右美托咪啶減輕急性肺損傷的機(jī)制研究

李 潔,何鳳娟,范國華

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430061；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院乳甲外科，湖北 武漢 430061)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)以彌漫性肺泡損傷、肺通透性增加和富含蛋白質(zhì)的肺水腫為特征[1]。感染、缺血再灌注損傷和外傷已經(jīng)被證實(shí)是導(dǎo)致ALI最常見的原因。在膿毒癥誘導(dǎo)的ALI中，紊亂的炎癥導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷甚至死亡，最終可誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)甚至死亡[2-4]。鐵死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡形式，是一種鐵依賴的以脂質(zhì)過氧化為主要特征的細(xì)胞程序性死亡。轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一系列抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄因子，具有抑制細(xì)胞鐵死亡的作用[5]。既往研究顯示，膿毒血癥可導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的鐵死亡，加重ALI[6]。因此，以激活肺組織Nrf2并降低鐵死亡水平為目標(biāo)進(jìn)行干預(yù)是預(yù)防和治療ALI的重要策略。

右美托咪啶(dexmedetomidine，Dex)是一種高效的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛雙重作用。既往研究顯示，Dex還具有多種器官保護(hù)作用[7]。研究顯示，Dex可通過激活中樞α2-腎上腺素受體減輕膿毒癥相關(guān)的炎癥和認(rèn)知功能障礙[8]。同時(shí)，Dex還可通過線粒體自噬減輕七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[9]。此外，Dex預(yù)處理可通過激活Nrf2減輕心肌缺血再灌注引起的急性腎損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10]。Dex也被報(bào)道可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗ALI的作用，包括抑制炎癥小體激活、維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡、抑制上皮細(xì)胞凋亡等[11-12]。但Dex是否可以通過激活Nrf2減輕肺組織鐵死亡目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的方式構(gòu)建小鼠ALI模型,同時(shí)觀察Dex干預(yù)對小鼠ALI的影響，檢測Dex干預(yù)后ALI小鼠肺組織鐵死亡標(biāo)志物及Nrf2蛋白的水平，以探討Dex對小鼠ALI的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

脂多糖(批號(hào)：HY-D1056-100201)、Dex(批號(hào)：HY-17034A-15387，純度:98.54%)均購自Medchem Express公司；蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司)；一抗：GAPDH(批號(hào)：ab8245)、胱甘肽過氧化物酶(GPX4，批號(hào)：ab125066)、環(huán)氧合酶(COX2，批號(hào)：ab179800)、Nrf2(批號(hào)：ab62352)、羊抗兔IgG(批號(hào):ab124055)均購自美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周，體質(zhì)量225～270 g，由湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。將小鼠隨機(jī)分為空白對照組(Sham組)、右美托咪啶組(Dex組)、脂多糖組(LPS組)和藥物干預(yù)組(LPS+Dex組)。LPS組和LPS+Dex組小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS構(gòu)建小鼠ALI模型[13]；Dex組及LPS+Dex組小鼠腹腔注射Dex(40 μg/kg)；Sham組和LPS組注射等劑量生理鹽水[6]。12 h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速分離小鼠左肺與右肺，并將其分別置于10%中性福爾馬林溶液和-80 ℃凍存。

1.3 HE染色

左肺樣本在10%中性福爾馬林溶液中固定7 d后，用石蠟包埋并切片。將肺組織石蠟切片于60 ℃下烤片后，于二甲苯和梯度酒精中脫蠟并水化。蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織的形態(tài)。小鼠肺損傷程度依據(jù)肺水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、出血、肺不張和透明膜的形成等5項(xiàng)指標(biāo)分別進(jìn)行評分：0分，肺血管、肺泡、間質(zhì)及支氣管均正常；1分，病變范圍小于整個(gè)視野面積；2分，病變范圍為整個(gè)視野面積的25%～50%；3分，病變范圍為整個(gè)視野面積的50%～75%；4分，病變范圍大于整個(gè)視野面積的75%。

1.4 qRT-PCR檢測相關(guān)促炎基因的表達(dá)

使用RNeasyMini Kit試劑盒提取小鼠右肺組織中總RNA，通過紫外分光光度法檢測總RNA樣本濃度和純度，并通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將各樣本的cDNA分別配制好實(shí)時(shí)定量PCR體系，并于實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω鳂颖灸康幕蜻M(jìn)行校正。各基因qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

提取各組小鼠右肺組織總蛋白，隨后將其于80～120 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE電泳。100 min后，將凝膠中的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1.5 h，隨后分別用抗GPX4(1∶500)、COX2(1∶200)、Nrf2(1∶500)及GAPDH(1∶1 000)的一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，用二抗(羊抗兔)稀釋液(1∶5 000)于室溫避光孵育50 min。孵育結(jié)束后，使用Odyssey掃膜儀對各蛋白條帶進(jìn)行掃描并定量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白對各樣本目的蛋白進(jìn)行校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果對比

