達(dá)格列凈對(duì)糖尿病小鼠腎保護(hù)作用及機(jī)制研究

楊秋旻， 李佳蔭， 張 艷， 閆承慧， 仲崇斌

1.東北大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，遼寧 沈陽 110167；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

糖尿病是日益嚴(yán)重的公共健康問題。2019年，全球近5億人患有糖尿病。預(yù)計(jì)至2045年，全球患有糖尿病的數(shù)將增加至7億人。Ⅱ型糖尿病是最常見的糖尿病類型之一，約占全球現(xiàn)患糖尿病總?cè)藬?shù)的90%[1]。慢性低度炎癥是公認(rèn)的Ⅱ型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)鍵特征[2]。達(dá)格列凈(dapagliflozin，DAPA)是一種新型糖尿病治療藥物，是鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑，能夠抑制腎小管S1/S2段SGLT2的表達(dá)，從而增加尿糖，降低血糖[3]。有研究表明，DAPA具有獨(dú)立于血糖控制的心腎保護(hù)作用，但其機(jī)制不清[4-5]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子的關(guān)鍵成分，也是細(xì)胞因子觸發(fā)效應(yīng)的中心介質(zhì)。目前，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族有5位成員：RelA(P65)、RelB、Rel(c-Rel)、P50和P52。除RelB僅能與P52或P50結(jié)合形成異二聚體外，其他NF-κB亞基均可兩兩結(jié)合形成同二聚體或異二聚體，其中，P50和P65形成的異二聚體是最常見的形式之一[6]。NF-κB被多種刺激物激活，其磷酸化在刺激物下游的NF-κB活化中起關(guān)鍵作用，NF-κB亞基的磷酸化可能會(huì)增強(qiáng)或下調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄，或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[7]。本研究利用leptin基因敲除的(db/db)小鼠模型建立早期糖尿病腎損傷模型，給予口服DAPA治療，旨在探討DAPA對(duì)糖尿病腎的保護(hù)作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 選取10只8周齡SPF級(jí)db/db雄性糖尿病小鼠(購自中國南京模式動(dòng)物中心)為研究對(duì)象。12 h明/暗交替規(guī)律照明喂養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度40%～60%。DAPA購自阿斯利康公司。血糖儀及血糖試紙選自美國強(qiáng)生公司。Masson染色試劑盒選自美國SIGMA公司(HT-15-1KT)。PAS染色試劑盒選自北京索萊寶科技有限公司?？贵w購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM組)與DAPA組，每組各5只。DM組連續(xù)口服喂養(yǎng)水12周；DAPA組連續(xù)口服喂養(yǎng)DAPA 12周，期間每周測(cè)量小鼠體質(zhì)量，每2周尾靜脈取血測(cè)量小鼠的空腹血糖。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)取材 12周后處死小鼠，留取血清，取腎組織稱質(zhì)量。一個(gè)腎組織采用多聚甲醛固定，進(jìn)行HE染色、Masson染色、PAS染色，觀察小鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化；另一個(gè)腎組織-80℃保存，用于后續(xù)蛋白免疫印跡法檢測(cè)。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)小鼠腎功能 采用小鼠血清尿素氮試劑盒(南京建成生物公司研究所)檢測(cè)小鼠血清中尿素氮的表達(dá)水平。

