過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的保護(hù)作用及機(jī)制研究

盧 靜，李建紅，彭 巍

(1.成都市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 611130；2.成都市第五人民醫(yī)院普外科，四川 成都 611130)

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象：SD健康雄性大鼠(由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)40只，體質(zhì)量210～230 g，平均(219.00±19.95)g，放在溫度18～26 ℃、濕度45%～55%的干凈籠子中喂養(yǎng)，飲水和新鮮干燥的飼料均進(jìn)行消毒之后供其自由食用1周。

主要試劑：兔抗小鼠免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗體(BD公司)；兔抗大鼠白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(Dako公司)；大鼠鼠抗兔緊密連接蛋白Claudin-1、Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)抗體(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機(jī)選取10只大鼠作為對(duì)照組，不做任何處理。其余30只大鼠進(jìn)行潰瘍性結(jié)腸炎建模，造模前所有大鼠禁食不禁水36 h，稱(chēng)重后使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，灌胃針用潤(rùn)滑油涂抹后，從大鼠肛門(mén)口插入約8 cm左右，將1 mL混合液一次性注入，再注入0.5 mL空氣，捏緊肛門(mén)，將大鼠臀部?jī)A斜朝上約15 min，使其自然蘇醒，注意保暖。大鼠出現(xiàn)濃血便、體型消瘦、少食懶動(dòng)、瞇眼、反應(yīng)遲鈍等生理表現(xiàn)時(shí)表明建模成功。最終25只大鼠建模成功，將其隨機(jī)分為模型組9只，抑制miR-449a組8只，過(guò)表達(dá)miR-449a組8只。將所有大鼠放置于玻璃麻醉箱內(nèi)麻醉，將含4%七氟醚棉球的小燒杯(50 mL)放入麻醉箱內(nèi)，待動(dòng)物出現(xiàn)呼吸變慢、四肢緊張度明顯降低、角膜反射遲鈍、皮膚痛覺(jué)消失等表現(xiàn)，則表明大鼠進(jìn)入到麻醉期。麻醉之后抑制miR-449a組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-449a進(jìn)行干預(yù)，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-449a進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組及模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本采集 藥物干預(yù)24 h后，取各組大鼠尾部靜脈血2 mL,2 000 r/min離心15 min后分離上清液，置于-80 ℃保存待檢。

1.2.3 HE染色 對(duì)各組大鼠進(jìn)行全身麻醉處理后，采用斷頭法分批處死所有大鼠，獲取腸黏膜組織，液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，間距5 mm作連續(xù)切片。將切片按順序置入不同濃度酒精中。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，清洗之后使用1%伊紅染色，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)炎癥因子相關(guān)指標(biāo) 取血清5 mL，離心處理后于-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。使用包被緩沖液將特異性抗體球蛋白稀釋至最為合適的濃度(1～10 μg/mL)；隨后在每個(gè)凹孔內(nèi)增加0.3 mL，放置在0 ℃保存過(guò)夜；次日移去包被緩沖液之后使用洗滌緩沖液每5 min對(duì)凹孔進(jìn)行沖洗，共沖洗3次，在每個(gè)凹孔內(nèi)加入0.2 mL含抗原的標(biāo)本，在37 ℃下作用2 h，隨后使用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗滌3次。加入0.2 mL抗體溶液(稀釋緩沖液稀釋過(guò)后的酶標(biāo)記特異性抗體溶液)在37 ℃下作用2 h。PBS溶液重復(fù)洗滌3次。洗滌后在每個(gè)凹孔內(nèi)加入0.2 mL底物溶液，于常溫下作用30 min后在每個(gè)凹孔內(nèi)加入2 mol/L H2SO4或者2 mol/L檸檬酸0.05 mL，使用酶標(biāo)比色儀對(duì)IL-8、IL-17、IL-10、TNF-α水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5 免疫透射比濁法檢測(cè)免疫球蛋白及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)水平 準(zhǔn)備3根試管并分別標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管及空白管，均加入350 μL緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)管中加入20 μL IgA、IgM、IgG、COX-2標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定管中加入20 μL血清，空白管中加入20 μL蒸餾水，分別搖勻，常溫靜置5～10 min后使用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，在500 nm波長(zhǎng)處以空白管調(diào)零，記錄吸光度，計(jì)算IgA、IgM、IgG、COX-2水平。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Claudin-1、TLR4表達(dá) 對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫蠟、水化等處理之后，將其浸泡于0.01 mol/L、95 ℃的枸櫞酸緩沖液中，并進(jìn)行熱修復(fù)，3% H2O2環(huán)境下培育10 min，滴入山羊血清，26 ℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min，抽離封閉液，添加Claudin-1、TLR4一抗，將其置于5 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日加入二抗，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 min，清洗后進(jìn)行DAB顯色、封片。