與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的病理學(xué)損傷，表現(xiàn)為肺水腫，肺泡腔炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤，其肺損傷評分明顯升高(4.21±0.43vs.1.09±0.54，P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺損傷明顯減輕且肺損傷評分明顯降低(2.11±0.36vs.4.21±0.43，P<0.05)，見圖1。

*：與Sham組比較,P<0.05；#：與LPS組比較,P<0.05

2.2 各組小鼠肺組織促炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較

與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中促炎性細(xì)胞因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 和MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表2，表明Dex可減輕ALI小鼠肺組織炎癥反應(yīng)。

表2 各組小鼠肺組織促炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較

2.3 各組小鼠肺組織鐵死亡水平比較

Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中GPX4的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而COX2的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺組織中GPX4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而COX2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖2，表明Dex可抑制ALI小鼠肺組織鐵死亡。

*：與Sham組比較,P<0.05；#：與LPS組比較,P<0.05

2.4 各組小鼠肺組織Nrf2蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見圖3。

*：與Sham組比較,P<0.05；#：與LPS組比較,P<0.05

3 討論

肺是哺乳動(dòng)物與外界環(huán)境直接接觸的最大上皮表面，是氣體交換的主要器官。同時(shí)，肺也是機(jī)體重要的免疫器官，肺組織中存在一定量的免疫細(xì)胞，一旦受到外界刺激可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[14-15]。由于與外界環(huán)境的直接接觸，肺也更容易受到外界病原體和毒害物質(zhì)的攻擊，易發(fā)生ALI甚至ARDS。ALI是機(jī)體對嚴(yán)重肺部微生物感染的反應(yīng)，是免疫識(shí)別病原體引起的促炎免疫反應(yīng)的結(jié)果。ALI可引起局部或全身不可逆的損傷，造成富含蛋白質(zhì)的液體靜力性肺水腫、難治性低氧血癥、呼吸困難，甚至死亡[16]。本研究結(jié)果顯示，LPS(10 mg/kg)注射12 h可誘發(fā)明顯的小鼠肺損傷和炎癥反應(yīng)；同時(shí)，LPS組小鼠肺組織中鐵死亡水平較Sham組小鼠明顯升高，表明LPS可誘發(fā)小鼠肺組織的鐵死亡。而40 μg/kg Dex可明顯減輕小鼠肺損傷和炎癥反應(yīng)，同時(shí)降低小鼠肺組織鐵死亡水平；且Dex可明顯上調(diào)小鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達(dá)，因此，我們推測Dex發(fā)揮肺保護(hù)作用及抑制鐵死亡的作用可能與Nrf2的激活有關(guān)。

Nrf2是一種細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控抗氧化和親電應(yīng)激的基因表達(dá)。許多疾病的發(fā)生與細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡有關(guān)，說明抗氧化防御系統(tǒng)在防止與活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)積累相關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用[5]。近年來，越來越多的研究證實(shí)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物是誘發(fā)實(shí)體器官損傷的重要驅(qū)動(dòng)因素[17-18]。鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的新型細(xì)胞死亡方式[19]。Nrf2已經(jīng)被證實(shí)可通過多種機(jī)制抑制鐵死亡，包括調(diào)控鐵代謝基因、中間代謝基因及谷胱甘肽合成相關(guān)基因。研究表明，Nrf2激活可通過抑制肺上皮細(xì)胞鐵死亡減輕LPS及缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠ALI[5]。GPX4可在谷胱甘肽的輔助下通過催化作用去除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，減輕細(xì)胞鐵死亡。GPX4的抑制或敲除可使細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生鐵死亡。COX2是炎癥反應(yīng)重要的誘導(dǎo)酶，同時(shí)也是鐵死亡重要且敏感的標(biāo)志蛋白之一[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可明顯抑制小鼠肺組織中Nrf2和谷胱甘肽過氧化物酶GPX4表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)肺組織中COX2的表達(dá)。

Dex是一種脂溶性α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，1999年首次作為鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物應(yīng)用于臨床[7]。由于Dex對呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的抑制作用較弱，其目前主要被用于重癥監(jiān)護(hù)病房患者的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，以及圍術(shù)期的麻醉輔助。研究發(fā)現(xiàn)，Dex可改善限制性肺疾病和肥胖患者的肺氧合功能[20]。Dex也可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來緩解LPS誘導(dǎo)的ALI[21]。此外，Dex還可通過HIF-1α/HO-1信號(hào)通路維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡以改善ALI[6]。不同于上述研究，本研究首次發(fā)現(xiàn)Dex預(yù)處理可明顯上調(diào)Nrf2和GPX4的表達(dá)，同時(shí)抑制COX2的表達(dá)，表明Dex可能通過激活Nrf2減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織鐵死亡，最終發(fā)揮肺保護(hù)作用。

綜上所述，本研究首次揭示了Dex減輕膿毒癥肺損傷的新機(jī)制——通過激活Nrf2抑制肺組織鐵死亡，這可為今后臨床ALI的預(yù)防和治療提供一定的參考。