1.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 腎組織石蠟切片，脫蠟后，經(jīng)HE染色觀察腎組織形態(tài)，Masson染色觀察腎組織的纖維化水平，PAS染色觀察腎組織腎小球硬化情況。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 腎組織石蠟切片，脫蠟后，于抗原稀釋液(抗原稀釋液:蒸餾水為1∶50)中煮沸40 min，密閉冷卻至室溫后，加1滴或50 μl過氧化酶阻斷液，室溫10 min，PBS洗3次，加1滴或50 μl非免疫動(dòng)物血清室溫10～30 min，除去血清，不清洗切片，加1滴或50 μl一抗(現(xiàn)用現(xiàn)配，一抗∶PBS為1∶100)4℃過夜，復(fù)溫30 min，PBS洗3次，每次3 min，加50 μl二抗室溫1 h，PBS洗3次，每次3 min，加50 μl鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液室溫10 min，PBS洗3次，每次3 min，DAB顯色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)3～10 min，鏡下觀察顏色效果，流水沖洗終止反應(yīng)，HE復(fù)染10 min，水洗，75%乙醇-鹽酸分化30 s，水洗，氨水反藍(lán)1～2 min，水洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.6 AD293細(xì)胞培養(yǎng)及體外模型構(gòu)建 體外應(yīng)用H2O2刺激AD293細(xì)胞，模擬糖尿病小鼠體內(nèi)由氧化應(yīng)激引起的炎癥。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中，靜置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳代至六孔板，在細(xì)胞密度為80%左右加入0.8 μmol/L的DAPA，預(yù)處理細(xì)胞24 h，然后加入H2O20.88 μmol/L處理細(xì)胞8 h，分為正常對(duì)照組(Con組)，H2O2組，H2O2+DAPA 0.4 μmol/L組，H2O2+DAPA 0.8 μmol/L組。

1.7 蛋白免疫印跡法 取腎組織加入RIPA裂解液研磨機(jī)破碎組織，冰上裂解30 min后，4℃、12 000 r/min離心15 min。收集AD293細(xì)胞，加入RIPA裂解液混勻，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度，制備蛋白上樣樣品，組織蛋白于100℃水浴鍋中水煮10 min，細(xì)胞蛋白水煮5 min；經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，根據(jù)所需分子量停止電泳；于轉(zhuǎn)膜液中濕轉(zhuǎn)2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜于5%脫脂牛奶中室溫?fù)u床封閉1 h；將封閉好的PVDF膜置于適當(dāng)稀釋的一抗中，放置于4℃冰箱中孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，將PVCF膜放置于稀釋好的二抗中，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；將PVDF膜放置于ECL發(fā)光液中，然后將膜放入凝膠成像儀中掃描成像并保存圖片。應(yīng)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血糖及體質(zhì)量變化情況比較 12周后，DAPA組小鼠空腹血糖低于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組小鼠體質(zhì)量比較，差異無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 兩組小鼠血糖及體質(zhì)量變化情況比較

2.2 組織染色結(jié)果 與DM組小鼠相比，DAPA組小鼠的腎結(jié)構(gòu)比較完整，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)目有所增加，但未減小腎小球體積大小；DAPA組的腎小球的硬化程度以及腎小球纖維化的現(xiàn)象有所緩解。見圖2。

圖2 小鼠腎染色結(jié)果(a.DM組HE染色，1×；b.DAPA組HE染色，1×；c.DM組PAS染色，40×；d.DAPA組PAS染色，40×；e.DM組HE染色40×；f.DAPA組HE染色，40×；g.DM組Masson染色，40×；h.DAPA組Masson染色，40×)

2.3 兩組小鼠腎功能比較 與DM組比較，DAPA組小鼠血清尿素氮水平降低，腎質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組小鼠腎功能比較

2.4 DAPA對(duì)小鼠腎SGLT2表達(dá)的影響 與DM組比較，DAPA組小鼠腎組織中SGLT2表達(dá)量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、圖5。

圖4 小鼠腎SGLT2免疫組化結(jié)果(a.DM組；b.DAPA組)

圖5 蛋白免疫印跡法

2.5 DAPA對(duì)小鼠腎組織炎癥的影響 與DM組比較，DAPA組小鼠腎組織腎小球內(nèi)CD68表達(dá)降低。見圖6。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，DAPA組小鼠腎組織中P-P65(Ser-468)蛋白表達(dá)低于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖6 小鼠腎CD68免疫組化結(jié)果(a.DM組；b.DAPA組)

圖7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠腎炎癥因子表達(dá)

