創(chuàng)傷性股骨頭壞死m(xù)iRNA-蛋白組學聯(lián)合分析△

黃世金，張 穎，韓 超，劉成業(yè)，秦崇臻，盧瑤瑤，柴玉娜*

［1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450052；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）髖部疾病研究治療中心，河南洛陽 471002；3.河南科技大學第三附屬醫(yī)院洛陽東方醫(yī)院骨科，河南洛陽 471003；4.鄭州大學醫(yī)學科學院，河南鄭州 450052］

創(chuàng)傷性股骨頭壞死（trauma-induced osteonecro?sis of the femoral head,TIONFH）一般由股骨頭頸骨折、髖臼骨折、髖關(guān)節(jié)脫位等引起。目前認為其主要的影響因素為患者年齡、骨折分型和復(fù)位質(zhì)量。該病預(yù)后較差，若無早期干預(yù)，則可能導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及塌陷，導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙［1］。

成骨細胞和破骨細胞的平衡對于骨形成和骨重構(gòu)具有關(guān)鍵作用［2，3］。最新研究發(fā)現(xiàn)一些非編碼RNA及靶向分子對成骨細胞和破骨細胞的生物學功能具有重要的調(diào)控作用［4～6］。血液成分是骨細胞生長的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，探索TIONFH外周血中特異性微小RNA（miRNA）靶向的蛋白分子，可能為TIONFH的發(fā)病機制提供新的證據(jù)。

本研究聯(lián)合miRNA芯片和蛋白質(zhì)組學技術(shù)對TIONFH患者外周血樣本中的差異分子進行鑒定，以期篩選出特異性miRNAs調(diào)控的差異化蛋白分子，為TIONFH的表觀遺傳機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）年齡在20～55歲之間；（2） 股骨頸骨折經(jīng)皮空心螺釘內(nèi)固定術(shù)治療>2年，出現(xiàn)股骨頭壞死；（3）符合《成人股骨頭壞死診療標準專家共識（2012年）》。

排除標準：（1）合并全身性疾病或者關(guān)節(jié)疾病的患者；（2）隨訪時間<2年。

1.2 一般資料與標本采集

按照以上納入和排除標準篩選股骨頭壞死患者10人（疾病組），另外選取10例股骨頸骨折非壞死患者（對照組）。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組患者均簽署知情同意書［4，7］。

受試者于空腹狀態(tài)下抽取肘部靜脈血2管，離心取血漿，立即于-80℃保存，分別用于miRNA芯片和蛋白組學的檢測。

1.3 特異性miRNAs靶基因預(yù)測

前期通過芯片技術(shù)篩選并驗證出TIONFH血漿中8個顯著差異的 miRNAs［7］，5個上調(diào)的 miRNAs為hsa-miR-93-5p、hsa-miR-7i-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-25-3p；3 個下調(diào)的miRNAs 為 hsa-miR-122-5p、hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-3191-5p。通過miranda microscom以及tar?getscan三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因，通過維恩分析取三個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果的交集。

1.4 蛋白組學分析

蛋白提取和酶解：各樣品分別加入裂解液，4℃，2 000 g離心10 min，取上清加入三氯乙酸，靜置后4℃，12 000 g離心3 min，用丙酮洗滌后，沉淀用8 M尿素復(fù)溶，最后用BCA蛋白試劑盒進行定量。加入胰酶，37℃酶解過夜。胰酶酶解的肽段用Strata X C18除鹽后真空冷凍干燥。以0.5 M TEAB溶解肽段，根據(jù)TMT試劑盒操作說明標記肽段。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析：肽段用高pH反向HPLC分級。隨后肽段合并為18個組分，合并后的組分經(jīng)真空冷凍干燥。肽段用液相色譜流動相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進質(zhì)譜進行分析。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant（v1.5.2.8）進行檢索。

數(shù)據(jù)通過R（version 3.6.2）中l(wèi)imma包計算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 生物信息學分析

