血腦屏障上有機陰離子轉運多肽的表達、分子調(diào)控及其介導的藥物轉運

王敏，胡冰瑩，孫瑩瑩，韋陽（杭州醫(yī)學院，浙江省神經(jīng)精神疾病藥物研究重點實驗室，杭州 310013）

血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）之間形成了三大屏障，即血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、血腦脊液屏障和蛛網(wǎng)膜屏障，這些屏障為維持CNS的穩(wěn)態(tài)提供了高度可控的微環(huán)境。構成BBB結構基礎的微血管內(nèi)皮細胞（microvascular endothelial cells，MVECs）是介導血液-CNS之間物質(zhì)交換的主要場所，MVECs之間存在緊密連接，限制了離子和其他小的親水性溶質(zhì)通過細胞間隙（細胞旁途徑），因此，腦內(nèi)所需的一些營養(yǎng)分子包括氨基酸、一元羧酸、有機陽離子、己糖、核苷和肽等需要通過跨膜轉運途徑穿過BBB[1]，而相關轉運蛋白的缺乏以及內(nèi)皮細胞囊泡含量低等因素則形成了一種“運輸屏障”。

由于BBB在很大程度上限制了藥物向CNS的轉運，導致很多CNS疾病治療效果不佳甚至無效。因此越來越多的研究人員開始關注如何提高腦內(nèi)病灶部位的有效藥物濃度，改善藥物的治療效果。在大腦皮層，藥物的外排由三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白（ATP binding-cassette，ABC）的成員介導[2]，參與藥物攝取的轉運蛋白則屬于溶質(zhì)轉運蛋白（solute carrier，SLC）家族[3]。BBB上的ABC超家族[如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）]或SLC家族（如有機陰離子轉運多肽）轉運體是改善藥物向大腦輸送的重要靶點。值得注意的是，一些針對P-gp的小分子抑制劑的臨床試驗由于抑制劑本身的毒性或者腦內(nèi)非病灶組織對外源藥物的滲透性增強而產(chǎn)生嚴重的不良反應而失敗。為此，越來越多的人開始關注內(nèi)源性表達的SLC轉運體。

有機陰離子轉運多肽（organic anion transport polypeptides，OATPs/Oatps），作為SLC超家族的一個重要成員，可通過鈉離子非依賴性轉運系統(tǒng)介導大量的兩親性化合物（包括多種藥物）的跨膜轉運。有研究證明，OATPs/Oatps可作為CNS藥物傳遞的潛在靶點，其底物如他汀類藥物，在缺氧、炎癥性疾病以及多發(fā)性硬化癥中具有較好的神經(jīng)保護作用[4]。同時OATPs/Oatps還可介導阿片類鎮(zhèn)痛藥（如deltorphin Ⅱ和DPDPE等）的血腦轉運，從而治療疼痛和腦缺氧[5]。本文旨在探討OATPs/Oatps在BBB上的定位、功能表達、分子調(diào)控機制及其介導的藥物轉運過程，以期為CNS疾病的臨床藥物治療提供新的思路。

1 血腦屏障

BBB由排列在腦微血管的內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接構成，包括基底膜、星形膠質(zhì)細胞、周細胞和神經(jīng)元在內(nèi)的“神經(jīng)血管單位”（neurovascular unit，NVU）也參與了其形成。腦微血管內(nèi)皮細胞外有一層連續(xù)不斷的基底膜，基底膜外又被星形膠質(zhì)細胞終足圍繞形成的膠質(zhì)膜所包圍，而周細胞是嵌入到微血管基底膜中的血管壁細胞，多層膜性結構共同形成了大腦的保護性屏障（見圖1）。

圖1 血腦屏障[9]Fig 1 Blood-brain barrier[9]

越來越多的研究表明，CNS疾病可能與BBB的功能障礙有關，包括一些神經(jīng)退行性疾病[如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）和帕金森病]和與炎癥相關的腦部疾?。ㄈ绺腥尽⒅酗L、血管性癡呆和多發(fā)性硬化癥）等[6-8]。

