基于銅納米簇模擬酶活性建立比色法測定 魚肉中的次黃嘌呤

趙子軒，楊 雪，魏 潔，陳曉梅

（集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

新鮮度對水產品的品質及原料的加工適性有重要影響[1]。隨著生活水平的提高，人們對于水產品的鮮度要求也越來越高。目前，水產品新鮮度評價方法主要包括常規(guī)的感官評價法以及特殊標志物測定法[2]。前者操作繁瑣、費時且重復性差，相較而言，特殊標志物測定法準確性好、靈敏度高，因此受到研究者的廣泛關注[3]。

次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）作為一種重要的生物堿，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要分解代謝產物[4]。水產品死亡后，體內的ATP在酶的作用下發(fā)生一系列降解反應，產生Hx，其主要步驟如下：三磷酸腺苷→二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）→ 單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）→ 肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）→次黃嘌呤核苷（hypoxanthine ribonucleoside，HxR）→Hx[5-6]。相比水產品鮮度的其他特征標志物，Hx在水產品變質的早期即產生[7]。因此，對Hx含量的準確、快速測定有助于評估水產品的早期新鮮度，這對于保障水產品的食用安全性具有重要意義。

目前，Hx的傳統(tǒng)檢測方法主要有高效液相色譜法[8]、 毛細管電泳法[9]、酶電極傳感器法[10-12]等。這些方法需要相對昂貴的設備和熟練的技術人員，不適合應用于Hx的現(xiàn)場快速檢測[3]。比色分析法是一種根據待測物質顏色變化而建立起來的定量分析方法，具有操作簡便、快速、成本低的優(yōu)點[13]，在食品和環(huán)境污染物檢測方面?zhèn)涫荜P注[14-15]。Tang Yue等[16]合成了具有H2O2模擬酶活性的二維分層狀二硫化鎢納米片，當體系中含有Pb（II）時，H2O2模擬酶活性受到抑制，使3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）藍色氧化物生成量減少，導致650 nm波長處吸光度下降，從而實現(xiàn)對Pb（II）的靈敏檢測。Salem等[17]合成了對氨基苯甲酸穩(wěn)定的銀納米棒，與SO42－結合后銀納米棒發(fā)生聚集，反應體系顏色由紅色變?yōu)樗{黑色，實現(xiàn)對水樣中SO42－的檢測。課題組在前期研究工作中，合成了具有模擬酶活性的鉑鈀納米花修飾石墨烯復合材料，結合TMB實現(xiàn)了對H2O2的比色檢測[18]。本實驗在前期研究工作的基礎上，通過室溫攪拌法合成半胱氨酸（cysteine，Cys）穩(wěn)定的銅納米簇（copper nanoclusters，CuNCs），以TMB為顯色劑，H2O2為底物，考察Cys-CuNCs的H2O2模擬酶活性，結合Hx在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的作用下生成H2O2的特點，建立快速、靈敏檢測Hx的比色分析方法，并將其應用于草魚魚肉鮮度的評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 廈門集美農貿市場。

Hx（純度99%）、L-Cys（純度99%）、TMB（純度98%） 上海麥克林生化有限公司；黃嘌呤氧化酶 美國Sigma-Aldrich公司；二水合氯化銅（分析純） 西隴化工股份有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

F30透射電子顯微鏡 美國FEI公司；Lambda 265紫外-可見分光光度計、LS55熒光分光光譜儀 鉑金埃爾默股份有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 美國 賽默飛世爾科技公司；ME204分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RH D S25加熱磁力攪拌器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 Cys-CuNCs的制備

參考文獻[19]的制備方法。首先，在劇烈攪拌下向10 mL 5 mmol/L CuCl2溶液中逐滴加入10 mL 5 mmol/L Cys溶液，此時，溶液由淡藍色變?yōu)樽仙?。在室溫下繼續(xù)攪拌15 min，利用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)溶液pH 12，此時，溶液變?yōu)榛液谏?。繼續(xù)攪拌2 h后，溶液呈青綠色。將所得溶液在9 000 r/min離心15 min，收集上清液重復離心3 次，用截留分子質量為3 500 Da的透析袋避光透析24 h，得到Cys-CuNCs，于4 ℃冰箱密封保存。

