基于染料Genefinder和適配體的熒光傳感 體系檢測赭曲霉毒素A

郭 婷，葉志杰，周鴻媛，張宇昊,2，馬 良,2,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)生物學(xué)研究中心，重慶 400715）

目前，赭曲霉毒素污染農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，因此引起高度重視。2020年7月，愛爾蘭食品安全局發(fā)布預(yù)警通報，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）含量升高，立即下令召回一批小麥片。赭曲霉毒素是由曲霉屬、青霉屬的真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1-2]，常見的赭曲霉毒素有OTA、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C，其中毒性最大且最受關(guān)注的是OTA，其廣泛存在于糧食及其制品中，具有致畸、致癌、致突變等多種毒性，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B類致癌物[3]。目前針對OTA的檢測方法主要包括色譜法[4-7]、免疫法[8-10]。 其中色譜法準(zhǔn)確度高，但樣品前處理復(fù)雜，需昂貴的大型儀器、專業(yè)人員操作，僅適合實驗室操作，無法達(dá)到目前食品安全快速檢測的要求。免疫法作為快速檢測方法，具有操作簡單、靈敏度高、檢測快的特點，但是其核心元件是抗體，存在制備時間長、穩(wěn)定性差、不易保存、假陽性等問題。

近年來，生物傳感器法因其微型、智能、多功能等特點，受到越來越多的關(guān)注。目前生物傳感器已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品分析、生物監(jiān)測等方面[11-13]。生物傳感器的核心部件分別為識別、傳感元件。傳統(tǒng)的識別元件是生物抗體等活性物質(zhì)，由于其穩(wěn)定性問題限制了傳統(tǒng)生物傳感器的進(jìn)一步推廣與應(yīng)用。而適配體技術(shù)可有效解決上述問題。適配體為對目標(biāo)物具有高特異性結(jié)合能力的DNA或RNA[14-16]。與抗體相比，適配體可體外合成，且制備價格低，穩(wěn)定性好，以適配體為識別元件的生物傳感器在食品安全檢測領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。Zhang Jing等[17]采用AgPt雙金屬納米粒子修飾的金屬有機(jī)框架構(gòu)建適配體電化學(xué)傳感器檢測OTA，檢出限（limit of detection，LOD）為14 fg/mL。Li Yapiao等[18]采用熒光標(biāo)記探針開發(fā)具有信號關(guān)閉或信號打開的競爭性熒光各向異性方法測定OTA。Zhu Weiran等[19]構(gòu)建可同時檢測OTA和AFB1的比色傳感器，該傳感器對OTA的檢測范圍為0.5～80 ng/mL，對AFB1的檢測范圍為5～250 ng/mL。Ma Liang等[20]開發(fā)基于磁性石墨烯的熒光傳感器檢測展青霉毒素，熒光染料FAM修飾的適配體通過靜電相互作用吸附在磁性石墨烯表面，磁性石墨烯與FAM染料發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，染料的熒光被強(qiáng)烈猝滅，加入展青霉毒素時，適配體識別展青霉毒素，并與其形成一定的結(jié)構(gòu)，從而從磁性石墨烯表面釋放，熒光強(qiáng)度恢復(fù)，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化檢測展青霉毒素。

Genefinder染料是花青素類的染料，具有安全環(huán)保、毒性低、靈敏度高等特點[21-22]。該染料與雙鏈DNA作用后熒光會增強(qiáng)800～1 000 倍，因此其常用于電泳中核酸染色[22-23]，而檢測方面的應(yīng)用鮮見報道[22]。因此，本研究以適配體為識別元件，熒光染料Genefinder為傳感元件，采用熒光染料特殊的熒光特性構(gòu)建熒光傳感體系，實現(xiàn)快速、高靈敏檢測OTA。檢測原理圖如圖1所示，首先OTA適配體與其互補(bǔ)鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，Genefinder染料與此雙鏈結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合后產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號，然后加入毒素OTA，適配體與OTA結(jié)合形成四鏈體結(jié)構(gòu)，雙鏈打開，Genefinder染料熒光強(qiáng)度降低。根據(jù)熒光強(qiáng)度的改變檢測目標(biāo)物OTA含量。

圖1 傳感體系的檢測原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the sensing system