2 有機陰離子轉運多肽

OATPs/Oatps由溶質(zhì)載體有機陰離子轉運蛋白家族成員基因（solute carrier organic anion transporter family member，SLCO/slco）編碼，目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的OATP包括6個家族（OATP1～6）、12個亞型（OATP1A2、OATP1B1、OATP1B3、OATP1B7、OATP1C1、OATP2A1、OATP2B1、OATP3A1、OATP4A1、OATP4C1、OATP5A1、OATP6A1），關于基因SLCO1B7和轉運體OATP1B7的信息幾乎沒有文獻報道，OATP1B3-1B7（LST-3TM12）是最近發(fā)現(xiàn)的OATP1B家族的新成員，該功能轉運體是由SLCO1B3和SLCO1B7的剪接變異體共同編碼的產(chǎn)物，定位于肝微粒體滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其底物包括硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）和estradiol-17β-D-glucuronide等[10]。OATPs在人體組織中廣泛分布，但有些亞型廣泛表達，有些亞型選擇性表達在某個部位，在細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和藥物的處置方面發(fā)揮著重要作用。

2.1 OATPs/Oatps在BBB的定位與表達

為了進一步優(yōu)化轉運體介導的腦靶向遞藥系統(tǒng)，了解OATPs/Oatps在BBB的定位和功能表達至關重要，人OATPs和嚙齒動物Oatps在基因和蛋白質(zhì)表達以及底物譜方面存在明顯不同。

定位于BBB的OATPs包括OATP1A2、OATP1C1、OATP2B1和OATP2A1。OATP1A2是第一個被鑒定且被證實在BBB中大量表達的OATP亞型，最初在人腦微血管和毛細血管內(nèi)皮細胞的頂端發(fā)現(xiàn)[11-12]，后來證實，在腫瘤和鄰近的健康組織中也有表達[13]，通過觀察大腦皮質(zhì)、小腦和海馬體的石蠟切片，發(fā)現(xiàn)OATP1A2也定位于神經(jīng)元和神經(jīng)元突起[14-15]。相對于其他組織，大腦中 OATP1A2 mRNA的表達水平更高，并且與OATP2B1和P-gp相比，全腦組織裂解液中OATP1A2蛋白豐度更高[14，16]。與OATP1A2相比，OATP2B1的定位似乎僅局限于腦毛細血管的內(nèi)皮細胞的管腔膜側。OATP1C1是BBB處甲狀腺激素（thyroid hormones，THs）的高親和力雙向轉運體，研究發(fā)現(xiàn)OATP1C1分布在放射狀膠質(zhì)細胞、腦屏障、Cajal-Retzius細胞、腦干的遷移纖維以及一些具有特殊和復雜時空模式的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中[17]。OATP1C1在BBB中的表達具有明顯的物種差異性，在大鼠和小鼠的微血管內(nèi)皮細胞上高度富集，而在人腦微血管內(nèi)皮細胞上表達量甚微。除此之外，OATP1C1還定位在脈絡層上皮細胞的基底側[18]。OATP2A1，也被稱為甲狀腺素轉運體，在全身組織包括大腦中廣泛表達，目前已在腦額回神經(jīng)元中檢測到其蛋白水平的表達，但其在BBB中的具體定位尚不清楚。

嚙齒類動物BBB中主要表達3種Oatp亞型：Oatp1c1、Oatp2a1和Oatp1a4[19-21]。Admati等[21]通過Oatp1c1 mRNA探針和抗-EGFP抗體對轉基因魚進行了雙ISH/免疫組化，發(fā)現(xiàn)Oatp1c1在BBB的微血管內(nèi)皮細胞的頂端和基底側均有表達，同時也定位在特定腦區(qū)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。Kis等[22]研究表明，Oatp2a1定位在腦內(nèi)皮細胞的管腔膜側，其在BBB內(nèi)皮細胞中的表達量低于其在星形膠質(zhì)細胞、周細胞和脈絡層上皮細胞中的表達。Oatp1a4是人OATP1A2在BBB上的功能性同源物，但與OATP1A2不同，Oapt1a4定位于BBB微血管內(nèi)皮細胞的頂端和基底外側膜[23]，這意味著它可能還充當著外排轉運體的功能[13，23]詳見表1和圖2。