聚類分析：使用分層聚類方法做單邊聚類分析，聚類關(guān)系使用R語言包gplots中的函數(shù)heatmap.2繪制出熱圖。KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway）富集：使用KEGG在線服務(wù)工具KAAS對提交的蛋白進行注釋，之后通過KEGG mapper將注釋過的蛋白匹配入數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的通路中。通路的富集分析采用KEGG數(shù)據(jù)庫進行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)miRNA反向調(diào)控靶基因的規(guī)律，將TION?FH中上調(diào)miRNAs的靶基因與蛋白組學中下調(diào)的蛋白進行關(guān)聯(lián)，將下調(diào)miRNAs的靶基因與蛋白組學中上調(diào)的蛋白進行關(guān)聯(lián)，然后取交集。

2 結(jié) 果

2.1 特異性miRNAs的靶基因及KEGG通路

對TIONFH中8個特異性miRNAs進行靶基因預(yù)測，結(jié)果顯示上調(diào)miRNAs有609個靶基因，如圖1a；下調(diào)miRNAs有37個靶基因，如圖1b。經(jīng)過KEGG信號通路富集分析，依據(jù)-log10（P value）將富集最顯著的前10條信號通路分別展示，如圖1c和1d。結(jié)果顯示，這些靶基因在MAPK、PI3K-Akt等重要的信號通路上顯著富集。

圖1 TIONFH血漿特異性miRNAs的靶基因及富集的信號通路 1a:上調(diào)miRNAs的靶基因 1b:下調(diào)miRNAs的靶基因 1c:上調(diào)信號通路 1d:下調(diào)信號通路

2.2 蛋白組結(jié)果及KEGG通路

在這項研究中共鑒定到905個蛋白，其中652個包含定量信息。如果以P<0.05為標準，檢測到差異化表達蛋白115個，其中上調(diào)蛋白23個，下調(diào)蛋白92個，如圖2a。將115個蛋白進行KEGG信號通路富集，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白富集在補體系統(tǒng)等3條信號通路，如圖2b；下調(diào)蛋白富集在蛋白酶體等11條信號通路，如圖2c。

圖2 TIONFH血漿蛋白組學分析 2a:115個差異表達的蛋白的聚類圖（紅色代表富集程度強，藍色代表富集程度弱）2b:上調(diào)信號通路 2c:下調(diào)信號通路（Disease：疾病組；Normal：對照組）

2.3 關(guān)聯(lián)分析

將上調(diào)的miRNA的靶基因與下調(diào)的蛋白數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，將下調(diào)的miRNA的靶基因與上調(diào)的蛋白數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，得到22個共性蛋白分子，其中電壓依賴性陰離子選擇性通道1（voltage-dependent anion-selective channel protein 1,VDAC1）、26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)控亞基 （26S proteasome non-ATPase regulatory sub?unit 14,PSMD14）、膜棕櫚?；鞍祝╩embrane-pal?mitoylated protein 1,MPP1）和磷酸核糖焦磷酸激酶（ribose-phosphate pyrophosphokinase 1,PRPS1） 4個蛋白分子有顯著差異。VDAC1受到miR-7i-5p、miR-16-2-3p、miR-320a和miR-93-5p共同靶向調(diào)控；PSMD14受到miR-16-2-3p和miR-25-3p共同靶向調(diào)控；PRPS1受到miR-7i-5p和miR-320a共同靶向調(diào)控；MPP1受到miR-25-3p靶向調(diào)控。4個蛋白分子與miRNAs的表達呈反向關(guān)系（符合miRNAs對靶向分子的調(diào)控規(guī)律），如表1。22個共性蛋白參與的信號通路有：破骨細胞分化通路、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路、蛋白質(zhì)水解泛素化通路等，如表2。

表1 特異性miRNAs靶基因和差異蛋白的關(guān)聯(lián)分析

表2 共性蛋白分子及參與的信號通路

3 討論

研究證明，miRNAs在骨形成和骨重構(gòu)中有重要作用，它們通過對成骨細胞和破骨細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控功能［4～6］，但是在TION?FH中的研究尚不充分。本研究結(jié)合前期基于miR?NAs芯片技術(shù)的研究成果，關(guān)聯(lián)蛋白組學的數(shù)據(jù)，篩選出特異性8個miRNAs調(diào)控的蛋白分子VDAC1、PSMD14、PRPS1和MPP1等，并梳理出相關(guān)的重要信號通路，分析結(jié)果初步揭示了這些特異性分子在TIONFH中可能的作用。

