帥良 殷菲朧 廖玲燕 劉云芬 段振華 李麗

摘要：【目的】對香蕉果實(shí)非特異性磷脂酶C基因（MaNPC1）開放閱讀框（ORF）進(jìn)行原核表達(dá)，并制備其多克隆抗體，為深入探究MaNPC1在香蕉果實(shí)抵御炭疽病中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及抗原性預(yù)測，并通過雙酶切法構(gòu)建其原核表達(dá)載體，利用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta 2（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白經(jīng)Ni-NTA樹脂層析柱純化后免疫新西蘭兔，以制備多克隆抗體。同時(shí)，運(yùn)用Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測香蕉果實(shí)貯藏過程中在炭疽病侵染脅迫下MaNPC1蛋白表達(dá)水平及MaNPC1基因相對表達(dá)量。【結(jié)果】重組質(zhì)粒pGEX-6p-3-MaNPC1經(jīng)雙酶切后得到1650 bp的特異性條帶，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta 2（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后成功表達(dá)。MaNPC1蛋白分子式為C2747H4249N769O793S10，分子量為61.06 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.96;丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸含量較高，分別占氨基酸總數(shù)的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不穩(wěn)定指數(shù)為47.14，表明其為不穩(wěn)定蛋白;蛋白抗原區(qū)段豐富且親水性氨基酸數(shù)目明顯高于疏水性氨基酸，有利于后續(xù)抗體的制備。制備的多克隆抗體效價(jià)較高，為1∶2048000。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，香蕉果實(shí)貯藏過程中MaNPC1蛋白表達(dá)水平呈上升—下降—上升的變化趨勢;炭疽病侵染組MaNPC1蛋白除貯藏15 d時(shí)的表達(dá)水平比對照組低外，其他貯藏時(shí)間均略高于對照組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，MaNPC1基因相對表達(dá)量在香蕉果實(shí)貯藏過程中呈逐漸上升趨勢;貯藏3～15 d，炭疽病侵染組MaNPC1基因相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P<0.05）?！窘Y(jié)論】炭疽病侵染能提高M(jìn)aNPC1蛋白表達(dá)水平，故推測MaNPC1蛋白參與香蕉果實(shí)抵抗炭疽病侵染。

關(guān)鍵詞： 香蕉;MaNPC1基因;原核表達(dá);多克隆抗體;炭疽病;貯藏

中圖分類號： S668.103.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1753-09

Prokaryotic expression of banana MaNPC1 gene and preparation of its polyclonal antibody

SHUAI Liang1，2， YIN Fei-long1， LIAO Ling-yan1， LIU Yun-fen1， DUAN Zhen-hua1，

LI Li2， HE Xue-mei2， LI Chang-bao2， SUN Jian2*

（1School of Food and Biological Engineering，Hezhou University/Institute of Food Science and Engineering Technology，Hezhou， Guangxi? 542899， China; 2Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Open Laboratory of Crop Genetic Improvement Biotechnology/Guangxi Key Experiment of Storage and Processing New Technology for Fruits and Vegetables Laboratory

Cultivation Base， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】Prokaryotic expression of the open reading frame（ORF） of banana fruit non-specific phospholipase C gene（MaNPC1） and preparation of its polyclonal antibody were conducted， to provide theoretical basis for in-depth exploration of the mechanism of MaNPC1 in banana fruit resistance to anthracnose. 【Method】The ORF sequence of MaNPC1 gene was cloned， bioinformatics analysis and antigenicity prediction were carried out， and its prokaryotic expression vector was constructed by double enzyme digestion method， and the heat shock method was used to transfer it into Escherichia coli Rosetta 2（DE3） competent cell for induction expression， and the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin chromatography column to immunize New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibodies. At the same time， Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the MaNPC1 protein expression level and the relative expression level of MaNPC1 gene under the stress of anthracnose infection during banana fruit sto-rage. 【Result】The pGEX-6p-3-MaNPC1 recombinant plasmid was double-enzyme digested to obtain a specific band of 1650 bp， indicating that the prokaryotic expression vector was successfully constructed and transferred to E. coli Rosetta 2 （DE3） competent cell for successful expression. The molecular formula of MaNPC1 protein was C2747H4249N769O793S10， the molecular weight was 61.06 kD， and the theoretical isoelectric point（pI） was 8.96; the contents of alanine， valine， leucine and serine were high， accounting for 8.7%， 8.2%， 7.8% and 7.7% of the total number of amino acids， respectively; the instability index was 47.14， indicating that it was an unstable protein. The protein antigen segment was rich and the number of hydrophilic amino acids was? higher than that of hydrophobic amino acids， which was easy for subsequent antibody preparation. The prepared polyclonal antibody had a higher titer of 1：2048000. Western blotting analysis showed that the MaNPC1 protein expression level of banana fruits showed an upward-decreasing-increasing trend during storage. The MaNPC1 protein expression level of the anthracnose infection group was lower than that of the control group when stored for 15 d， and the other storage time was slightly higher than the control group. Real-time fluorescent quantitative PCR detection showed that the relative expression of MaNPC1 gene showed a gradual upward trend during storage of banana fruits; after storage for 3 to 15 d， the relative expression of MaNPC1 gene in the anthracnose infection group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. 【Conclusion】Anthracnose infection can increase the expression level of MaNPC1 protein， indicating that MaNPC1 protein participates in banana fruit resistance to anthracnose infection.