表1 OATPs/Oatps在BBB的定位及其底物Tab 1 Localization and substrates of OATPs/Oatps at the BBB

圖2 OATPs/Oatps在BBB的定位Fig 2 Localization of OATPs/Oatps at the BBB

2.2 OATPs/Oatps的分子調(diào)控

要實現(xiàn)將OATPs/Oatps轉運體作為增強CNS藥物傳遞載體的目標，需要對其分子調(diào)控機制進行深入了解。遺傳多態(tài)性、翻譯和翻譯后調(diào)控以及與誘導劑或抑制劑的相互作用都有可能導致OATPs轉運功能的改變。

2.2.1 OATP1A2和Oatp1a4 近年來，有關OATP1A2分子調(diào)控的研究越來越多，其啟動子中含有一個PXR反應元件，可通過與PXR結合，促進SLCO1A2的轉錄和翻譯[30]。位于SLCO1A2轉錄起始位點上游－1836～－1845 bp處有一個核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）的可能結合位點，并且腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可通過NFκB的負性調(diào)控進而抑制SLCO1A2的轉錄[31]。OATP1A2的翻譯后過程受到一組激酶，包括蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）和AMP依賴的蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）的復雜調(diào)控，PKC通過網(wǎng)格蛋白依賴性途徑介導蛋白內(nèi)化來調(diào)節(jié)OATP1A2的轉運功能[32]，CK2通過調(diào)節(jié)其在質(zhì)膜上的定位，在優(yōu)化OATP1A2功能中起著關鍵作用[33]，而AMPK則可調(diào)控OATP1A2的亞細胞定位和蛋白穩(wěn)定性[34]。PDZ蛋白，特別是盤狀同源區(qū)域蛋白1（PDZ domain containing 1，PDZK1）和鈉氫交換調(diào)控因子1（Na＋/H＋exchanger regulatory factor 1，NHERF1），通過與OATP1A2 C端的PDZ結合域直接相互作用激活OATP1A2功能[35]。

OATP1A2的轉運活性還受pH值的影響，在pH 6.0條件下，OATP1A2介導的0.3 mmol·L－1雌酮3-硫酸鹽的攝取率比在pH 7.4時高6.6倍[36]。缺血和再灌注對OATP1的表達和功能也具有調(diào)節(jié)作用，細胞暴露于糖氧剝奪條件2 h后，OATP1的表達顯著增加[37]。Thompson等[38]也發(fā)現(xiàn)在缺氧1 h后的30 min復氧期間，大鼠體內(nèi)Oatp1a4的表達增加，而在較長的復氧過程中，Oatp1a4的表達卻降低，因此研究缺血再灌注過程中OATP1表達的分子調(diào)節(jié)機制具有重要的意義。

已有研究證實TGF-β/ALK1信號激動劑BMP-9可增強大鼠腦微血管中Oatp1a4的功能性表達，而高選擇性ALK5抑制劑SB431542也可促進Oatp1a4介導的轉運過程，這表明Oatp1a4轉運功能可由通過ALK1和ALK5跨膜受體介導的TGF-β信號轉導調(diào)節(jié)[24，39]。

