調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下肝癌HepG2細胞凋亡的影響*

黃亞緯， 熊 莉， 竇德宇， 呂夢娟， 馬玉紅△

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)實驗實訓(xùn)中心； 2. 皖南醫(yī)學(xué)院中心實驗室， 安徽 蕪湖 241000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的癌癥類型之一，居全世界癌癥相關(guān)死因的第三位[1]。全身性化療是HCC的重要治療手段，然而現(xiàn)有的化療方案在很大程度上都存在化療抵抗現(xiàn)象[2]。研究發(fā)現(xiàn)，引起肝癌化療抵抗的主要原因之一是肝癌細胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，它是細胞內(nèi)外多種壓力因素，包括缺氧、饑餓、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致的一種亞細胞器的病理狀態(tài)[3]。通常情況下，ERS是一種細胞自我保護的機制，可以維持恢復(fù)細胞的穩(wěn)態(tài)，然而程度過強或時間過長的ERS可以激活下游凋亡信號通路并最終引起細胞凋亡[4,5]。肝細胞癌常由病毒性或酒精性肝炎發(fā)展而來，肝癌細胞長期處于病毒感染、炎癥等各種不良刺激下，加上肝癌組織快速增殖引起的缺血缺氧微環(huán)境，導(dǎo)致細胞較易處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)[6]。它對肝癌細胞具有保護作用，能夠降低化療藥物的敏感性，進而抑制細胞凋亡。本課題組在前期工作中對肝癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激耐受現(xiàn)象及其機制進行了初步研究，證實當(dāng)使用ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(TM)作用于肝癌細胞后，細胞通過ATF6-COX2信號通路產(chǎn)生凋亡抵抗[7]。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是轉(zhuǎn)化生長因子β家族的一員，在肝臟含量最高，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化以及凋亡等過程。Elliott 和Blobe的[8]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在乳腺癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌這些腫瘤中發(fā)揮著強有力的生長抑制作用，并且它對凋亡的調(diào)節(jié)作用依賴于細胞和腫瘤的類型。相關(guān)文獻報道，TGF-β1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在一定的關(guān)系，TGF-β1參與了多種細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程，如骨骼肌細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、肝星狀細胞以及HeLa細胞。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)TGF-β1與肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系，肝癌細胞發(fā)生ERS后miR-663過表達，當(dāng)抑制miR-663的表達能明顯促進ERS后肝癌細胞凋亡，并證實TGF-β1是miR-663的靶基因，TGF-β1很有可能是肝癌細胞發(fā)生ERS誘導(dǎo)的凋亡抵抗的關(guān)鍵靶點[9]，但具體機制尚有待闡明。近年來TGF-β1/Smad信號通路仍是腫瘤方面的研究熱點，但其與肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系鮮有報道。因此，本研究對肝癌細胞ERS與TGF-β1/Smad信號通路展開了深入探索，通過調(diào)控該通路，明確其對ERS后肝癌細胞凋亡的影響，從而進一步揭示ERS狀態(tài)下肝癌細胞發(fā)生凋亡抵抗的分子機制，以期為提高肝癌的化療敏感性提供高效的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

衣霉素(Sigma，美國)，脂質(zhì)體 Lipofectamine 3000、Trizol(Invitrogen，美國)，TGF-β1 siRNA、TGF-β1 pEX-3及相應(yīng)對照(上海吉瑪生物科技有限公司)，抗TGF-β1多克隆抗體(Abcam，美國)，抗p-Smad2多克隆抗體(CST，美國)，抗GRP78 多克隆抗體購自(Bioworld，美國)，抗β-actin多克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，CCK-8試劑盒、PCR引物、All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、Top Green qPCR SuperMix Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，ECL發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher，美國)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(BD，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細胞株購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。將從-80℃超低溫冰箱中取出所需的肝癌HepG2細胞株復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，并置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液，待細胞融合度大于80%后進行傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 實驗設(shè)計