1.3.2 Cys-CuNCs模擬酶活性的測試

以TMB為顯色劑，H2O2為底物，測試Cys-CuNCs的過氧化物模擬酶活性。實驗步驟如下：將10 μL 1.0 mg/mL 的Cys-CuNCs加入2 mL含有1 mmol/L TMB溶液和0.1 mol/L NaAc緩沖液（pH 4.4）的混合溶液中，再加入50 μL的0.1 mol/L H2O2溶液?；旌暇鶆蚝?，室溫下靜置10 min，檢測在652 nm波長處的吸光度。

使用分光光度計在掃描動力學模式下記錄652 nm波長處的吸光度變化，研究過氧化物模擬酶的催化氧化反應動力學。實驗分別通過固定TMB濃度測試不同濃度H2O2反應速率、固定H2O2濃度測試不同濃度TMB反應速率，在此基礎上，計算得到底物的米氏常數Km和最大反應速率Vmax。動力學計算公式為米氏方程：

式中：V為初始速率/（mol/（L?s））；Vmax為最大反應速率/（mol/（L?s））；[S]為底物濃度/（mol/L）；Km為米氏常數/（mol/L）。

1.3.3 Hx的測定

采用比色法進行測定。過程如下：1）將50 μL 1 U/mL XOD加入2 mL含不同濃度Hx的磷酸鹽緩沖液中（pH 7.5，0.1 mol/L），30 ℃水浴反應1 h；2）取0.2 mL水浴反應產物加入Cys-CuNCs模擬酶反應體系（同 1.3.2節(jié)）中；3）將混合溶液在室溫中反應10 min，測定混合溶液在652 nm波長處的吸光度。每組實驗重復檢測3 次，吸光度取平均值。

1.3.4 魚肉樣品的檢測

將新鮮草魚剔除魚頭、魚鱗、魚皮及內臟部分，在25 ℃保存，每隔5 h沿背脊取肌肉部分在4 ℃均質混勻。取均質后的樣品5 g加入20 mL 10%高氯酸溶液中，渦旋振蕩1 min后，在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液。用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)溶液pH值至6.0。隨后按照1.3.3節(jié)進行Hx濃度的測定，每組做3 個平行樣品，結果取平均值。同時取均質后的樣品20 g按照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[20]中微量擴散法測定樣品的揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量，每組做3 個平行樣品，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 Cys-CuNCs的表征

圖1A為Cys-CuNCs、Cys和CuCl2的紫外-可見吸收光譜圖，相比Cys和CuCl2的譜圖，Cys-CuNCs在波長300～400 nm之間出現(xiàn)一個寬吸收峰，而在波長500～600 nm之間沒有明顯的吸收峰。這表明合成的是粒徑較小的CuNCs[21]。從圖1B可以看出，當激發(fā)波長為370 nm時，在495 nm波長處出現(xiàn)Cys-CuNCs的熒光發(fā)射峰。插圖為Cys-CuNCs在日光和紫外燈下的照片，日光下Cys-CuNCs呈現(xiàn)淡藍綠色，紫外燈下發(fā)出明顯的藍色熒光。這與Cys-CuNCs的熒光發(fā)射波長相對應，說明Cys-CuNCs成功合成。

圖1 Cys-CuNCs、Cys和CuCl2的紫外-可見吸收光譜（A）及 Cys-CuNCs的熒光光譜圖（B） Fig. 1 UV-vis absorption spectra of Cys-CuNCs, Cys and CuCl2 (A) and fluorescence spectrum of Cys-CuNCs (B)

從圖2A可見，Cys-CuNCs外觀呈圓粒狀，具有良好的分散性，顆粒大小均勻。進一步統(tǒng)計分析，得到粒徑分布圖，如圖2B所示，粒徑集中分布在2～3 nm之間，平均粒徑為2.58 nm。

圖2 Cys-CuNCs的電子顯微鏡圖（A）及粒徑分布圖（B）Fig. 2 TEM image (A) and particle size distribution (B) of Cys-CuNCs

