大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒的制備與表征

郭玲，張永萍，徐劍

(貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

0 引言

大黃酸是一種單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物，為我國傳統(tǒng)中藥大黃、何首烏等的主要有效活性成分之一[1]，具有抗炎、抗癌、降糖調(diào)脂、抗氧化及調(diào)節(jié)腎功能等藥理活性[1]。但大黃酸為不溶于水，脂難溶性藥物[2]，生物利用度低，極大限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

磷脂復合物是磷脂分子和藥物分子之間以一定配比關(guān)系通過電荷遷移形成的穩(wěn)定復合物，可改善藥物的溶解性能，明顯增加藥物的體內(nèi)吸收，改善藥物的生物有效性[3]。但藥物制備成磷脂復合物后存在黏性大、疏水性強、分散性差等問題[4,5]，限制了制劑學的進一步研究。近年來，越來越多的研究通過將納米制劑技術(shù)與磷脂復合物技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，以克服磷脂復合物的以上缺陷[6]。人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)為納米遞送系統(tǒng)的常用天然藥物載體[7]，具有安全無毒、無免疫原性、組織相容性好等優(yōu)點。本實驗利用大黃酸和磷脂在一定的條件下制備大黃酸磷脂復合物，以HSA為載體采用一種基于二硫鍵形成的新型制備技術(shù)制備大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒，以期為大黃酸新制劑的研發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)； Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析儀(英國Malvern公司)；H-600透射電鏡(日本 Hitachi公司)；SB-4200D型超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝超聲設(shè)備有限公司)。

1.2 藥品與試劑

大黃酸(成都普菲德生物科技有限公司)；人血清白蛋白(四川遠大蜀陽藥業(yè)有限公司)；蛋黃卵磷脂E80、大豆卵磷脂S100(德國Lipoid公司)；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒的制備

取處方量的大黃酸、卵磷脂置圓底燒瓶中，加入適量丙酮，于40℃水浴中攪拌1h，得黃色澄清溶液，旋蒸除去丙酮即得大黃酸磷脂復合物，用二氯甲烷溶解得油相；取處方量的HSA加入純水溶解，得水相；將油、水兩相混合，采用超聲波細胞粉碎儀在冰浴條件下超聲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑，即得大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒溶液。

2.2 處方及制備工藝的優(yōu)化

通過單因素考察法對磷脂種類、主藥/磷脂比例、HSA用量以及超聲時間進行篩查，以確定最優(yōu)處方工藝。由表1可知：與蛋黃卵磷脂E80相比，選用大豆磷脂S100時，制得的納米粒粒徑較小，較均一，因此最終選定的磷脂為大豆磷脂S100；納米粒粒徑在一定范圍內(nèi)隨著大黃酸與S100比例的增加而減小，但S100過多粒徑反而增大，主藥/S100比例在1∶5-1∶10之間均能制備出粒徑和PDI較好的納米粒，最終選擇主藥/S100比例為1∶5。2%的HSA溶液可以制備出粒徑和PDI較好的納米粒，最終選擇HSA溶液濃度為2%；當超聲功率為490 W，納米粒的粒徑隨著超聲時間的延長而減小，超聲8min能制備出粒徑和PDI較好的納米粒，故選擇490W超聲8min。

表1 單因素試驗的考察結(jié)果

2.3 最優(yōu)處方及工藝的確定

取大黃酸12mg、大豆卵磷脂S100 60mg，加入丙35mL酮于40℃水浴中攪拌1h，得黃色澄清溶液，旋蒸除去丙酮即得大黃酸磷脂復合物，加入2mL二氯甲烷溶解，得油相；取20%HSA 1mL，加入9mL純水溶解，得水相；將油相和水相混合，在冰浴條件，超聲功率490W下超聲8min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑，即得大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒溶液。

2.4 納米粒的粒徑、Zeta電位測定

取適量經(jīng)水稀釋的大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒裝入激光粒度儀的樣品池中，測定其粒徑及Zeta電位。納米粒的粒徑為(156.4±9.8)nm，PDI為(0.180±0.015)，Zeta電位為(-13.8±0.97)mV。如圖1所示，納米粒的粒徑和電位分布圖均呈現(xiàn)較窄的單峰，說明納米粒的粒徑和電位分布較均勻。

圖1 大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒的粒徑和Zeta電位圖

2.5 納米粒的形態(tài)學觀察

將納米粒溶液滴在銅網(wǎng)上，采用2%磷鎢酸鈉液負染后在透射電鏡下觀察其形態(tài)。如圖2所示，納米粒呈類球形，粒子之間未見粘連和聚集。

圖2 大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒的透射電鏡照片

2.6 納米粒的包封率和載藥量測定

2.6.1 測定方法的建立

參考文獻建立的HPLC法[8]測定大黃酸的含量，將不同濃度的大黃酸標準溶液進樣記錄峰面積。以峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程為：A=76.419C-14.997(R2=0.9995)，線性范圍為：0.6～38.4g/mL。

2.6.2 包封率和載藥量的測定

取0.2mL新鮮制備的納米粒溶液，過G50葡聚糖凝膠柱分離納米粒和游離大黃酸，分離出的納米粒用甲醇超聲破乳，離心取上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用“2.6.1”項下已經(jīng)建立的HPLC法測定納米粒中的藥物含量(We)。另外再取未過凝膠柱的樣品0.2mL，直接加入甲醇破乳，離心取上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，同法測定體系中藥物總含量(Wt)，計算包封率(We/Wt×100%)[9]。另取等量樣品，凍干后稱量白蛋白納米粒干粉的總質(zhì)量(Wd)，計算載藥量(We/ Wd×100%)[10]。計算得大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒的包封率為(90.38±1.78)%，載藥量為(4.14±0.16)%。

3 討論

大黃酸藥理活性顯著而廣泛，但其臨床應(yīng)用受其理化性質(zhì)限制。本研究結(jié)合磷脂復合物技術(shù)和納米技術(shù)，成功制備了大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒，有望改善大黃酸水溶性和脂溶性差的問題。本研究采用一種獨特的基于二硫鍵形成的納米技術(shù)——蛋白結(jié)合技術(shù)制備白蛋白納米粒[11]，該技術(shù)中，HSA既為載體材料又作穩(wěn)定劑，通過高剪切力(超聲、高壓均質(zhì)等方法)產(chǎn)生局部高熱以及氣穴空化效應(yīng)使HSA分子中原有的巰基在水不溶性藥物液滴周圍交聯(lián)形成新的二硫鍵[12]，進而將HSA交聯(lián)在一起形成納米粒。與傳統(tǒng)的白蛋白納米粒制備技術(shù)相比，本技術(shù)無需加入常規(guī)表面活性劑或化學交聯(lián)劑，可保留白蛋白的全部生物學特性，同時避免了醛類交聯(lián)劑殘留以及可能造成的不良反應(yīng)等問題。蛋白結(jié)合技術(shù)適用于難溶性藥物的包載[11]，這就要求藥物在與水不相溶的溶劑中有較高溶解度，因此本實驗先將大黃酸制備成磷脂復合物以改善其溶解性能，進而提高大黃酸在納米粒中的包封效率。本研究可為大黃酸新劑型打下基礎(chǔ)，下一階段，筆者將對大黃酸磷脂復合物白蛋白納米粒的體內(nèi)生物學性質(zhì)進行研究，為大黃酸新劑型的研發(fā)提供更為完整的實驗數(shù)據(jù)。