牛大力中防曬成分的超聲提取及其穩(wěn)定性

郭飛燕，紀(jì)明慧，陳光英，鐘文英

（熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

近年來(lái)，隨著大氣臭氧層的破壞，到達(dá)地面的紫外線強(qiáng)度日益增加，對(duì)全球生態(tài)系統(tǒng)及人類的健康產(chǎn)生不同程度的影響。紫外線按波長(zhǎng)不同又可分為UVC（200～280 nm）、UVB（280～320 nm）、UVA（320～400 nm）3個(gè)區(qū)段，其中短波部分UVC（200～280 nm）由于被大氣臭氧層吸收散射而不能到達(dá)地面，對(duì)人體不造成傷害，真正透過(guò)大氣臭氧層的阻隔而到達(dá)地球表面的紫外線為UVB和UVA 區(qū)段射線。UVB是引起皮膚曬傷出現(xiàn)紅斑的主要因素，而UVA的穿透能力則較強(qiáng)，它能穿透皮膚表層直接到達(dá)真皮層，可引起嚴(yán)重的組織損害，甚至導(dǎo)致皮膚癌[1-5]。因此防紫外線照射，研究防曬劑成為各化妝品企業(yè)的研發(fā)重點(diǎn)。近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多天然植物（成分）具有紫外線吸收作用，如槐米、大黃、檀香、黃芩以及維生素E、維生素A等，都有較好的紫外線吸收性能[4-10]。與有機(jī)合成防曬劑相比，天然防曬原料在紫外線吸收性、防止輻射損傷、提高防曬產(chǎn)品有效性和安全性方面更具有優(yōu)勢(shì)[4，12]。目前尚未發(fā)現(xiàn)利用牛大力提取天然紫外線吸收物質(zhì)的報(bào)道。

牛大力（俗名）是豆科（Leguminosae）崖豆藤屬M(fèi)illettiaWight et Arn.植物美麗崖豆藤M(fèi)illettia SpeciosaChamp.的干燥根，在我國(guó)已有悠久的臨床使用歷史，具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化和清除自由基等功效，目前的研究表明牛大力含有三萜、黃酮、酚類、木脂素等化學(xué)成分[13，15]。這些化合物能吸收紫外線的能量，再以熱能或可見(jiàn)光等形式釋放出來(lái)，減少對(duì)皮膚的損傷[10，16]，因此對(duì)牛大力提取物防曬活性的研究是一項(xiàng)有意義的工作，可為牛大力在化妝品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器

電子天平，TD-214型，丹佛儀器北京有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗儀，XO-5200DTS，南京先歐儀器制造有限公司；集熱式磁力加熱，HH-6型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；真空干燥箱，DZF-6050型，上海恒科有限公司。

1.2 材料與試劑

牛大力采自海南省五指山市，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為豆科蝶形花亞科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(M.Speciosa)的干燥根。

石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇均為分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯仿，分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

1.3 不同溶劑提取牛大力提取液防曬活性成分

精確稱量5份15 mg牛大力粉末于6個(gè)50 mL的圓底燒瓶中，分別加入石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、蒸餾水各25 mL。在溫度為60 ℃，功率為120 W，頻率為25 Hz 的條件下超聲提取回流30 min。提取結(jié)束，抽濾過(guò)濾，收集濾液。參照文獻(xiàn)[17-19]方法，測(cè)定提取液在280～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，計(jì)算其UVB和UVA的平均吸光度值，考察其對(duì)紫外線的吸收能力，尋找最合適的提取溶劑。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別考察料液比、時(shí)間、溫度和功率這四個(gè)因素對(duì)牛大力防曬活性的影響。

1.4.1 料液比對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

精確稱取5、10、15、20、25、30 mg 牛大力粉末于6個(gè)50 mL 圓底燒瓶中，分別加入25 mL 無(wú)水乙醇，在溫度為60 ℃，功率為120 W，頻率為25 Hz條件下超聲提取回流30 min。提取結(jié)束，抽濾過(guò)濾，收集濾液，測(cè)定提取液在波長(zhǎng)為280～320 nm的吸光度，計(jì)算UVB的平均吸光度值，考察其對(duì)紫外線的吸收能力，確定最佳的料液比。