Key words： banana; MaNPC1 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibodies; anthracnose; storage

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31660589）; Guangxi Natural Science Foundation （2018GXNSFBA281118，2019GXNSFAA185027）; The Basic Ability Enhancement Project for Young and Middle-aged Teachers of Guangxi（2020KY18020）

0 引言

【研究意義】香蕉為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）單子葉植物，是生長于熱帶亞熱帶地區(qū)的一種重要經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，也是全球鮮銷量最大的水果（Huang et al.，2014;王芳等，2016）。自2011年起我國香蕉產(chǎn)量躍居世界第二，并呈逐年增長趨勢，香蕉產(chǎn)業(yè)已成為我國熱帶地區(qū)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一（王芳等，2016）。香蕉為典型的呼吸躍變型水果，同時(shí)又是冷敏性水果，在采收和運(yùn)輸過程中，冷害、病害及機(jī)械傷害等造成的損失相當(dāng)嚴(yán)重（Huang et al.，2012;Ketsa et al.，2013;王海波等，2018）。我國的香蕉采后損耗率高達(dá)50%左右，遠(yuǎn)高于果蔬采后的平均損耗率25%（謝建華和龐杰，2010）。非特異性磷脂酶C（Non-specific PLC，NPC）能水解磷脂酸膽堿和磷脂酰乙醇胺生成二?；视停―AG），在采后果蔬貯藏過程中發(fā)揮重要作用，尤其是在植物逆境脅迫及脫落酸、油菜素內(nèi)酯等激素信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用（帥良等，2019）。因此，原核表達(dá)香蕉NPC1基因（MaNPC1），并制備其多克隆抗體，運(yùn)用Western blotting探究香蕉果實(shí)貯藏過程中MaNPC1基因表達(dá)量變化，對探究香蕉果實(shí)中NPC的生物學(xué)功能及作用機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，已從水稻（Chrastil and Parrish，1987）、擬南芥（Peters et al.，2010）、谷子（胡利芹等，2015）、陸地棉（Song et al.，2017）等植物中克隆出NPC基因。早期研究并未發(fā)現(xiàn)植物NPC為植物磷脂酶家族成員，后期經(jīng)過多序列比對和結(jié)構(gòu)域預(yù)測才得以證實(shí)（Nakamura and Awai，2005）。NPC分泌蛋白具有典型的磷脂酶活性，且具有磷脂酶特有的磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，但不含其他植物脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白特有的XY和PX等結(jié)構(gòu)域，一般由510～540個(gè)氨基酸殘基組成。多數(shù)植物的NPC分泌蛋白N端具有一個(gè)信號肽，信號肽后面有一段高度保守序列和一個(gè)短的可變區(qū)域，其中，高度保守序列位于磷酸酯酶域前方（帥良等，2019）。Krcková等（2015）在大腸桿菌重組表達(dá)擬南芥NPC，并進(jìn)行體外活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPC1、NPC2、NPC3、NPC4和NPC5均具有磷脂酶活性，但NPC6不具有磷脂酶活性。與植物中的其他脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白不同，NPC活性不受Ca2+的影響，但易受Triton X-100、EGTA、NP-40和Al3+等的影響，其中，NP-40作為表面活性抑制劑，能抑制NPC活性，且抑制程度與其濃度在一定范圍成正比（Reddy et al.，2010）;Al3+則通過阻礙NPC與細(xì)胞膜的結(jié)合進(jìn)而抑制NPC活性（Pejchar and Martinec，2015）。大量研究結(jié)果顯示，在長期經(jīng)受生物脅迫（Albrecht and Bowman，2008）、非生物脅迫（Peters et al.，2014）和激素處理（Rinukshi et al.，2010）下，植物的NPC活性及其基因表達(dá)均會發(fā)生改變，表明NPC參與植物對環(huán)境和生物刺激的各種代謝反應(yīng)。此外，NPC參與了生物脅迫特別是病原菌造成的病害脅迫響應(yīng)。如在甜橙感染黃龍病后，與擬南芥AtNPC5基因同源的甜橙CsNPC基因表達(dá)量較對照（無黃龍病脅迫）增加了5倍（Albrecht and Bowman，2008）;使用來自細(xì)菌的激發(fā)子flgg22和Hprz處理擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtNPC1和AtNPC4基因表達(dá)量有所改變（帥良等，2019）?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】目前，已有大量應(yīng)用各種載體在不同表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)重組蛋白，并以其免疫動(dòng)物制備抗體的研究報(bào)道，但未見針對香蕉NPC的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆MaNPC1基因開放閱讀框（ORF），對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及抗原性預(yù)測，并通過雙酶切法構(gòu)建其原核表達(dá)載體，利用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta 2（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白經(jīng)Ni-NTA樹脂層析柱純化后免疫兔子，以制備多克隆抗體;同時(shí)運(yùn)用Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測香蕉果實(shí)貯藏過程中MaNPC1蛋白表達(dá)水平及MaNPC1基因相對表達(dá)量，為揭示MaNPC1在香蕉果實(shí)抵御炭疽病中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試香蕉品種寶島蕉（M. acuminata L. AAA Cavendish‘Formosana）由廣西農(nóng)業(yè)良種海南南繁育種基地提供，采收成熟度為七八成熟，挑選果形端正、無機(jī)械傷和病蟲害的香蕉為試材，落梳后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，適當(dāng)降溫后，清水清洗晾干，選擇大小相近、成熟度相同，且未受感染和生理損傷的香蕉果實(shí)，隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對照組。香蕉炭疽病菌分生孢子懸液（106個(gè)孢子/mL）由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所提供;質(zhì)粒DNA提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自愛思進(jìn)（Axygen）生物技術(shù)有限公司;引物合成及測序委托生工生物工程 （上海） 股份有限公司完成。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品處理 對剛采摘的果實(shí)進(jìn)行人工噴霧接種香蕉炭疽病菌分生孢子懸液（106個(gè)孢子/mL），以噴霧蒸餾水作對照組。處理后用0.03 mm厚聚乙烯薄膜袋包裝，置于20 ℃下貯藏，觀察炭疽病發(fā)生情況。接種前取一次果實(shí)用于MaNPC1基因克隆。接種后每3 d取樣一次，每次從6個(gè)果實(shí)上取樣，設(shè)3次重復(fù)，樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱凍藏，用于檢測香蕉果實(shí)貯藏過程中MaNPC1蛋白表達(dá)水平及MaNPC1基因相對表達(dá)量。