2.2.2 OATP2B1 Pomari等[40]研究表明，驅(qū)動SLCO2B1轉錄的啟動子具有組織特異性。不同的啟動子啟動不同SLCO2B1轉錄本的表達。這些OATP2B1變體使用5個不同的第一外顯子（1a，1b，1c，1d和1e）和相關的啟動子，但共享后續(xù)的外顯子（外顯子2～14）。通過分析SLCO2B1的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)5'側翼區(qū)域包含一個順式作用元件GC盒，它可與轉錄因子Sp1結合并控制來自肝臟和小腸的幾種細胞系的SLCO2B1表達[41]。肝細胞核因子4-α（hepatocyte nuclear factor 4-alpha，HNF4α）可 與SLCO2B1-1e近 端啟動子的某一區(qū)域結合激活其轉錄過程[42]。在HepaRG細胞中，MicroRNA-24的表達水平與OATP2B1 mRNA、蛋白質(zhì)和HNF4αmRNA的表達水平呈負相關，這表明MicroRNA-24不僅抑制OATP2B1的翻譯過程，而且可通過降解HNF4αmRNA抑制OATP2B1的轉錄過程[43]。抑瘤素M（OSM）是白細胞介素-6（IL-6）家族的一員，可以下調(diào)人肝細胞中OATP2B1的mRNA水平[44]。

除了特征明確的轉錄修飾外，翻譯后修飾也會影響轉運蛋白的定位和活性。OATP2B1的轉運功能易受細胞外環(huán)IX-X半胱氨酸殘基變化的影響[45]，OATP2B1中共有6個色氨酸殘基，即W272、W276、W277、W523、W611和W629，位于跨膜結構域11（transmembrane domain 6，TM11）的W611是影響OATP2B1轉運功能的關鍵部位，而位于第三細胞外環(huán)和TM6交界處的W272、W276和W277對OATP2B1的轉運功能也起到一定的影響[46]。OATP2B1的C端含有PDZ結合基序，PDZK1蛋白可通過與該區(qū)域結合調(diào)控其在細胞中的定位、表達和功能[47]。同源建模顯示OATP2B1 TM1以及N端末端的TM2，4和5可能位于底物結合口袋內(nèi)，對維持轉運蛋白的攝取功能非常重要[48]。此外，第51位的苯丙氨酸（F51）似乎在OATP2B1的正確折疊中起著重要作用，因為F51的替代可能會導致轉運蛋白的加速降解[48]。有研究表明OATP2B1可通過PKC介導的網(wǎng)格蛋白內(nèi)在化，隨后被胞內(nèi)溶酶體靶向降解[49]。

2.3 OATPs/Oatps介導的CNS藥物轉運

2.3.1 抗AD藥 目前普遍認為AD患者一個特征性的病理改變是β-淀粉樣蛋白（Aβ）在大腦中不斷積累。有研究表明，作為Oatp1a4底物的瑞舒伐他汀和?；悄懰猁}可通過原位腦灌注降低小鼠大腦中的Aβ水平[50]。隨著病情的加重，AD大鼠腦毛細血管中的Oatp1a4的表達量呈下降趨勢[51]，這在一定程度上影響了相關底物藥物進入腦內(nèi)病灶區(qū)發(fā)揮作用。

2.3.2 治療缺血性腦中風的藥物 阿片肽Biphalin在缺血性腦中風時可提供神經(jīng)保護作用，他汀類藥物與中風后早期的神經(jīng)功能改善相關，而OATP1A2和Oatp1a4可介導阿片肽Biphalin和他汀類藥物在BBB的轉運過程，并且缺血再灌注期間OATP1表達的增加可以改善阿片肽Biphalin或其他與OATP1有親和力的潛在腦缺血治療藥物的腦部運輸[5，37-38]。