1.4.2 時(shí)間對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

精確稱取20 mg牛大力粉末于6個(gè)50 mL圓底燒瓶中，分別加入25 mL無(wú)水乙醇，在溫度為60 ℃，功率為120 W，頻率為25 Hz條件下，改變超聲提取時(shí)間為30、60、90、120、150、180 min，提取結(jié)束，抽濾過(guò)濾，收集濾液，測(cè)定提取液在波長(zhǎng)為280～320 nm的吸光度，計(jì)算UVB 的平均吸光度值，考察其對(duì)紫外線的吸收能力，確定最佳的提取時(shí)間。

1.4.3 溫度對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

精確稱取20 mg牛大力粉末于6個(gè)50 mL圓底燒瓶中，分別加入25 mL無(wú)水乙醇，在功率為120 W，頻率為25 Hz，超聲回流提取時(shí)間為30 min，改變提取溫度為30、40、50、60、70、80 ℃，提取結(jié)束，抽濾過(guò)濾，收集濾液，測(cè)定提取液在波長(zhǎng)為280～320 nm的吸光度，計(jì)算UVB 的平均吸光度值，考察其對(duì)紫外線的吸收能力，確定最佳的提取溫度。

1.4.4 功率對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

精確稱取20 mg牛大力粉末于7個(gè)50 mL圓底燒瓶中，分別加入25 mL無(wú)水乙醇，在溫度為60 ℃，頻率為25 Hz，超聲回流提取時(shí)間為30 min，改變超聲功率為72、96、120、144、168、192、216 W，提取結(jié)束，抽濾過(guò)濾，收集濾液，測(cè)定提取液在波長(zhǎng)為280～320 nm的吸光度，計(jì)算UVB的平均吸光度值，考察其對(duì)紫外線的吸收能力，確定最佳的提取功率。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出超聲法提取牛大力防曬物質(zhì)的過(guò)程中，料液比（牛大力/溶劑）、提取溫度、提取時(shí)間、提取功率是影響提取物防曬活性的主要因素，設(shè)計(jì)4因素5水平的正交實(shí)驗(yàn)，用正交表L25（45）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，并以UVB（280～320 nm）的平均吸光度值作為考察指標(biāo)以篩選最佳的提取工藝條件，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal experiment

1.6 牛大力提取液防曬活性穩(wěn)定性研究

1.6.1 溫度對(duì)乙醇提取液防曬活性的影響

將1.5節(jié)最佳方法制備的牛大力乙醇提取液分裝入7個(gè)10 mL棕色容量瓶中，取其一作為空白對(duì)照組置于室溫，其余6瓶溶液分別放置在-10、0、10、20、30、40 ℃的保溫裝置中，5 h后取出溶液恢復(fù)至室溫，以乙醇作為空白，測(cè)定提取液在波長(zhǎng)280～320 nm 范圍的吸光度，計(jì)算其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度和UVB 區(qū)的平均吸光度值的保留率[17，19]：保留率=（放置后吸光度/原始吸光度）×100%。

1.6.2 光對(duì)乙醇提取液防曬活性的影響

將1.5節(jié)最佳方法制備的牛大力乙醇提取液分成兩部分，一部分盛于棕色容量瓶中置于避光處，另一部分提取液于無(wú)色透明容量瓶中，放置在白熾燈下，持續(xù)15 d，每隔24 h測(cè)定提取液在波長(zhǎng)280～320 nm范圍的吸光度，計(jì)算其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度和在UVB區(qū)的平均吸光度值的保留率。

1.6.3 放置時(shí)間對(duì)乙醇提取液防曬活性的影響

將1.5節(jié)最佳方法制備的牛大力乙醇提取液裝入無(wú)色透明容量瓶中，在室溫32 ℃的自然環(huán)境下放置15 d，每隔24 h測(cè)定提取液在波長(zhǎng)280～320 nm范圍的吸光度，計(jì)算其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度和在UVB區(qū)的平均吸光度值的保留率。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛大力防曬成分的提取工藝