1. 2. 2 MaNPC1基因ORF克隆 基于課題組前期克隆的香蕉MaNPC1基因全長序列2090 bp（GenBank登錄號LOC103995036），利用ORF Pinder查找其ORF，通過Prime Premier 5.0設(shè)計(jì)ORF特異性擴(kuò)增引物（MaNPC1-F1：5'-GAACCCGGGTGATGGATT CGGGGGTCCAG-3'，劃線處為SmaⅠ酶切位點(diǎn);Ma-NPC1-R1：5'-CTTCGCGGCCGCTTATCAAATGCTT TGGACGGA-3'，劃線處為Not Ⅰ酶切位點(diǎn)）。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×PCR Buffer for KOD FX 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNase-free H2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析及抗原性預(yù)測 參考帥良等（2020）的方法進(jìn)行MaNPC1蛋白結(jié)構(gòu)分析及抗原性預(yù)測。采用ExPASy中的ProtScale進(jìn)行蛋白親/疏水性預(yù)測;采用TMHMM server v.2.0進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測;使用SignalP 5.0預(yù)測蛋白信號肽;通過在線網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）;使用PredictProtein對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;使用Protean中的Jameson-Wolf方法對香蕉MaNPC1蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測分析。

1. 2. 4 原核表達(dá)載體構(gòu)建 參考劉云芬（2016）的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體。具體步驟：以Sma Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切pGEX-6p-3-GST質(zhì)粒載體和MaNPC1基因ORF，通過T4 DNA連接酶將二者連接后獲得重組質(zhì)粒pGEX-6p-3-GST-MaNPC1，利用熱激法將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta 2（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出陽性重組菌株，經(jīng)PCR擴(kuò)增及電泳檢測驗(yàn)證后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對分析。

