中藥材佛手的指紋圖譜建立及在鑒別中的應(yīng)用

余曉燕，余 艷，陳小燕，王 華

（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)，江蘇 泰州 225321）

佛手為蕓香科植物佛手的干燥果實(shí)[1，2]；屬蕓香科香櫞的一個變種，含揮發(fā)油、黃酮類、多糖類等藥效組分[3]；用于治療疏肝理氣，和胃止痛，燥濕化痰[1]。用于肝胃氣滯，胸脅脹痛，胃脘痞滿，食少嘔吐，咳嗽痰多等[1,2]。

揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)的胃蘇顆粒中包含8 味中藥材，其中就有佛手，主要使用產(chǎn)地為廣東、廣西佛手，不同的供應(yīng)商佛手質(zhì)量參差不齊，單純依靠經(jīng)驗(yàn)、外觀驗(yàn)收存在風(fēng)險，而中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的新型技術(shù)鑒定手段[4]，以中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究為基礎(chǔ)，可用于評價中藥材的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性[5]。

本實(shí)驗(yàn)室通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，摸索和建立了HPLC法進(jìn)行佛手的指紋圖譜的研究，經(jīng)過提取溶劑考察、提取時間考察、溶劑倍量考察、重復(fù)性考察、不同人員、儀器等考察比較論證后，為胃蘇顆粒產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠提供檢驗(yàn)依據(jù)。

1 相關(guān)儀器及試劑

1.1 儀器安捷倫1260 型HPLC；色譜工作站（OpenLab Ezchrom）；電子天平（Mettler Toledo XPE205）；超聲波清洗儀（KQ500DB）。

1.2 試劑磷酸（國藥集團(tuán)；批號：20190805），甲醇（默克公司；批號：20201020），乙腈（默克公司；批號：JA097030），Milli-Q超純水。

1.3 對照品橙皮苷對照品（批號：110721-201617）來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 供試樣品佛手藥材見表1，各樣品為揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司中心化驗(yàn)室按照佛手藥材檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢測合格。將佛手藥材打粉過2號篩備用。

表1 佛手藥材樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 波長的選擇 按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備佛手供試品溶液[6-8]，用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，比較各波長下的色譜圖，最后確定在283nm 時，響應(yīng)值高且分離的色譜峰信息量多。

2.1.2 提取溶劑的選擇 提取溶劑考察甲醇（濃度分別為100%、80%、60%、40%、20%）、水，超聲前稱定樣品重量，采用功率500W超聲波進(jìn)行超聲處理，放冷，再分別稱定超聲后樣品重量，分別用溶劑補(bǔ)足減失重量，搖勻，取適量溶液，離心5min（約3000轉(zhuǎn)/min）；將離心后的溶液采用溶劑過濾器進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液。以柚皮苷峰面積作為提取效率的衡量指標(biāo)，圖譜結(jié)果表明，甲醇提取效率高，提取峰較多。

2.1.3 溶劑倍量、提取時間的選擇 選擇甲醇，提取溶劑倍量考察30ml、50ml、70ml、90ml，提取時間考察20分鐘、40分鐘、60分鐘、80分鐘。超聲前稱定樣品重量，采用功率500W超聲波進(jìn)行超聲處理，放冷，再分別稱定超聲后樣品重量，分別用溶劑補(bǔ)足減失重量，搖勻，取適量溶液，離心5min（約3000轉(zhuǎn)/min）；將離心后的溶液采用溶劑過濾器進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液。以柚皮苷峰面積作為提取效率的衡量指標(biāo)，圖譜結(jié)果表明，50ml甲醇提取，提取效率高，提取峰較多。

2.2 色譜條件色譜柱填充劑采用十八烷基硅烷鍵合硅膠（推薦使用規(guī)格：4.6×250mm×5um）；流動相分別為：流動相A=乙腈，流動相B=0.1%磷酸，按表2 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為283nm，柱溫為40℃；流速為每分鐘1.0ml/min。

表2 梯度洗脫

2.3 供試品溶液的制備取編號為304004-2011015佛手粉末約1.0g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，采用功率500W 超聲波進(jìn)行超聲處理60 分鐘，放冷，稱定超聲后樣品重量，補(bǔ)足減失重量，搖勻，取適量溶液，離心5min（約4000 轉(zhuǎn)/min）；將離心后的溶液采用溶劑過濾器進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液。

2.4 對照品溶液的制備分別精密稱取橙皮苷對照品適量，配成橙皮苷（100ug/ml）溶液。

2.5 參照峰的選擇從編號為304004-2011015佛手的含量測定HPLC 圖譜中可以發(fā)現(xiàn)橙皮苷含量較高。選取橙皮苷峰作為參照峰。

2.6 精密度試驗(yàn)取編號為304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備成1 份佛手供試品溶液[4]。按照“2.2 色譜條件”分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣10μl。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間和峰面積基本一致，RSD 均小于5%，相似度結(jié)果均大于0.998，符合指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)要求，儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)取編號為304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備成6 份佛手供試品溶液[4]。按照“2.2 色譜條件”分析，分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10μl。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間和峰面積基本一致，RSD 均小于5%，相似度結(jié)果均大于0.997，符合指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)要求，儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備佛手供試品溶液，室溫放置，于0，2，4，8，12，24小時進(jìn)樣，按照“2.2 色譜條件”分析。圖譜結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間和峰面積基本一致，相對平均偏差均小于5%，相似度結(jié)果均大于0.998，符合指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)要求，供試品溶液及對照品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 中間精密度試驗(yàn)

2.9.1 不同日期試驗(yàn) 取批號為304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備成佛手供試品溶液[4]。按照“2.2 色譜條件”分析，3份樣品分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10μl[4]，連續(xù)三天。

2.9.2 不同人員試驗(yàn) 取批號為304004-2011015的佛手粉末，每人按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備成佛手供試品溶液[4]。按照“2.2 色譜條件”分析，每人進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10μl[4]。

2.9.3 不同儀器試驗(yàn) 取批號為304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備成佛手供試品溶液[4]。按照“2.2 色譜條件”分析，分別在3 臺高效液相色譜儀上分析，每次進(jìn)樣10μl[4]。

2.9.4 不同色譜柱試驗(yàn) 取批號為304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供試品溶液制備方法”制備成佛手供試品溶液[4]。按照“2.2.色譜條件”分析，在同一臺儀器上，每根色譜柱進(jìn)樣3 份樣品，每次進(jìn)樣10μl。

2.9.5 結(jié)論 按照不同日期（D1/D2/D3）、不同人員（P1/P2/P3）、不同色譜柱（C1/C2/C3）、不同儀器（H1/H2/H3）設(shè)計(jì)4 因素3 水平方案如表3 所示，按排列進(jìn)行試驗(yàn)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

圖譜結(jié)果使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版[5]”軟件進(jìn)行相似度比對，佛手耐用性試驗(yàn)相似度在0.923 至0.999，結(jié)果表明不同日期、不同人員、不同色譜柱、不同儀器檢驗(yàn)的結(jié)果無明顯差異，符合指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)要求，方法耐用性良好。

3 結(jié)果

精密稱定10個批次的待分析佛手粉末，按照“2.3.供試品溶液制備方法”制備佛手供試品溶液，按照“2.2.色譜條件”分析。10 批佛手藥材與對照品指紋圖譜疊加見圖1，圖譜結(jié)果使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版[5]”軟件進(jìn)行相似度比對，佛手相似度范圍0.989至0.999。

圖1 10批佛手藥材與對照品指紋圖譜疊加圖