2.1.1 不同溶劑對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

按1.3節(jié)中的方法對(duì)牛大力樣品進(jìn)行超聲波輔助提取，測(cè)定其在280～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，計(jì)算其UVB和UVA的平均吸光度值，考察其紫外線吸收能力，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 可知，超聲波輔助提取牛大力中防曬成分以無(wú)水乙醇為溶劑效果最佳，其最大吸收波長(zhǎng)λmax=296 nm，提取液對(duì)UVB范圍內(nèi)的紫外線有較強(qiáng)的吸收，平均吸光度值為1.982，對(duì)UVA范圍內(nèi)的紫外線吸收能力下降，平均吸光度值小于0.3。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紫外吸光度在1.5～2之間時(shí)，提取物有高效防護(hù)紫外線照射的能力，而紫外吸光度<0.5 時(shí)，提取物對(duì)紫外線沒(méi)有防護(hù)作用[20]，在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，牛大力石油醚、氯仿、乙酸乙酯、蒸餾水提取物對(duì)UVB和UVA的平均吸光度值均小于0.3，這幾種提取液對(duì)紫外線的吸收能力較弱，故選擇無(wú)水乙醇為最佳的提取溶劑。

表2 溶劑對(duì)提取液防曬活性影響Table 2 The effect of different solvent on the sunscreen activity of extracts

2.1.2 料液比對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

在其他條件不變的情況下，考察料液比5∶25、10∶25、15∶25、20∶25、25∶25、30∶25（mg/mL）時(shí)，牛大力提取物在最大吸收波長(zhǎng)λ=296 nm處和在280～320 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸光度的變化，計(jì)算其UVB的平均吸光度值，考察其紫外線吸收能力，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 料液比對(duì)提取液防曬活性影響Table 3 The effect of solid-liquid ratio on the sunscreen activity of extracts

由表3可知，當(dāng)提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為30 min、超聲功率為120 W、超聲頻率為25 Hz不變的條件下，當(dāng)料液比為5∶25～30∶25（mg/mL）時(shí)，牛大力防曬成分提取率隨著料液比的增大而增加；但當(dāng)料液比大于20∶25 mg/mL時(shí)，防曬成分提取率隨著料液比的增加而趨于平緩。當(dāng)料液比過(guò)小時(shí)，由于牛大力樣品量小，防曬成分含量也相應(yīng)較小，料液比過(guò)大，由于溶劑量小，牛大力樣品濃度過(guò)大，樣品沒(méi)有得到充分的浸提，造成原料的浪費(fèi)，因此，最佳液料比為20∶25（mg/mL）。

2.1.3 時(shí)間對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

在其他條件不變的情況下，考察超聲提取時(shí)間為30、60、90、120、150、180 min 時(shí)，牛大力提取物在最大吸收波長(zhǎng)λmax=296 nm處和在280～320 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸光度的變化，計(jì)算其UVB的平均吸光度值，考察其紫外線吸收能力，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，當(dāng)料液比為20∶25（mg/mL）、提取溫度為60 ℃、超聲功率為120 W、超聲頻率為25 Hz不變的條件下，提取時(shí)間在30～90 min時(shí)，牛大力防曬成分提取量隨著提取時(shí)間的增加而增加；當(dāng)提取時(shí)間大于90 min時(shí)，防曬成分的提取量隨著提取時(shí)間的增加趨于穩(wěn)定。因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，原料中的防曬成分在乙醇的作用被提取出來(lái)，超聲回流提取90 min后，提取液中防曬成分在乙醇中的溶解度基本達(dá)到飽和，再增加提取時(shí)間，提取量也不會(huì)增加，反而會(huì)導(dǎo)至不穩(wěn)定的防曬成分的分解，降低提取液中防曬成分的含量，因此90 min為最佳時(shí)間。