2.3.3 抗腦部腫瘤藥 越來越多的證據(jù)表明，OATPs在各種類型的癌癥中的表達會發(fā)生改變，在蛋白質(zhì)水平上，OATP1A2和OATP2B1在形成BBB和血腦腫瘤屏障的內(nèi)皮細胞的管腔膜以及膠質(zhì)母細胞瘤細胞中均有表達，可介導一些化療藥物輸送到腫瘤部位[13，52]。AZD1775是一種酪氨酸激酶Wee1的小分子抑制劑，是治療膠質(zhì)母細胞瘤的潛在化療和放射增敏劑。在相對酸性的腫瘤微環(huán)境中，AZD1775主要通過OATP1A2介導的主動攝取過程進入腦腫瘤細胞[53]。越來越多的化療藥物被證明由OATP1A2和OATP2B1介導轉運，OATP1A2介導甲氨蝶呤（MTX）的轉運過程具有飽和性和pH依賴性，在細胞外酸性環(huán)境中，其轉運速率可提高7倍[54]。除此之外，OATP1A2介導轉運的化療藥物還包括伊立替康、阿霉素等，而SN-38（伊立替康的活性代謝產(chǎn)物）、厄洛替尼則由OATP2B1轉運。

2.3.4 抗抑郁藥 圣約翰草可用于治療輕度抑郁癥，金絲桃苷是圣約翰草的主要活性成分之一，通過激活核受體中的孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）從而增強CYP3A4的表達，在合并用藥過程中可能引起嚴重的藥物-藥物或食物相互作用，限制了其臨床使用。金絲桃苷作為OATP2B1的底物，可通過OATP2B1跨膜轉運，因此OATP2B1可增加金絲桃苷的細胞攝取量，從而增強PXR的活化[55]。

2.3.5 抗癲癇藥 在慢性癲癇大鼠的大腦中，Oatp1a4的蛋白水平顯著降低，而mRNA水平不變，這表明慢性癲癇可能影響了Oatp1a4的轉錄后過程[56]。丙戊酸鈉是臨床上最常用的抗癲癇藥，研究表明Oatp1a4參與了丙戊酸鈉在血腦屏障處的轉運，并且改變Oatp1a4的表達可能改善耐藥癲癇患者對丙戊酸鈉的耐藥性[57]。

2.3.6 OATPs/Oatps的基因多態(tài)性對藥物轉運的影響 很多研究表明SLCO的基因多態(tài)性通過影響藥物轉運，從而顯著改變其底物藥物的藥理和毒理反應。Angelini等[58]報道了接受伊馬替尼治療的189例慢性粒細胞白血病患者的主要反應與包括OATP1A2在內(nèi)的幾種SLC轉運體的遺傳變異之間存在顯著關系。Zhou等[59]在一組受試者中鑒定了SLCO1A2的5個新的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）：G550A、G553A、G673A、A775C和G862A，它們分別編碼OATP1A2變體E184K、D185N、V255I、T259P和D288N。通過HEK293細胞評估這些變體轉運蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)新的變異 體E184K、D185N、T259P和D288N對 底 物藥物雌酮-3-硫酸酯、伊馬替尼和MTX的轉運量明顯降低，僅為野生型的20%～50%。此外，SLCO1A2的遺傳變異也可能是類風濕關節(jié)炎患者MTX毒性產(chǎn)生的危險因素。Wang等[60]用二元Logistic回歸分析了SLCO1A2遺傳變異與MTX毒性的關系，結果顯示，550AA基因型與MTX毒性相關，并且H3（H3＝AG）患者產(chǎn)生MTX毒性的風險較高。另一項體外研究也表明，相對于野生型，OAP1A2*3（A516C，E172D）和*6（A404T，N135I）變異體對3種測試底物即雌酮-3-硫酸酯、deltorphin Ⅱ和DPDPE的轉運活性均顯著降低[12]。

OATP2B1 rs2306168（1457C＞T）是一種錯義突變，與野生型相比，其轉運活性降低50%。據(jù)報道，非索非那定在體內(nèi)的消除受到OATP2B1 rs2306168的顯著影響，具有C等位基因的受試者體內(nèi)非索非那定曲線下面積（AUC）顯著降低[61]。另一項研究表明，與野生型受試者相比，具有SLCO2B1c.* 396T＞C變異體的受試者伏立康唑的口服吸收慢且生物利用度降低[62]。