取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，經(jīng)不同濃度、不同作用時間的TM刺激后，檢測GRP78蛋白含量變化，以尋找建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的最佳TM濃度和作用時間。實驗分為6組，每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，Untreated組(未處理組)、TM組(3 μmol/L TM處理組)、TM+NC組(3 μmol/L TM+si-TGF-β1陰性對照組)、TM+si-TGF-β1組(3 μmol/L TM+si-TGF-β1組)、TM+pEX-3組(3 μmol/L TM+質(zhì)粒對照組)及TM+TGF-β1 pEX-3組(3 μmol/L TM+TGF-β1過表達質(zhì)粒組)。HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型建立后，以lipofectamine3000為載體，按照說明書取75 pmol TGF-β1 小干擾RNA、2.5 μg TGF-β1過表達質(zhì)粒及相應(yīng)對照分別轉(zhuǎn)染入HepG2細胞，24 h 后轉(zhuǎn)染成功，收集細胞。采用RT-qPCR檢測HepG2細胞中TGF-β1及p-Smad2 mRNA表達水平，Western blot檢測TGF-β1及p-Smad2蛋白表達水平，CCK8檢測HepG2細胞增殖抑制率，流式細胞術(shù)檢測HepG2細胞凋亡情況。

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)

分別使用不同濃度的 TM 作用肝癌HepG2細胞24 h和同一濃度TM作用肝癌細胞不同時間，采用 Western blot 方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白 GRP78 的變化。取生長狀態(tài)較佳并處于對數(shù)生長期的 HepG2細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度TM(0 μmol/L、0.375 μmol/L、0.75 μmol/L、1.5 μmol/L、3 μmol/L和6 μmol/L)與HepG2細胞共培養(yǎng)24 h，同時，使用3 μmol/L濃度的TM與HepG2細胞共同培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h。作用結(jié)束后收集細胞，提取蛋白后，經(jīng)Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的表達。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

利用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000為載體，將小干擾RNA(si-RNA)、過表達質(zhì)粒及其相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染入HepG2細胞內(nèi)，整個過程需保證無RNA酶污染。TGF-β1 siRNA NC由羥基熒光素(FAM)基團標(biāo)記，可于熒光顯微鏡下看到綠色熒光。轉(zhuǎn)染后24 h，于熒光顯微鏡下觀察和拍照，并估算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率(%)= 熒光場帶綠色熒光細胞數(shù)/明場細胞總數(shù) × 100% 。

1.6 RT-qPCR法檢測

收集轉(zhuǎn)染24 h后的HepG2細胞，根據(jù)Trizol說明書上的步驟提取總RNA，取A260/A280值在1.8～2.0應(yīng)用于實驗。以β-actin為內(nèi)參，TGF-β1及β-actin引物序列見表1。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20 μl體系，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。擴增采用20 μl體系，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s共40循環(huán)。然后進行實時熒光定量 PCR儀檢測，獲得Ct值，ΔCt = CtTGF-β1- Ctβ-actin，ΔΔCt= ( CtTGF-β1- Ctβ-actin) 轉(zhuǎn)染組 - ( CtTGF-β1- Ctβ-actin)空白對照組，組間TGF-β1 的相對表達水平用 2-ΔΔCt計算。

Tab. 1 The primer sequences for RT-qPCR

1.7 Western blot法檢測

收集轉(zhuǎn)染24 h后的HepG2細胞，用細胞裂解液提取總蛋白。 經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜等操作后，一抗4℃孵育過夜，次日洗膜后，加入二抗，室溫孵育 2 h，洗膜后加入ECL顯影液曝光，采用 Image J 軟件分析圖像灰度值，測定蛋白的相對表達量。

1.8 CCK-8實驗

取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞(5×103～6×103cells/well)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl細胞懸液，待細胞貼壁后以3 μmol/L的TM處理細胞，24 h后進行轉(zhuǎn)染。每組均設(shè)3個復(fù)孔。孵育24 h后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，隨后酶標(biāo)儀于450 nm處檢測各組的吸光度(optical density，OD)值，取每組平均值，比較組間差異，實驗重復(fù)3次。細胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR)，CPIR=[1-(實驗組OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)]×100%。

1.9 流式細胞術(shù)