表4 時(shí)間對(duì)提取液防曬活性影響Table 4 The effect of time on the sunscreen activity of extracts

2.1.4 溫度對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

在其它條件不變的情況下，考察提取溫度為30、40、50、60、70、80 ℃時(shí)，牛大力提取物在最大吸收波長(zhǎng)為λmax=296 nm處和在280～320 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸光度的變化，計(jì)算其UVB的平均吸光度值，考察其紫外線吸收能力，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 溫度對(duì)提取液防曬活性影響Table 5 The effect of temperature on the sunscreen activity of extracts

由表5可知，當(dāng)料液比為20∶25（mg/mL）、提取時(shí)間為30 min、超聲功率為120 W、頻率為25 Hz不變的條件下，以乙醇為溶劑對(duì)牛大力防曬物質(zhì)進(jìn)行超聲提取，當(dāng)提取溫度在30～60 ℃時(shí)，牛大力防曬成分提取率隨著提取溫度的升高而增加；當(dāng)提取溫度大于60 ℃時(shí)，防曬成分提取率隨著提取溫度的增加而下降。提取溫度過(guò)低，溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度緩慢，不能很好地滲透到牛大力植物組織里，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)防曬成分不能被充分提?。惶崛囟忍岣?，加快了溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度，提高了防曬物質(zhì)的溶解度，提取率增大，但過(guò)高的溫度，會(huì)使防曬成分分解，使防曬成分的損失增加，同時(shí)能耗也隨之增大，增加了成本的投入。因此，提取溫度為60 ℃時(shí)是最佳選擇。

2.1.5 功率對(duì)牛大力提取液防曬活性的影響

在其它條件不變的情況下，考察超聲功率為72、96、120、144、168、192、216 W時(shí)，牛大力提取物在最大吸收波長(zhǎng)λmax=296nm處和在280～320nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸光度的變化，計(jì)算其UVB的平均吸光度值，考察其紫外線吸收能力，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 功率對(duì)提取液防曬活性影響Table 6 The effect of power on the sunscreen activity of extracts

由表6可知，當(dāng)料液比為20∶25（mg/mL）、提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為30 min、超聲頻率為25 Hz不變的條件下，以乙醇為溶劑對(duì)牛大力防曬物質(zhì)進(jìn)行超聲提取，當(dāng)超聲功率為48～144 W時(shí)，牛大力防曬成分提取率隨著超聲功率增大而增加；當(dāng)超聲功率大于144 W時(shí)，防曬成分提取率隨著超聲功率的增大而降低。功率過(guò)低，提取效率慢，隨著超聲功率的增大，使溶劑快速地滲透到牛大力樣品中，將其中有機(jī)成分盡可能完全地溶于溶劑之中，得到多成分混合提取液，降低了有效防曬成分的含量，影響了牛大力中防曬成分的提取，因此選擇144 W為最佳超聲功率。

2.1.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取功率為考察因素，設(shè)計(jì)4因素5水平的正交實(shí)驗(yàn)，用正交表L25（45）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表7。

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 The results of the orthogonal experiment

從表7可以得出結(jié)論，牛大力提取液的紫外吸光度分別受料液比、提取溫度、提取時(shí)間和功率的影響，根據(jù)極差R值的大小得知這四個(gè)因素影響的大小順序?yàn)榱弦罕?溫度>時(shí)間>功率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：以對(duì)UVB紫外吸光度的平均值為考察指標(biāo)，牛大力提取液最佳提取工藝條件為A4B3C3D3，即提取料液比為20∶25（mg/mL）、提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為90 min、功率為144 W，在此實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行超聲回流提取3次，UVB區(qū)平均吸光度值分別為2.870、2.878 和2.869，在最大吸收波長(zhǎng)λmax= 296nm 處吸光度分別為2.991、2.988、2.986，牛大力提取液UVB區(qū)平均吸光度值達(dá)到最大。

