用這些特征物質(zhì)作為判別側(cè)柏葉及不同炒制程度的指標(biāo)。

3 小結(jié)與討論

3.1 氣味檢測可有效區(qū)分側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭

使用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀，在無需真空且無需樣品前處理前提下，可快速檢測側(cè)柏葉及不同炒制程度側(cè)柏炭的揮發(fā)性有機(jī)物，操作相對方便快捷。從檢測結(jié)果看，側(cè)柏葉，炒輕炭，炒適中炭和炒重炭中揮發(fā)性成分區(qū)分較為明顯，其中，側(cè)柏葉、炒輕炭可以非常明顯的與炒適中和炒重炭區(qū)分開；同時還可以看出炒適中炭和炒重炭之間的差異要比與側(cè)柏葉生品，炒輕炭的差異小一些。究其原因認(rèn)為側(cè)柏葉中含有揮發(fā)性成分較多，炒輕炭為其加熱炮制的初級階段，因此側(cè)柏葉生品和炒輕炭中揮發(fā)性物質(zhì)存在一定關(guān)聯(lián)性，這一點在后續(xù)特征物質(zhì)辨識中亦有所表現(xiàn)，兩者中均辨識出α-蒎烯。而炒適中炭和炒重炭后其所含揮發(fā)性成分發(fā)生了較明顯變化，出現(xiàn)了炭藥特有的焦香氣味，因此炒適中炭和炒重炭間差異較小。

3.2 氣味檢測在飲片炮制及質(zhì)量控制方面的探討

本研究采用GC-IMS聯(lián)用的方式，試圖尋找一種控制中藥飲片炮制程度的新思路。通過對側(cè)柏葉和不同炒制程度側(cè)柏炭揮發(fā)性有機(jī)物的檢測發(fā)現(xiàn)，炒適中炭時明顯出現(xiàn)了9種化合物，但鑒于目前數(shù)據(jù)庫不健全，僅辨識出3種：5-甲基糠醛、2-庚醇和2-乙酰呋喃，從檢測定量數(shù)值來看，5-甲基糠醛和2-庚醇在炒適中炭中含量相對更高，因此當(dāng)采用氣味檢測時，明顯出現(xiàn)上述2種物質(zhì)時，可判為炒適中炭，因此采用該方法可有效判斷側(cè)柏炭的質(zhì)量。

GC-IMS是將GC和IMS兩者結(jié)合的檢測技術(shù)，該技術(shù)克服了IMS技術(shù)分離度差的局限性，并使GC分離后得到的化學(xué)信息更豐富。與電子鼻、GC嗅聞分析、GC-MS等常用揮發(fā)性成分檢測技術(shù)相比，GC-IMS具有更加快速、更加靈敏、無需前處理、運行成本低等優(yōu)點[19]。已有文獻(xiàn)報道，GC-IMS技術(shù)可用于食品和茶葉加工過程的氣味檢測和質(zhì)量控制[20-21]?；诖?，認(rèn)為下一步可通過與儀器生產(chǎn)廠家的對接，將該氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀與炮制設(shè)備相關(guān)聯(lián)，因每一種飲片炮制前后其氣味必然發(fā)生明顯的變化，該變化與其揮發(fā)性物質(zhì)變化相關(guān)，當(dāng)炮制至最佳程度時出現(xiàn)的物質(zhì)可以作為判斷炮制程度的標(biāo)準(zhǔn)。因此，在目前由于炮制過程起煙，大部分飲片色澤不一（表皮和斷面）導(dǎo)致沒法有效實現(xiàn)實時外觀監(jiān)測的情況下，采用實時氣味檢測的方式可能成為有效控制飲片炮制程度，保障其質(zhì)量穩(wěn)定的有力措施。由此認(rèn)為GC-IMS法一方面可用于飲片炮制程度的檢測來鑒別其質(zhì)量優(yōu)劣，另一方面可用于炮制過程的程度把控，而要實現(xiàn)這兩方面的應(yīng)用還須進(jìn)一步增加檢測樣本及建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Primary study on identification of carbonizing degree ofbased on odor detection by GC-IMS

SHI Dian-hua1, 2, DAI Yan-peng1, LU Qi1, SUN Li-li1, ZHANG Xue-lan2, ZHANG Jun1

1. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

Toidentify the carbonizing degree of(PC) from the perspective of odor changes.The odor of PC and(PCC)of different carbonizing degree were detected by gas chromatography-ion mobility spectrometry (GC-IMS), which is compared and qualitatively analyzed by intuitive, clustering and fingerprinting methods.It was clearly to distinguish PC and PCCof different carbonizing degree by odor analysis. 5-Methylfurfural, 2-heptanol and 2-acetylfuran can be used as markers of moderate PCC.The odor of PC changed significantly after being carbonized and it is related to processing degree. The research results can provide a certain idea for the research on identifying the processing degree of charcoal medicine.

; carbonize;; GC-IMS; odor; fingerprint; 5-methylfurfural; 2-heptanol; 2-acetylfuran; charcoal medicine; processing

R283.1

A

0253 - 2670(2021)21 - 6510 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.008

2021-05-25

山東省中醫(yī)藥高層次人才培育項目（2021）；全國中藥特色技術(shù)傳承人才培訓(xùn)項目（2019）；科技基礎(chǔ)性工作專項分項目（2014FY111100）；齊魯醫(yī)派中醫(yī)學(xué)術(shù)流派傳承項目（中藥蜜制與制炭特色技術(shù)，齊魯?shù)赖厮幉呐谥拼嫘蕴厣夹g(shù)）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃（2015-173）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃（2017-130）；山東省職業(yè)教育技藝技能傳承創(chuàng)新平臺建設(shè)計劃

石典花，副研究員。Tel: (0531)82949800 E-mail: shidianhua81@163.com

張學(xué)蘭（1963—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥飲片制備技術(shù)及質(zhì)量控制研究。Tel: (0531)89628081 E-mail: zhang8832440@sina.com

張 軍（1979—），男，副研究員，從事中藥炮制研究。Tel: (0531)82949850 E-mail: 962370075@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]