圖3A為Cys-CuNCs和Cys的FTIR譜圖。Cys譜圖中的特征峰可標記為在1 598.80 cm－1處的（COO—）不對稱拉伸，3 193.63 cm－1處的（—OH）寬吸收峰以及在2 546.55 cm－1處（—SH）的弱峰。Cys-CuNCs的FTIR光譜與Cys大致相似，但未觀察到—SH的吸收峰，證實了S-Cu的相互作用[22-23]。此外，由于高電子致密金屬銅和Cys結合導致其偶極矩發(fā)生變化，Cys-CuNCs光譜中其他基團的特征振動吸收頻率相對于Cys略有不同。實驗通過X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）技術研究Cys-CuNCs表面的化合價態(tài)， 從圖3B可知，Cu在932.2 eV和952.5 eV處各有一個峰，而在942 eV處未觀測到明顯的峰，表明Cu表面主要為 Cu（I）和Cu（0）[24]。

圖3 Cys-CuNCs和Cys的FTIR譜圖（A）及Cys-CuNCs中 Cu 2p的XPS圖（B）Fig. 3 FTIR spectra of Cys-CuNCs and Cys (A) and XPS energy spectrum of Cu 2p of Cys-CuNCs (B)

2.2 Cys-CuNCs過氧化物擬酶活性分析

為研究Cys-CuNCs的過氧化物模擬酶活性，實驗以H2O2為底物，TMB為顯色劑，考察模擬酶體系的紫外-可見吸收光譜。如圖4A所示，當體系同時含有H2O2、TMB、Cys-CuNCs時，在0～10 min內，反應體系在652 nm波長處的吸光度逐漸增強，插圖中反應體系的顏色相應地由無色變?yōu)樗{色。實驗對不同體系在652 nm波長處吸光度-時間曲線進行研究，如圖4B所示，當體系中只含H2O2、TMB時或只含Cys-CuNCs、TMB時，652 nm波長處的吸光度在10 min內沒有明顯變化，只有同時存在H2O2、TMB、Cys-CuNCs時，652 nm波長處的吸光度增長明顯，表明Cys-CuNCs有明顯的過氧化物模擬酶活性。

圖4 H2O2＋TMB＋Cys-CuNCs體系的紫外-可見吸收光譜（A）及 不同反應體系在652 nm波長處的吸光度-時間曲線（B）Fig. 4 UV-vis spectra of H2O2 + TMB + Cys-CuNCs (A) and absorbance-time curves of different reaction systems at 652 nm (B)

2.3 擬酶動力學分析

為確定擬酶的動力學參數，實驗分別改變TMB和H2O2的濃度，在最適條件下測定反應體系在652 nm波長處的吸光度，運用米氏方程獲得最大反應速率Vmax和米氏常數Km。為得到更好的實驗條件，首先對緩沖液體系及其pH值進行優(yōu)化，經過實驗得知，采用NaAc緩沖體系，pH 4.4時，Cys-CuNCs對H2O2、TMB混合溶液有最大的吸光度，因此確定緩沖體系的最佳條件。動力學分析實驗結果表明，固定H2O2濃度調節(jié)TMB濃度，當TMB濃度為1 mmol/L時，初速率達到最大值；固定TMB濃度調節(jié)H2O2濃度，當H2O2濃度為12.5 mmol/L 時，初速率達到最大值。從表1可知，以TMB和H2O2為反應底物時，Cys-CuNCs的Km值分別為 0.41 mmol/L和2.85 mmol/L，均比辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的Km值低，說明Cys-CuNCs對TMB和H2O2的親和力均優(yōu)于HRP，可以實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。

表1 Cys-CuNCs和HRP的酶動力學參數比較Table 1 Comparison of enzyme kinetic parameters between Cys-CuNCs and HRP

2.4 利用Cys-CuNCs檢測H2O2結果

由于制備的Cys-CuNCs具有良好的過氧化物模擬酶活性，利用Cys-CuNCs催化H2O2氧化TMB使溶液變藍的方法檢測H2O2。如圖5A所示，隨著H2O2濃度不斷增加，652 nm波長處的吸光度也逐漸增加。以H2O2濃度和652 nm波長處的吸光度建立線性關系，如圖5B所示，在5～100 μmol/L范圍內H2O2濃度與吸光度呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.001 4x+0.032 7（y為652 nm波長處的吸光度，x為H2O2濃度（μmol/L）），R2為0.994 6，檢出限為0.8 μmol/L。結果表明，基于Cys-CuNCs模擬酶活性，可實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。

圖5 加入不同濃度H2O2后H2O2＋TMB＋Cys-CuNCs體系的紫外-可見吸收光譜（A）和H2O2濃度對吸光度的影響（B）Fig. 5 UV-Vis spectra of H2O2 + TMB + Cys-CuNCs system added with different concentrations of H2O2 (A) and effect of different H2O2 concentrations on absorbance (B)