1. 2. 5 蛋白表達(dá)及可溶性分析 參考陳偉等（2019）的方法進(jìn)行MaNPC1蛋白表達(dá)及可溶性分析。具體步驟：重組菌株振蕩培養(yǎng)約2.5 h（OD600達(dá)0.6～0.8）后加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別誘導(dǎo)表達(dá)3和6 h，以未加入IPTG為對照組;離心收集菌體后進(jìn)行超聲波破碎，使用1 mL裂解緩沖液懸浮離心后，分別取上清液和沉淀液各50.0 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1. 2. 6 包涵體蛋白純化 參考胡平各等（2020）的方法進(jìn)行MaNPC1蛋白純化。具體步驟：將收集的沉淀加入Ni-NTA樹脂層析柱中，流速控制在0.5 mL/min，收集穿柱液體。以10倍柱床體積的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200和NTA-500 Buffer進(jìn)行洗脫，收集各洗脫峰，取少量洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，其余洗脫液置于透析袋中，4 ℃下以1×PBS透析，并超濾濃縮透析產(chǎn)物。

1. 2. 7 多克隆抗體制備及免疫效價(jià)檢測 參考張永德等（2018）的方法進(jìn)行多克隆抗體制備及免疫效價(jià)檢測。具體步驟：以純化的重組蛋白免疫注新西蘭兔，每次注射的重組蛋白用量為200 μg，每間隔7 d對2只兔子進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，每只兔子免疫4～5次，并采用間接ELISA法測定血清抗體效價(jià)，當(dāng)（陽性血清OD450-空白孔OD450）/（陰性血清OD450-空白孔OD450）>2.1時(shí)，陽性血清最大稀釋倍數(shù)即為血清抗體效價(jià)。待抗體表達(dá)恒定后，采集血樣并分離血清，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 8 香蕉組織蛋白提取及定量分析 參考劉云芬（2016）的方法提取MaNPC1蛋白。具體步驟：稱取5 g香蕉果皮組織，液氮下研磨成粉，加入20 mL蛋白提取液（含0.1 mmol/L Tris-HCL、1% β-巰基乙醇、0.1% Triton-X100、1 mmol/L PMSF和10% PVP，pH 9.0），4 ℃下15000 r/min離心20 min，收集上清液。MaNPC1蛋白定量采用Bradford法。參考程彥偉等（2008）的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量為7 μg。

1. 2. 9 Western blotting檢測 Western blotting檢測參考張慶嬡等（2020）的方法。具體步驟：待蛋白定量后，取相應(yīng)蛋白與上樣緩沖液混合，經(jīng)沸水浴5 min使蛋白變性，取出后10000 r/min離心1 min，吸取20.0 μL蛋白樣品上樣。參考考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，記錄目的蛋白的位置，以指導(dǎo)轉(zhuǎn)膜時(shí)切膠的位置。采用干法轉(zhuǎn)膜，20 V轉(zhuǎn)膜15 min，用二抗—辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG-HRP。

1. 2. 10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA均參考帥良等（2020）的方法，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MaNPC1基因相對表達(dá)量。以MaCAC為內(nèi)參基因，配制10.0 μL反應(yīng)體系置于Roche Lightcycler? 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，MaNPC1基因相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。所用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物如表1所示。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，使用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MaNPC1基因ORF克隆結(jié)果

以香蕉果皮cDNA為模板、MaNPC1-F1和Ma-NPC1-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得約1600 bp的條帶（圖1）。經(jīng)測序比對分析，發(fā)現(xiàn)該片段為MaNPC1基因ORF序列，長度為1650 bp，共編碼549個(gè)氨基酸殘基。該片段可用于后續(xù)原核表達(dá)載體的構(gòu)建。

2. 2 MaNPC1蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 2. 1 同源比對分析結(jié)果 通過DNAMAN 6.0對3個(gè)香蕉NPC蛋白（MaNPC1、MaNPC2和MaNPC6）進(jìn)行氨基酸序列比對分析，結(jié)果顯示這3個(gè)蛋白的氨基酸序列相似性較高，尤其是中間序列相似性較高，N端和C端相似性較低（圖2），表明中間序列可能存在NPC蛋白的核心序列。