2.6 DAPA對(duì)H2O2刺激AD293細(xì)胞炎癥反應(yīng)影響 與Con組比較，H2O2組AD293細(xì)胞中SGLT2、P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)蛋白表達(dá)水平明顯升高；與H2O2組比較，H2O2+DAPA 0.4 μmol/L組、H2O2+DAPA 0.8 μmol/L組AD293細(xì)胞中SGLT2、P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)的蛋白表達(dá)明顯降低，且H2O2+DAPA 0.8 μmol/L組低于H2O2+DAPA 0.4 μmol/L組。見圖8。

圖8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)AD293細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

3 討論

《中國Ⅱ型糖尿病防治指南(2020版)》顯示，我國成人的糖尿病患病率上升至11.2%，指南推薦有慢性腎病的Ⅱ型糖尿病患者，無論糖化血紅蛋白是否達(dá)標(biāo)，若無禁忌證，均應(yīng)該在二甲雙胍的基礎(chǔ)上使用SGLT2抑制劑[8]。目前，越來越多的證據(jù)支持炎癥在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中的作用[9]。Rangan等[10]對(duì)NF-κB亞型在慢性炎癥的發(fā)病機(jī)制和慢性腎病相關(guān)細(xì)胞存活中的核心作用進(jìn)行綜述。Terami等[11]研究報(bào)道，DAPA治療可顯著降低巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，以及db/db小鼠腎炎癥及氧化應(yīng)激的表達(dá)。Tang等[12]研究報(bào)道，DAPA可以降低P65和MCP-1，通過改善高血糖引起的組織炎癥和氧化應(yīng)激進(jìn)而緩解糖尿病相關(guān)腎小球硬化和纖維化進(jìn)展。有研究報(bào)道，DAPA的腎保護(hù)作用可能是通過HMGB1-RAGE-NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)[13]。以上研究結(jié)果提示，在糖尿病中，腎組織的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，而該反應(yīng)可能由氧化應(yīng)激導(dǎo)致，DAPA可能通過NF-κB信號(hào)通路影響炎癥反應(yīng)，達(dá)到糖尿病腎保護(hù)作用的效果。

本研究對(duì)DAPA喂養(yǎng)12周后的小鼠腎組織進(jìn)行病理檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAPA組小鼠的腎小球硬化和纖維化水平明顯降低；同時(shí)，DAPA組小鼠的空腹血糖和血清尿素氮與DM組小鼠相比顯著降低，表明DAPA可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，并且對(duì)糖尿病小鼠的腎功能具有一定的保護(hù)作用；進(jìn)一步應(yīng)用CD68免疫組化染色證實(shí)，喂養(yǎng)DAPA 12周后，糖尿病小鼠的腎小球中CD68表達(dá)顯著降低，提示達(dá)格列凈可能是通過降低腎組織炎癥進(jìn)行腎功能保護(hù)。

NF-κB翻譯后修飾，尤其是磷酸化，對(duì)NF-κB調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄同樣重要[14]。P65存在多種磷酸化位點(diǎn)，NF-κB P65亞基特異性磷酸化導(dǎo)致下游基因選擇性轉(zhuǎn)錄。在炎癥期間，Ser-536和Ser-468磷酸化刺激轉(zhuǎn)錄活性[15]。其中，Ser-468磷酸化調(diào)節(jié)P65的穩(wěn)定性，Ser-536磷酸化調(diào)節(jié)亞細(xì)胞的定位[14]。體外培養(yǎng)的AD293細(xì)胞模型中，DAPA可以降低P65亞基Ser-536和Ser-468位點(diǎn)磷酸化。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠腎組織中P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)的磷酸化水平，結(jié)果顯示，DAPA組小鼠腎組織中P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)蛋白表達(dá)低于DM組，提示DAPA可以顯著降低糖尿病小鼠腎組織中P65亞基Ser-536和Ser-468位點(diǎn)的磷酸化，降低糖尿病小鼠腎中炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，DAPA可能通過影響NF-κB信號(hào)通路中P65亞基的磷酸化調(diào)控下游炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮一定的腎保護(hù)作用。