2.2 穩(wěn)定性的研究

2.2.1 放置溫度對(duì)牛大力乙醇提取液防曬活性的影響

測(cè)定在不同溫度下保溫5 h后的牛大力乙醇提取液在UVB范圍的吸光度，計(jì)算其在最大吸收波長(zhǎng)λmax=296 nm 處的吸光度和在UVB 區(qū)的平均吸光度值的保留率[17-19]：保留率=（放置后吸光度/原始吸光度）×100%。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 溫度對(duì)提取液防曬活性的影響Table 8 The effect of temperature on the sunscreen activity of extracts

由表8可知，牛大力乙醇提取液在不同溫度下保溫5 h后，提取液在最大吸波長(zhǎng)λ=296 nm處的吸光度變化不大，在UVB區(qū)平均吸光度值保留率也相對(duì)穩(wěn)定，故在設(shè)定的溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)牛大力乙醇提取液吸收紫外線能力沒(méi)有明顯的影響。

2.2.2 光對(duì)牛大力乙醇提取液防曬活性的影響

測(cè)定在白熾燈、避光下放置15 d的牛大力乙醇提取液在UVB范圍的吸光度，并計(jì)算其在最大吸收波長(zhǎng)λ=296nm處的吸光度和UVB區(qū)的平均吸光度值的保留率，結(jié)果見(jiàn)表9和表10。

表9 白熾燈照射對(duì)提取液防曬活性的影響Table 9 The effect of the incandescent lamp irradiation on the sunscreen activity of the extracts

表10 避光對(duì)提取液防曬活性的影響Table 10 The effect of avoid light on the sunscreen activity of the extracts

由表9可知，牛大力乙醇提取液在白熾燈下放置15 d，提取液在最大吸波長(zhǎng)λmax=296 nm處的吸光度和在UVB區(qū)平均吸光度值保留率呈下降的趨勢(shì)，但仍保持在96%以上，在測(cè)定的時(shí)間內(nèi)白熾燈照射對(duì)牛大力乙醇提取液防曬活性影響不大。

由表10可知，牛大力乙醇提取液在避光下放置15 d，提取液在最大吸波長(zhǎng)λmax=296 nm處的吸光度和在UVB區(qū)平均吸光度值保留率變化不大，在避光條件下，提取液穩(wěn)定性很好。

2.2.3 放置時(shí)間對(duì)牛大力乙醇提取液防曬活性的影響

測(cè)定在自然條件下放置15 d 的牛大力乙醇提取液在UVB 范圍的吸光度，計(jì)算其在最大吸收波長(zhǎng)λ=296 nm處的吸光度和在UVB區(qū)的平均吸光度值的保留率，結(jié)果見(jiàn)表11。

由表11可知，牛大力乙醇提取液在室溫32 ℃的自然環(huán)境下放置15 d，提取液在最大吸波長(zhǎng)λmax=296nm處的吸光度和在UVB區(qū)平均吸光度呈下降趨勢(shì)，但保留率仍在94%以上，牛大力乙醇提取液在自然條件下放置15 d內(nèi)，提取液吸收紫外線的能力沒(méi)有受到很大的影響。

表11 放置時(shí)間對(duì)提取液防曬活性的影響Table11 The effect of the storage time on the sunscreen activity of the extracts

3 結(jié)論

從牛大力中提取防曬成分，分別考察了不同溶劑、料液比、溫度、時(shí)間和超聲功率對(duì)牛大力防曬成分提取效果的影響。結(jié)果表明，無(wú)水乙醇為較好的提取溶劑，當(dāng)料液比為20∶25（mg/mL），溫度為60 ℃，功率為144 W，頻率為25 Hz的條件下，用超聲波輔助法回流提取90 min，牛大力乙醇提取液對(duì)UVB區(qū)紫外線有良好的吸收，對(duì)UVA紫外線吸收能力明顯下降，平均吸光度值小于0.3，牛大力乙醇提取液可作為UVB吸收劑，但對(duì)UVA防護(hù)不夠完全，故牛大力乙醇提取液可以考慮與對(duì)UVA有較好吸收的植物如槐米、黃芩等復(fù)合可提高提取液吸收UVA的能力，達(dá)到廣譜防曬的作用。