2.5 利用Cys-CuNCs檢測Hx

根據文獻報道[25]，在XOD的催化下，Hx與溶解氧反應生成H2O2。方程式如下：

為得到更好的檢測效果，對上述反應的孵育溫度和孵育時間進行優(yōu)化。單因素試驗結果表明，當孵育溫度30 ℃、反應時間1 h時，反應體系有最大的吸光度，因此在后續(xù)實驗中選擇30 ℃和1 h作為反應體系的孵育溫度和孵育時間。XOD催化下產生的H2O2與Hx的量直接相關，Cys-CuNCs可催化H2O2，使其與TMB反應，溶液變藍色，反應體系在652 nm波長處的吸光度增加。依據上述原理，可實現(xiàn)對Hx的比色檢測。以Hx濃度和652 nm波長處的吸光度建立線性關系，Hx濃度與652 nm波長處的吸光度在4～100 μmol/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為y=0.001 8x+0.022 1，R2=0.992 0（y為652 nm波長處吸光度，x為Hx濃度（μmol/L）），檢出限為1.2 μmol/L。 圖6為不同濃度Hx對反應體系顏色的影響，隨著Hx濃度升高，反應體系的顏色從無色透明逐漸變?yōu)樗{色，從而實現(xiàn)對Hx的比色測定。

圖6 Hx系列濃度反應體系的顏色 Fig. 6 Color of reaction system with the different Hx concentrations

2.6 Cys-CuNCs的選擇性

為研究魚肉中可能存在的干擾物對傳感器性能的影響，實驗分別以葡萄糖、乳酸、抗壞血酸、尿酸為干擾物，在相同條件下測試這些物質在652 nm波長處吸光度的變化。如圖7所示，添加等量物質（100 μmol/L）后，Hx在652 nm波長處的吸光度有顯著變化，而添加其他物質后，吸光度變化不明顯（A其他＜0.15AHx），表明所建立方法對Hx檢測有較好的選擇性和抗干擾能力。

圖7 不同干擾物對體系吸光度的影響Fig. 7 Effects of different interferents on the absorbance of the system

2.7 實際樣品的檢測

每隔5 h對25 ℃貯藏的草魚肉按照2.5節(jié)進行處理，之后進行Hx和TVB-N含量的測定，結果如圖8所示。草魚魚肉隨著時間變化，Hx和TVB-N含量變化趨勢基本一致，將Hx含量與TVB-N含量建立相關性，可實現(xiàn)對魚肉新鮮度的評價。在貯藏期0～20 h時，Hx和TVB-N含量增長較為平緩，此時魚肉品質較為新鮮。在貯藏20 h后，Hx和TVB-N含量變化較為明顯，在此之后魚肉的變質速率明顯加快。在30 h時，魚肉的TVB-N含量超過國標規(guī)定的限定值（20 mg/100 g）[26]，此時魚肉已不再新鮮，所對應的Hx含量為（1.09±0.02）mg/5 g。 因此，可以認為當魚肉中Hx含量超過（1.09± 0.02）mg/5 g時魚不再新鮮。

圖8 草魚死后25 ℃貯藏過程中Hx和TVB-N含量變化的關系圖Fig. 8 Relationship between the changes of hypoxanthine and TVB-N contents in grass carp muscle during postmortem storage at 25 ℃

3 結 論

本研究通過室溫攪拌法得到Cys穩(wěn)定的Cys-CuNCs，并對Cys-CuNCs的形貌、元素組成、表面官能團和發(fā)光特征進行表征。通過分析反應體系的紫外-可見吸收光譜，驗證了Cys-CuNCs具有良好的過氧化物模擬酶活性，在此基礎上，實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。結合XOD催化Hx生成H2O2的反應，建立了一種檢測Hx的比色分析方法。Hx濃度在4～100 μmol/L內與吸光度呈良好的線性關系，檢出限為1.2 μmol/L。將該方法應用于草魚魚肉中Hx含量的測定，同時根據魚肉中的TVB-N含量，建立Hx和新鮮度的相關性，實現(xiàn)對魚肉新鮮度的判斷。該檢測方法簡便快捷、靈敏可靠，研究結果將為其他肉類新鮮度檢測方法的改良積累基礎資料。