2. 2. 2 理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果 MaNPC1蛋白分子式為C2747H4249N769O793S10，分子量為61.06 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.96，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸含量較高，分別占氨基酸總數(shù)的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%，不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸，不穩(wěn)定指數(shù)為47.14，表明其為不穩(wěn)定蛋白。

2. 2. 3 親/疏水性分析結(jié)果 MaNPC1蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果（圖3）顯示，MaNPC1蛋白的最大親水性指數(shù)為-1.578、最大疏水性指數(shù)為2.079，平均為 -0.348，親水性氨基酸數(shù)目明顯高于疏水性氨基酸，表明為親水蛋白。因此，利用MaNPC1蛋白制備多克隆抗體具有較強(qiáng)的可行性。

2. 2. 4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 MaNPC1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖4所示。MaNPC1蛋白存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其跨膜螺旋（TMhelix）位于第13～32位氨基酸，推測MaNPC1為分泌性蛋白，有利于后續(xù)Wes-tern blotting檢測時(shí)組織蛋白的提取。同時(shí)，其余氨基酸無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，降低了跨膜區(qū)疏水性氨基酸對蛋白折疊的影響，易于表達(dá)和純化。

2. 2. 5 信號肽預(yù)測結(jié)果 MaNPC1蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白存在信號肽的可能性為0.5386（>0.5000），即存在信號肽。最有可能的剪切位點(diǎn)位于第31～32位氨基酸間，AHC-LD可能性為0.2918，與TMHMM預(yù)測獲得的跨膜結(jié)構(gòu)一致。進(jìn)一步說明MaNPC1蛋白為分泌性蛋白，有利于后續(xù)Western blotting檢測時(shí)組織蛋白的提取。

2. 2. 6 亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 對MaNPC1蛋白氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，Ma-NPC1可能定位于細(xì)胞壁或葉綠體。使用PredictProtein對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，Ma-NPC1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占14.57%、延伸鏈占7.1%、無規(guī)則卷曲占78.32%。以SWISS-MODEL預(yù)測MaNPC1蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖6）顯示，MaNPC1蛋白有數(shù)個(gè)由N端構(gòu)成的小突出結(jié)構(gòu)域和由中間序列及C端組成的大結(jié)構(gòu)域組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符，證明三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確。Pfam對結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果如圖7所示。MaNPC1蛋白含1個(gè)典型的磷酸酯酶域（PF04185），具有酯酶活性。

2. 2. 7 抗原指數(shù)分析結(jié)果 由圖8可看出，Ma-NPC1蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)段為第8～15、28～54、60～67、72～78、110～118、126～135、186～198、225～231、265～278、287～304、330～337、363～370、386～401、414～422、434～465、476～484和485～493位氨基酸。這些位點(diǎn)除抗原指數(shù)較高外，多數(shù)還具備較強(qiáng)的親水性，因此，采用MaNPC1蛋白制備多克隆抗體具有較強(qiáng)的可行性。

2. 3 MaNPC1基因表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

由圖9可知，重組質(zhì)粒pGEX-6p-3-MaNPC1經(jīng)雙酶切后得到1650 bp的特異性條帶，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2. 4 重組蛋白表達(dá)及鑒定結(jié)果

由圖10可知，含重組質(zhì)粒pGEX-6p-3-MaNPC1的大腸桿菌Rosetta2（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3和6 h后，沉淀中均產(chǎn)生大量分子量約60 kD（含GST）的目的表達(dá)產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符，而在上清液中未出現(xiàn)大量表達(dá)產(chǎn)物，說明重組蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。

2. 5 多克隆抗體效價(jià)測定結(jié)果

利用直接ELISA對最后一次免疫獲得的動(dòng)物血清樣品進(jìn)行抗體效價(jià)測定，結(jié)果圖11所示。隨著稀釋倍數(shù)的增加，抗體效價(jià)逐漸下降，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶2048000時(shí)1號兔子抗體的OD450與空白孔的OD450比值為2.19，2號兔子抗體的OD450與空白孔的OD450比值為2.12，因此稀釋倍數(shù)1∶2048000為該多克隆抗體的效價(jià)，說明重組蛋白MaNPC1可誘導(dǎo)新西蘭兔產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，抗體效價(jià)較高。

2. 6 Western blotting檢測結(jié)果

由圖12可知，200、100和10 ng重組蛋白的泳道（約60 kD位置）上均出現(xiàn)1條清晰且與陽性血清反應(yīng)的蛋白條帶，其中200 ng重組蛋白條帶最清晰，表明MaNPC1抗血清具有特異的反應(yīng)特性。