將轉(zhuǎn)染24 h后的HepG2細胞用不含EDTA的胰酶消化后，制備成單細胞懸液，于室溫2 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗滌后棄去漂洗液，加入300 μl的1×Binding Buffer重懸細胞，向管中加入5 μl Annexin V-FITC混勻后于4℃避光孵育15 min，隨后加入10 μl的PI染色避光孵育5 min，上機前補加200 μl的1×Binding Buffer，F(xiàn)lowJo 7.6軟件進行分析。被分析的細胞可分為四組，其中: Q1代表Annexin V﹣PI﹢(壞死細胞)，Q2代表 Annexin V﹢PI﹢(凋亡后繼發(fā)壞死細胞，即晚期凋亡細胞)，Q3代表Annexin V﹢PI﹣(早期凋亡細胞)，Q4代表Annexin V﹣PI﹣(存活細胞)。細胞凋亡率(%)= Q2 + Q3。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ERS模型的建立

不同濃度的TM與人肝癌HepG2細胞共培養(yǎng)24 h，Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的表達水平變化，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加GRP78蛋白的表達水平有所上升，如圖1A所示，TM的濃度為3 μmol/L時GRP78表達達到峰值，因此本實驗采用3 μmol/L濃度的TM誘導(dǎo)ERS。同時，為了解TM誘導(dǎo)ERS的強度是否與時間有關(guān)，我們將3 μmol/L的TM與HepG2細胞共培養(yǎng)不同時間，Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的表達水平變化，如圖1B所示，GRP78蛋白表達水平隨著TM作用時間的延長而增加，TM作用24 h GRP78升高達到峰值。這提示3 μmol/L TM作用24 h 可以成功誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生ERS。

Fig. 1 The GRP78 expression in HepG2 cells under different concentration and time of TM n = 3)

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

轉(zhuǎn)染si-TGF-β1 6 h 后，先在熒光倒置顯微鏡的明場下觀察細胞，后在同一視野下轉(zhuǎn)為熒光場，可觀察到帶綠色熒光的 HepG2細胞大于總細胞數(shù)的 90%，表明轉(zhuǎn)染效率超過90% (圖 2A)。為了驗證HepG2細胞在轉(zhuǎn)染 si-TGF-β1 后細胞內(nèi)的 TGF-β1蛋白表達情況，進一步采用了Western blot法檢測轉(zhuǎn)染24 h 后HepG2細胞中TGF-β1蛋白的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染24 h 后，與空白對照組及陰性對照組相比，si-TGF-β1的三條同源序列均可顯著抑制TGF-β1的表達，其中以si-TGF-β1-2的抑制作用最明顯(P<0.01，圖2B)，后續(xù)實驗選用si-TGF-β1-2。

2.3 調(diào)控TGF-β1對TGF-β1/Smad信號通路分子TGF-β1、p-Smad2表達的影響

為明確HepG2細胞株發(fā)生ERS前后TGF-β1 mRNA表達的變化及調(diào)控TGF-β1表達對TGF-β1/Smad信號通路的影響，先使用3 μmol/L的TM作用24 h，誘導(dǎo)細胞發(fā)生ERS，然后轉(zhuǎn)染si-TGF-β1、TGF-β1 pEX-3及相應(yīng)對照，24 h后提取總RNA，利用RT-qPCR法定量檢測TGF-β1 mRNA的含量變化。以空白對照組(Untreated)的表達量為基準(zhǔn)，2-ΔΔCt計算相對表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如表2所示，TM組的TGF-β1 mRNA表達比空白組明顯降低(P<0.05)，應(yīng)用si-TGF-β1干擾后，TGF-β1 mRNA的表達較TM組顯著減少(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒TGF-β1 pEX-3后，TGF-β1 mRNA的表達較TM組顯著增加(P<0.01)。

Fig. 2 The cell transfection efficiency detection

細胞經(jīng)過相同的處理后提取總蛋白，利用Western blot法檢測TGF-β1和p-Smad2蛋白含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如表2與圖3所示，TM組的TGF-β1和p-Smad2蛋白表達量比空白組明顯降低(P< 0.05)，應(yīng)用si-TGF-β1干擾后，TGF-β1和p-Smad2蛋白的表達較TM組顯著減少(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒TGF-β1 pEX-3后，TGF-β1和p-Smad2蛋白的表達較TM組顯著增加(P<0.01)，與RT-qPCR結(jié)果一致。該結(jié)果提示HepG2 細胞發(fā)生ERS后TGF-β1和p-Smad2的表達降低，即TGF-β1/Smad信號通路受到抑制；轉(zhuǎn)染si-TGF-β1可進一步抑制TGF-β1/Smad信號通路，而轉(zhuǎn)染TGF-β1 pEX-3可有效激活TGF-β1/Smad信號通路。