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酒購于本地超市。

OTA適配體（5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAA GGGAGCATCGGACA-3’）[24]及其互補(bǔ)鏈（5’-TGTAAGA TGCTCACTTTATAACACTCACACTAGATC-3’） 生工 生物工程（上海）有限公司；染料Genefinder 合肥 博美生物科技有限責(zé)任公司；OTA、黃曲霉毒素M1（aflatoxins M，AFM1）、黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxins B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxins G1，AFG1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、單端孢霉烯（trichothecenes-2，T-2）毒素標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；臺式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA濃度測定

采用紫外-可見分光光度計測定適配體DNA在260 nm波長處的吸光度，依據(jù)朗伯比爾定律計算得DNA濃度，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）將其配制成500 nmol/L DNA溶液，于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熒光傳感器構(gòu)建

DNA母液解凍后，水浴90 ℃處理10 min，逐漸冷卻至室溫（退火）備用。研究孵育時間對傳感器的影響。取50 μL 500 nmol/L OTA適配體與等體積等濃度互補(bǔ)鏈混合，再加入2.5 μL質(zhì)量濃度1 mg/L的OTA溶液，孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，得到終體積500 μL、OTA適配體及互補(bǔ)鏈終濃度50 nmol/L、OTA終質(zhì)量濃度5 μg/L的混合溶液，設(shè)定激發(fā)波長500 nm、發(fā)射波長529 nm測定其熒光光譜，無目標(biāo)物、添加目標(biāo)物時的熒光強(qiáng)度分別記為F0、F。

研究適配體濃度對傳感器的影響。將一定濃度的OTA適配體與等體積等濃度互補(bǔ)鏈混合，再加入終質(zhì)量濃度為5 μg/L OTA孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，測定熒光光譜。

1.3.3 熒光傳感器性能分析

OTA適配體及其互補(bǔ)鏈退火后，將等體積等濃度的OTA適配體及其互補(bǔ)鏈混合（終濃度為50 nmol/L），再加入不同濃度OTA孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，測定熒光光譜。

OTA適配體及其互補(bǔ)鏈退火后，將等體積等濃度的OTA適配體及其互補(bǔ)鏈混合（終濃度為50 nmol/L），再分別加入5 μg/L OTA，10 μg/L T-2、ZEN、AFB1、AFB2、AFM1、AFG1及混合毒素（5 μg/L OTA與10 μg/L T-2、ZEN、AFB1、AFB2、AFM1、AFG1混合）孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，測定其熒光值。

1.3.4 實際樣品中OTA的檢測

向紅酒樣品中加入一定量OTA，分別配成質(zhì)量濃度為2、5、10 μg/L的陽性樣本。將紅酒樣于室溫、15 000 r/min離心5 min取上清液，稀釋100 倍后，按照構(gòu)建的熒光傳感體系檢測OTA。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel軟件分析數(shù)據(jù)，運(yùn)用Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳感體系的檢測原理

以O(shè)TA為研究對象，其適配體為識別元件，Genefinder為傳感元件構(gòu)建熒光傳感體系。以500 nm為激發(fā)波長，從圖2可知，僅有OTA溶液的條件不產(chǎn)生熒光信號，因此不影響熒光傳感體系的準(zhǔn)確度。OTA適配體及互補(bǔ)鏈分別與染料Genefinder作用后產(chǎn)生較微弱的熒光信號。適配體、互補(bǔ)鏈混合后再加入Genefinder，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其原因為適配體與互補(bǔ)鏈形成了雙鏈結(jié)構(gòu)，Genefinder與雙鏈結(jié)構(gòu)作用產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。適配體、互補(bǔ)鏈混合體系中再次加入OTA后，適配體與OTA形成四鏈體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致雙鏈打開，熒光強(qiáng)度降低。因此，可通過檢測熒光信號強(qiáng)度與體系中OTA質(zhì)量濃度的關(guān)系，定量檢測OTA。