2. 7 MaNPC1蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果

由圖13可知，香蕉果實(shí)貯藏過程中MaNPC1蛋白表達(dá)水平呈上升—下降—上升的變化趨勢;炭疽病侵染組MaNPC1蛋白除貯藏15 d時(shí)的表達(dá)水平較對照組低外，其他時(shí)間均略高于對照組。由此可知，炭疽病侵染能提高M(jìn)aNPC1蛋白表達(dá)水平，故推測MaNPC1蛋白參與香蕉果實(shí)抵抗炭疽病侵染。

2. 8 MaNPC1基因相對表達(dá)量的檢測結(jié)果

由圖14可知，MaNPC1基因的相對表達(dá)量在香蕉果實(shí)貯藏過程中呈逐漸上升趨勢;貯藏3～15 d，炭疽病侵染組MaNPC1基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P<0.05）。這與香蕉果實(shí)貯藏過程中炭疽病侵染能提高M(jìn)aNPC1蛋白表達(dá)水平的結(jié)論一致，進(jìn)一步證明MaNPC1基因參與調(diào)控果實(shí)對炭疽病侵染脅迫的響應(yīng)，其表達(dá)產(chǎn)物MaNPC1可提高香蕉果實(shí)抵抗炭疽病侵染的能力。

3 討論

目前，以原核表達(dá)的重組蛋白免疫不同動(dòng)物（兔子和鼠等）制備多克隆抗體已成為一種行之有效且常用的方法（程彥偉等，2008）。此外，通過原核表達(dá)可獲得大量的抗原蛋白，可用于蛋白性質(zhì)和功能、蛋白間相互作用及多種生化功能研究（王增等，2009）。現(xiàn)已研究證實(shí)，磷脂酶在植物的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Laxalt and Munnik，2002;Canonne et al，2011），尤其是NPC在植物防御病原菌脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Scherer et al，2002）。因此，研究香蕉NPC在抵御病原菌脅迫中的作用尤為必要。炭疽病病原菌在果實(shí)生長階段（青果期）就可侵染果實(shí)，以附著孢侵入并以休眠狀態(tài)潛伏于青果上，待果實(shí)成熟采收后才表現(xiàn)癥狀，所以果實(shí)成熟度越高，病害發(fā)生越嚴(yán)重，給香蕉采后的貯藏和運(yùn)輸帶來極大挑戰(zhàn)。本研究通過原核表達(dá)MaNPC1基因并制備多克隆抗體，對其進(jìn)行抗血清效價(jià)測定，并運(yùn)用Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測在炭疽病侵染脅迫下MaNPC1蛋白的表達(dá)水平及MaNPC1基因的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)炭疽病侵染組MaNPC1蛋白表達(dá)水平和MaNPC1基因相對表達(dá)量均高于對照組，表明MaNPC1基因參與調(diào)控果實(shí)對炭疽病侵染脅迫的響應(yīng)，其表達(dá)產(chǎn)物MaNPC1可提高香蕉果實(shí)抵抗炭疽病侵染的能力。Albrecht等（2008）研究也發(fā)現(xiàn)，甜橙在黃龍病脅迫下，與擬南芥AtNPC5基因同源的甜橙CsNPC基因表達(dá)量較對照（無黃龍病脅迫）增加了5倍，說明甜橙植株中CsNPC基因參與抵御黃龍病脅迫;Peters等（2010）通過擬南芥DNA微陣列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在接種病菌的植株中，AtNPC3和AtNPC4基因的表達(dá)量顯著上升，證明擬南芥植株中NPC參與抵御病菌脅迫。

雖然本研究對MaNPC1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括亞細(xì)胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測等，其結(jié)果僅參考，后續(xù)還須通過擬南芥原生質(zhì)體制備、PEG轉(zhuǎn)化及激光共聚焦顯微鏡觀察進(jìn)行亞細(xì)胞定位。此外，本研究僅探究了MaNPC1基因，對于香蕉磷脂酶C基因家族的功能研究還遠(yuǎn)不夠，后續(xù)應(yīng)對整個(gè)香蕉磷脂酶C家族基因進(jìn)行克隆及表達(dá)，進(jìn)一步解析炭疽菌與香蕉磷脂酶C的關(guān)系。

4 結(jié)論

炭疽病侵染能提高M(jìn)aNPC1蛋白表達(dá)水平，故推測MaNPC1蛋白參與香蕉果實(shí)抵抗炭疽病侵染。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）