Fig. 3 Equal protein amounts of cell lysates were subjected to western blot assay using anti-TGF-β1 and anti-p-Smad2， β-actin in the same HepG2 cells extract was used as an internal reference

2.4 調(diào)控TGF-β1/Smad2通路對ERS狀態(tài)下HepG2細胞增殖抑制率的影響

為了檢測調(diào)控TGF-β1/Smad2通路對ERS后HepG2細胞增殖抑制率的影響，轉(zhuǎn)染24 h后進行CCK-8檢測，CPIR公式來計算細胞增殖抑制率。結(jié)果如表3所示，下調(diào)TGF-β1的表達后，ERS狀態(tài)下HepG2細胞增殖抑制率顯著下降(P<0.01)，上調(diào)TGF-β1的表達可顯著促進ERS狀態(tài)下HepG2細胞的增殖抑制率顯著(P<0.01)。

Tab. 2 The relative TGF-β1 mRNA expression level， the TGF-β1 and p-Smad2 protein expression levels of HepG2 cells under ERS in each group after transfection n=3)

2.5 調(diào)控TGF-β1/Smad2通路對ERS狀態(tài)下HepG2細胞凋亡的影響

TGF-β1/Smad2通路在肝癌HepG2細胞發(fā)生ERS后受到抑制，為了進一步研究TGF-β1/Smad2通路在ERS誘導(dǎo)的凋亡抵抗中的發(fā)揮的作用，我們利用Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試驗研究調(diào)控TGF-β1的表達對ERS狀態(tài)下HepG2細胞凋亡率的影響。將細胞分組培養(yǎng)，使用3 μmol/L的TM作用24 h，轉(zhuǎn)染si-TGF-β1和過表達質(zhì)粒及其對照組，24 h后流式細胞儀檢測，結(jié)果如圖4與表3所示：下調(diào)TGF-β1的表達，ERS狀態(tài)下HepG2細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，當(dāng)上調(diào)TGF-β1的表達后凋亡率出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)。這提示激活TGF-β1/Smad2信號通路可促進ERS狀態(tài)下HepG2細胞的凋亡。

3 討論

在許多人類實體腫瘤中，由于細胞內(nèi)外各種刺激因素的長期作用，很容易造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘導(dǎo)ERS的產(chǎn)生，腫瘤細胞為了適應(yīng)這種惡虐的生長環(huán)境也常常發(fā)生適應(yīng)性改變，使其免于凋亡，因此ERS逐漸演變成了一種保護機制，結(jié)果卻使腫瘤細胞對ERS產(chǎn)生了適應(yīng)，那些經(jīng)過適應(yīng)性選擇而耐受ERS的腫瘤細胞繼續(xù)增長，往往會導(dǎo)致腫瘤的進展。這也就是常被提到的ERS介導(dǎo)的凋亡抵抗現(xiàn)象[2,10]。雖然由ERS引起腫瘤細胞凋亡抵抗已有不少報道，但TGF-β信號通路是否在這個過程中發(fā)揮作用尚未被深入研究，因?qū)GF-β信號通路與ERS在肝癌中的關(guān)系有著濃厚的興趣，本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上開展了這方面的研究。

Fig. 4 HepG2 cells were transfected with si-TGF-β1 and TGF-β1 pEX-3 for 24 h after pretreated by tunicamycin(TM)for 24 h， apoptosis cell were determined by FACS

Tab. 3 Effect of regulating TGF-β1/Smad2 pathway on cell proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HepG2 cells under ERS n=3)

轉(zhuǎn)化生長因子β家族包括TGF-β1-6共6種異構(gòu)體，它們具有相似的生物活性，但基因的表達具有明顯的組織及發(fā)育特異性，其中肝臟含量最高且具有生物活性的TGF-β1，它在參與的許多腫瘤細胞生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，包括細胞增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等[11]。TGF-β1主要通過與其受體TβR1-3形成復(fù)合物后調(diào)控下游Smad蛋白，形成TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用[12,13]。