圖2 不同條件的熒光強(qiáng)度Fig. 2 Fluorescence intensity under different conditions

2.2 傳感體系的構(gòu)建

2.2.1 孵育時間

適配體對目標(biāo)物的識別需要一定時間，孵育時間過短可能造成部分適配體未能識別目標(biāo)物。因此本實驗研究10～120 min孵育時間對熒光信號的影響。孵育時間與熒光信號強(qiáng)度的關(guān)系見圖3，結(jié)果表明，10～60 min內(nèi)隨著孵育時間的延長，熒光猝滅量逐漸增強(qiáng)，適配體與OTA孵育60 min，熒光猝滅量達(dá)到最大，60 min后熒光猝滅量無明顯變化，說明孵育時間為60 min時，體系中OTA適配體與OTA的結(jié)合已飽和。因此，選擇孵育時間60 min進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 孵育時間對熒光強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effect of incubation time on fluorescence intensity

2.2.2 適配體濃度

如圖4所示，隨著OTA適配體濃度的增加，熒光猝滅強(qiáng)度也逐漸增加，適配體濃度為50 nmol/L時達(dá)到平衡。為了滿足實驗需求、節(jié)約成本，后續(xù)實驗適配體濃度選擇50 nmol/L。

圖4 適配體濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fig. 4 Effect of aptamer on the fluorescence intensity

2.3 熒光傳感體系的性能分析

2.3.1 熒光傳感體系與OTA質(zhì)量濃度的線性關(guān)系

在最佳的實驗條件下，構(gòu)建熒光傳感體系，考察熒光傳感體系對不同質(zhì)量濃度OTA的熒光響應(yīng)情況。如 圖5A所示，隨著OTA質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，其原因為OTA的加入破壞雙鏈結(jié)構(gòu)。從圖5B可知，OTA質(zhì)量濃度在50 pg/L～300 ng/L范圍內(nèi)，1－F/F0與OTA質(zhì)量濃度的對數(shù)呈線性，線性方程為y=0.121lgx+0.542（R2=0.996），該傳感體系的實際LOD為50 pg/L，結(jié)果表明該熒光傳感體系具有較高的靈敏度。從表1可知，與近年來檢測OTA的熒光傳感方法相比，該方法仍然具有一定的競爭力。

圖5 不同質(zhì)量濃度OTA對所構(gòu)建傳感體系熒光響應(yīng)變化（A）及 1－F/F0與OTA質(zhì)量濃度對數(shù)的線性關(guān)系（B）Fig. 5 Fluorescence spectra of the sensor with different concentrations of OTA (A) and influence of OTA concentration on fluorescence intensity (B)

表1 OTA的熒光檢測方法的LOD和線性范圍Table 1 LODs and linear ranges of fluorescent methods for OTA detection

2.3.2 熒光傳感體系的選擇性

以AFB1、AFB2、AFM1、AFG1、ZEN、T-2為樣本考察該傳感體系的選擇性。實驗中OTA質(zhì)量濃度為5 μg/L，對照毒素質(zhì)量濃度均為OTA的2 倍。如圖6所示，加入OTA后熒光傳感體系的熒光強(qiáng)度猝滅量最大，這是因為傳感體系中使用的適配體與OTA可以特異性結(jié)合，而與其他毒素?zé)o明顯作用。另外，研究OTA與其他對照毒素共存時熒光傳感體系的性能，結(jié)果表明其他毒素對傳感體系并無明顯影響，說明該傳感體系對OTA具有較好的選擇性。

圖6 熒光傳感體系的選擇性Fig. 6 Selectivity of the sensing system

2.4 實際樣品測定

為了考察傳感體系實際測定效果，以紅酒作為實際陰性樣品，研究加標(biāo)回收情況。如表2所示，采用傳感體系檢測的加標(biāo)回收率在101.9%～105.6%的范圍內(nèi)，這說明該熒光傳感體系可用于測定真實樣品中的OTA。

表2 實際樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Spike recoveries for real sample (n= 3)

3 結(jié) 論

本實驗構(gòu)建簡單的基于染料Genefinder和適配體的熒光傳感體系，可用于高靈敏度、高特異性檢測OTA。在最優(yōu)條件中，該熒光傳感體系的線性范圍50 pg/L～ 300 ng/L，實際LOD為50 pg/L。實際樣品檢測效果理想，說明本傳感體系在食品安全檢測中具有較強(qiáng)實用性，為開發(fā)簡單、快速、靈敏和高選擇性的食品安全生物傳感體系提供了新的思路。