VDAC1是一種β桶蛋白，在人類中由位于5號染色體上的VDAC1基因編碼。在真核細胞中，線粒體負責ATP合成細胞存活所需的其他代謝物，而VDAC1在線粒體外膜和細胞膜中形成離子通道，允許線粒體和細胞之間的通信，從而介導(dǎo)細胞代謝和細胞死亡之間的平衡。高表達VDAC1可使線粒體自噬水平增強，導(dǎo)致NLRP3炎癥體的活化被抑制，保護細胞生物學功能不受損害［8］。結(jié)合本研究結(jié)果VDAC1在TIONFH中血漿的含量顯著降低，可以初步推測VDAC1可能在TIOFNH中起保護作用。VDAC1能夠通過增加鈣離子水平導(dǎo)致線粒體膜電位破壞，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［9］。雖然有報道TIONFH的早期發(fā)病過程與骨細胞凋亡有關(guān)［10］，但VDAC1是否參與了TIONFH的細胞凋亡尚需進一步研究證明。關(guān)聯(lián)分析顯示，VDAC1是多個miRNAs的靶基因，進一步提示VDAC1在TIONFH中可能與多種非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。

PSMD14是一種金屬蛋白酶，屬于26S蛋白酶體的重要組分。蛋白酶體參與許多細胞過程，包括細胞周期進程、細胞凋亡或DNA損傷修復(fù)。PSMD14亞基可以調(diào)節(jié)特定蛋白質(zhì)的去泛素化從而來影響其穩(wěn)定性，進而影響細胞的功能狀態(tài)［11］。已有報道PSMD14與腫瘤免疫相關(guān)［12］。本研究顯示該蛋白在TIONFH中含量降低，同時受到hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-25-3p的調(diào)控，具體機制有待進一步探明。

PRPS1是核酸合成的重要限速酶，對嘌呤、嘧啶相關(guān)的合成、代謝有重要作用，同時能夠影響細胞能量代謝。PRPS1基因突變可引起腫瘤對代謝類化療藥物的耐藥以及多種臨床綜合征［13］，如聽力損失、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良等。近些年逐漸有miRNA調(diào)控PRPS1基因轉(zhuǎn)錄在疾病中的相關(guān)報道［14，15］，進一步揭示了PRPS1的相關(guān)作用機制。本研究分析顯示hsamiR-7i-5p和hsa-miR-320a對PRPS1有調(diào)控作用，初步揭示了PRPS1在TIONFH中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

MPP1是中性粒細胞的調(diào)節(jié)器，通過調(diào)節(jié)AKT1的磷酸化來調(diào)控中性粒細胞極性從而發(fā)揮生物學功能［16］。本研究分析表明：MPP1是hsa-miR-25-3p的靶基因，并且在TIONFH血漿中含量降低。但是該分子的相關(guān)報道較少，還需要進一步的探索。

特異性miRNA靶基因和差異蛋白關(guān)聯(lián)分析顯示，差異的miRNA調(diào)控的蛋白分子參與多條重要信號通路，如破骨細胞分化通路、Wnt信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、鈣信號通路等。已知Wnt信號能夠調(diào)控成骨細胞分化［17］，并且在破骨細胞形成中的作用也逐漸被揭示［18］；而PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等亦為股骨頭壞死機制研究中的重要通路，已經(jīng)成為治療或者干預(yù)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的切入點［19，20］。這些結(jié)果提示，上述信號通路有可能在TIONFH中也有重要作用，值得進一步挖掘驗證。

本研究結(jié)果顯示，特異性miRNAs調(diào)控的VDAC1、PSMD14、MPP1、PRPS1等蛋白分子可能參與了TIONFH的發(fā)病過程，為TIONFH的表觀遺傳機制提供了新的信息。但是它們參與TIONFH的具體作用機制還需進一步證明。