這些數(shù)據(jù)表明SLCO1A2和SLCO2B1的基因多態(tài)性可能是藥物處置和進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的個體間變異性的一個重要的因素。因此，與OATP1A2和OATP2B1相關的遺傳變異不僅會影響內(nèi)源性和外源性化合物在外周器官（如腎臟、腸道）中的分布，還會改變向關鍵組織區(qū)室（如大腦）輸送藥物的程度，從而導致藥物反應性的個體間差異。

3 總結與展望

自從Oatp基因被發(fā)現(xiàn)以來，有機陰離子轉運多肽一直是研究者的關注點，人體相關的OATPs至今發(fā)現(xiàn)了12個亞型，其中OATP1B3-1B7尚未完全被確證。確認的11個OATP亞型影響著人體的生理功能，且在特定條件下可能成為疾病形成的關鍵因素。OATPs參與藥物的轉運，并有可能成為藥物治療的功能靶點。因此，對OATPs分布及功能的深入研究，對新藥研發(fā)有重要的意義。

藥物穿過BBB并在CNS內(nèi)獲得有效濃度的能力取決于多種轉運機制。這些機制包括通過內(nèi)流轉運體進入大腦和由外排轉運體介導的外流過程。筆者總結了定位于BBB的OATPs/Oatps的表達，分子調(diào)控及其介導的藥物轉運過程，這為優(yōu)化神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物治療提供了新的靶點，包括TGF-β信號通路、核受體系統(tǒng)等。同時，發(fā)現(xiàn)細胞間信號通路存在復雜的相互作用，如ALK1和ALK5受體不僅參與調(diào)節(jié)Oatp1a4的轉運活性，還與P-gp的功能調(diào)節(jié)有關[63]，這些對于研究Oatp1a4和P-gp共同底物的轉運具有重要意義。

此外，必須意識到，在BBB中高表達的OATPs/Oatps也定位在外周的其他器官，并且參與藥物處置過程。例如，定位在腎小管上皮細胞頂端側的OATP1A2參與底物藥物的分泌[64]，肝臟中表達的Oatp1a4則參與底物藥物的代謝[65]，因此，需重點關注OATPs/Oatps表達的組織差異性以及調(diào)控其表達的下游信號之間的分岔點，使得治療CNS疾病的藥物更少地在外周被代謝和分泌。目前，大部分研究只關注CNS疾病發(fā)生和發(fā)展過程中BBB處藥物轉運體的改變，卻忽略了外周器官如肝臟、腎臟和小腸等部位關鍵藥物轉運體以及代謝酶的變化。有研究表明，在AD小鼠腎臟中，多藥耐藥相關蛋白2（MDR2）、OAT3和OCT2的蛋白表達分別上調(diào)1.6、1.3和1.4倍[66]，這些改變可能會影響藥物在外周的吸收、分布、代謝和排泄過程，最終影響進入CNS的有效藥物濃度。

在大腦發(fā)育過程中，轉運體蛋白的含量也在不斷變化，如在腦毛細血管發(fā)育過程中Oatp1c1蛋白表達的上坡型變化可能滿足了大腦正常發(fā)育對足夠甲狀腺激素的需求[67]。此外性別也可能會影響轉運體的表達，與雄性大鼠相比，雌性大鼠腦微血管Slco1a4mRNA和Oatp1a4蛋白表達增加，但在青春期前大鼠中未觀察到腦微血管Oatp1a4表達的性別差異性[68]。最后，轉運體介導藥物的轉運存在立體選擇性，一項臨床研究表明，單劑量攝入蘋果汁（含一種OATP2B1的有效抑制劑），可使其底物藥物非索非那定AUC0～24（R構型）/AUC0～24（S構型）從1.49增加到2.00[69]。因此，未來在CNS疾病的治療過程中，必須充分考慮到相關的生物變量，包括患者的年齡、性別和手性藥物轉運中的立體選擇性等，這有助于最大限度地發(fā)揮藥物的治療效果。