5）提高全社會(huì)水資源保護(hù)意識(shí)。拓寬公眾參與和輿論監(jiān)督渠道，充分利用媒體媒介的作用，加強(qiáng)水法、水資源保護(hù)條例、水污染防治法等法律法規(guī)的宣傳力度，調(diào)動(dòng)公眾參與水資源保護(hù)的積極性和自覺(jué)性，鼓勵(lì)舉報(bào)違法排污行為，嚴(yán)厲查處污染和破壞水資源的不法行為。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取大鼠腸黏膜組織，加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白，與緩沖液混合100 ℃煮沸5 min后電泳(120 V，3 h)。在90 V、4 ℃下將靶蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1∶300)，過(guò)夜孵育。加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-p38、過(guò)氧化酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織病理情況

如圖1所示，對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，杯狀細(xì)胞隱窩較為完整。模型組大鼠結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞減少，損傷面積較大，隱窩變形，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。抑制miR-449a組大鼠結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞減少，隱窩有一定的變形，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠結(jié)腸黏膜未見(jiàn)明顯的糜爛、損傷，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少。

2.2 各組大鼠IL-8、IL-10、IL-17水平比較

與對(duì)照組相比，模型組、抑制miR-449a組大鼠IL-8、IL-17較高，IL-10較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制miR-449a組、過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠IL-8、IL-17較低，IL-10較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與抑制miR-449a組相比，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠IL-8、IL-17較低，IL-10較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a:與對(duì)照組比較，P<0.05;b:與模型組比較，P<0.05；c:與抑制miR-449a組比較，P<0.05

2.3 各組小鼠免疫球蛋白水平比較

與對(duì)照組相比，模型組大鼠IgA、IgM、IgG均有所上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制miR-449a組大鼠IgA、IgM、IgG均有所上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與抑制miR-449a組相比，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠IgA、IgM、IgG均有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a:與對(duì)照組比較，P<0.05;b:與模型組比較，P<0.05；c:與抑制miR-449a組比較，P<0.05

2.4 各組大鼠TNF-α、COX-2水平比較

與對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α、COX-2有所上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制miR-449a組大鼠TNF-α、COX-2有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與抑制miR-449a組相比，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠TNF-α、COX-2有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a:與對(duì)照組比較，P<0.05;b:與模型組比較，P<0.05；c:與抑制miR-449a組比較，P<0.05

2.5 各組大鼠Claudin-1、TLR4水平比較

與對(duì)照組相比，模型組大鼠Claudin-1下降，TLR4上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制miR-449a組大鼠Claudin-1上升，TLR4下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與抑制miR-449a組相比，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠Claudin-1上升，TLR4下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6。

a:與對(duì)照組比較，P<0.05;b:與模型組比較，P<0.05；c:與抑制miR-449a組比較，P<0.05

2.6 各組大鼠p-p38、PPARγ、NF-κB蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠PPARγ下降，p-p38、NF-κB上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抑制miR-449a組大鼠PPARγ上升，p-p38、NF-κB下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與抑制miR-449a組相比，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠PPARγ上升，p-p38、NF-κB下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7、8。

圖6 各組大鼠Claudin-1及TLR4表達(dá)免疫組化圖片(×200)

a:與對(duì)照組比較，P<0.05;b:與模型組比較，P<0.05；c:與抑制miR-449a組比較，P<0.05

圖8 各組大鼠p-p38、PPARγ、NF-κB蛋白表達(dá)Western blot圖

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎的病因至今仍不明確，研究顯示，心理因素對(duì)于疾病惡化具有重要的作用[9]。潰瘍性結(jié)腸炎是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病是由外源物引起的宿主反應(yīng)、基因和免疫三者互相作用的結(jié)果[10-11]。潰瘍性結(jié)腸炎的病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，病變位置大多位于乙狀結(jié)腸和直腸之間，也可以延伸到降結(jié)腸，最后可蔓延至整個(gè)直腸[12]。