近年來已有一系列研究報道了TGF-β與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間關(guān)系。Huang等[14]研究揭示TGF-β通路可能參與了人臍靜脈內(nèi)皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可以通過降低心肌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用，防止缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。此外，還有研究顯示，在HeLa細胞中，ERS標(biāo)志性蛋白GRP78會阻斷TGF-β/Smad及其下游信號通路[16]，這與本研究中證實的HepG2細胞ERS后TGF-β1表達受到抑制這一結(jié)果也是一致的。這些研究結(jié)果都表明TGF-β與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在密切的聯(lián)系，也為本研究提供了充分的理論依據(jù)。

目前國內(nèi)外關(guān)于TGF-β1與肝癌的關(guān)系也有大量研究， Giannelli 等[17]研究證實TGF-β1在體外能夠促進肝癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。TGF-β1活性會影響其下游的MAPK信號通路、TGF-β1/Smad信號通路的活性，這些通路是肝癌細胞中的重要通路。盧燕輝等[18]研究顯示肝癌組織中TGF-β1/Smad信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子RUNX3基因在肝癌組織的mRNA表達水平顯著低于癌旁組織，該轉(zhuǎn)錄因子的減少會影響TGF-β抑制腫瘤信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。更有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad信號通路幾乎參與了肝臟疾病的所有階段，從最初的炎癥和纖維化直到最終的肝硬化以至肝癌，而且TGF-β1/Smad信號通路在肝癌的不同階段發(fā)揮的作用也不同，在腫瘤形成時，TGF-β1/Smad信號通路抑制腫瘤細胞生長；而當(dāng)腫瘤處于進展期時，TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮促進腫瘤細胞生長的作用[19]。在本研究中，我們也證實了TGF-β1/Smad信號通路與肝癌之間的密切關(guān)系，并且深入探究了TGF-β1/Smads信號通路對ERS狀態(tài)下肝癌HepG2細胞凋亡的影響。

研究中我們發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)衣霉素(TM)處理的肝癌HepG2細胞相比，在衣霉素(TM)處理的HepG2細胞中TGF-β1及其下游因子p-Smad2的表達水平明顯下降。有證據(jù)顯示TGF-β1的低表達與肝癌細胞的增殖和凋亡等進程關(guān)系密切[20]。為了進一步明確TGF-β1/Smad通路在體外參與ERS狀態(tài)下肝癌細胞凋亡的分子機制，后續(xù)實驗中我們利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)對TGF-β1基因進行敲除或者過表達處理后，RT-qPCR和Western blot證實TGF-β1/Smad信號通路得到了有效的抑制或激活，隨后采用CCK8法及流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖抑制和凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TM單獨作用誘導(dǎo)肝癌細胞ERS后會引起HepG2細胞輕度凋亡，這與我們課題組前期研究結(jié)果也是一致的[7,9]，當(dāng)TM與si-TGF-β1聯(lián)合作用HepG2細胞凋亡率及增殖抑制率出現(xiàn)了明顯減少，然而，當(dāng)TM與TGF-β1過表達質(zhì)粒聯(lián)合作用HepG2細胞凋亡率及增殖抑制率顯著增加。這一結(jié)果提示，激活TGF-β1/Smad信號通路能夠增強ERS狀態(tài)下HepG2細胞的凋亡現(xiàn)象。

綜上所述，我們的研究證實，當(dāng)抑制TGF-β1/Smad通路后，ERS狀態(tài)下的肝癌HepG2細胞增殖抑制率和凋亡率顯著下降；反之，激活TGF-β1/Smad通路后，ERS狀態(tài)下的肝癌HepG2細胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高。這不僅與我們前期調(diào)控miR-663的表達對ERS狀態(tài)下肝癌細胞的增殖與凋亡的結(jié)果充分吻合，也進一步證實了HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡抵抗的具體分子機制，TGF-β1/Smad信號通路在肝癌HepG2細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后受到抑制，當(dāng)我們重新激活該通路后，ERS狀態(tài)下的肝癌HepG2細胞凋亡率明顯升高。由此，我們得出結(jié)論：ERS狀態(tài)下的肝癌HepG2細胞可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮凋亡抵抗作用，當(dāng)激活該通路后，ERS狀態(tài)下的肝癌HepG2細胞的凋亡率出現(xiàn)明顯升高。這不僅為進一步明確肝癌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡抵抗機制提供了一種新的理論基礎(chǔ)，同時也為肝癌的治療提供了新思路與新靶點。