趨化因子家族是一種由細(xì)胞分泌的小細(xì)胞因子或信號(hào)蛋白[12-13]，因其具有誘導(dǎo)附近反應(yīng)細(xì)胞定向趨化的能力，而被命名為趨化細(xì)胞因子[14-15]。IL-8、IL-17、IL-10是臨床常見(jiàn)的趨化因子，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)C(jī)體趨化因子的水平進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[16]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-449a使IL-8、IL-17下降，IL-10上升，說(shuō)明IL-8、IL-17、IL-10與潰瘍性結(jié)腸炎有著密切的聯(lián)系，過(guò)表達(dá)miR-449a可通過(guò)調(diào)節(jié)IL-8、IL-17、IL-10對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起到一定的治療效果。

免疫球蛋白是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)，與抗體成分較為相似的球蛋白[17]，共分為5類(lèi)，即IgG、IgA、IgM、免疫球蛋白D(immunoglobulin D，IgD)和免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)[18-19]。其中，IgA在血清中的含量?jī)H次于IgG在黏膜組織內(nèi)的含量[20]。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，主要由脾和淋巴結(jié)中漿細(xì)胞分泌合成，在血清內(nèi)無(wú)具體表達(dá)形式[21-22]。IgM具有強(qiáng)大的殺菌、激活補(bǔ)體、免疫調(diào)節(jié)和凝聚作用，也參與某些自身免疫病及超敏反應(yīng)的病理過(guò)程。IgG主要分布于血清和組織液中，在人體血清中的含量最高，并且在血清中半衰期長(zhǎng)[23-24]，是人體免疫反應(yīng)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，并且還是唯一能通過(guò)胎盤(pán)屏障的免疫球蛋白，對(duì)新生兒抗感染有著重要作用。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-449a能夠使免疫球蛋白下降，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-449a可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫球蛋白的表達(dá)改善機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，起到治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

腫瘤壞死因子分2種，即TNF-α和TNF-β，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一[25-26]。TNF-α是由單核—巨噬細(xì)胞分泌而成，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性。COX有至少2種同工酶，COX-1與COX-2，其中COX-1稱(chēng)為固有性COX，COX-2稱(chēng)為誘生型COX[27]。COX-2是一種雙功能酶，具有一定的環(huán)氧化酶和過(guò)氧化酶活性，是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶[28]。炎癥損傷主要是由刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等誘導(dǎo)觸發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子COX-2合成導(dǎo)致。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-449a組大鼠TNF-α、COX-2下降，由此表明過(guò)表達(dá)miR-449a可有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎中炎癥反應(yīng)蔓延，減輕機(jī)體損傷，證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與炎癥反應(yīng)相關(guān)。

miR-449a是miRNAs的一種，在正常情況下，miR-449a在肺、氣管、睪丸中高表達(dá)，在宮頸、食道中亦有所表達(dá)。正常情況下miR-449a在機(jī)體組織的分化、成熟過(guò)程中有著重要的調(diào)節(jié)功能。PPARγ是PPARs超家族成員的一種亞型，是臨床研究中被深入研究的亞型，有著復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能，能夠參與腸道的運(yùn)動(dòng)。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-449a之后，大鼠體內(nèi)p-p38下降，PPARγ上升，NF-κB下降，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-449a能夠通過(guò)激活PPARγ，抑制p-p38/NF-κB通路，改善腸道運(yùn)動(dòng)，減少機(jī)體炎癥反應(yīng)對(duì)腸黏膜的損傷，起到修復(fù)結(jié)腸組織的作用。

Claudin-1表達(dá)于上皮細(xì)胞及神經(jīng)周細(xì)胞中。有研究表示，Claudin-1能夠減輕腸道炎癥反應(yīng)，促進(jìn)結(jié)腸黏膜愈合，重建腸黏膜屏障的完整性[29]。TLR4是參與非特異性免疫的一類(lèi)重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[30]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-449a組Claudin-1上升，TLR4下降，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-449a能夠通過(guò)改善Claudin-1、TLR4來(lái)促進(jìn)腸黏膜愈合，修復(fù)腸黏膜。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-449a能夠通過(guò)調(diào)節(jié)p38-PPAPγ/NF-κB通路，有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子表達(dá)，對(duì)腸黏膜起著修復(fù)、保護(hù)作用。