黃芪湯對(duì)延緩12C6+離子輻射致大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制*

安方玉， 顏春魯， 劉永琦， 王彩霞， 蘇 韞， 石 彪，楊雙紅， 郭 丹， 蔣國(guó)鳳

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心， 蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院， 蘭州 730000； 3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000； 4. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 5. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 蘭州 730000； 6. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000； 7. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

重離子是不同于X-射線和γ-射線的重離子具有高傳能線密度和形成特征性布喇格峰的一種射線，其能量釋放是隨深度的不同呈現(xiàn)出指數(shù)增加或減小的特點(diǎn)[1]，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于腫瘤患者的治療。但是近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)，重離子抗癌的同時(shí)，也會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織誘發(fā)輻射損傷，嚴(yán)重影響著腫瘤患者的生存質(zhì)量。據(jù)報(bào)道，輻射在造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的同時(shí)，能影響其調(diào)控的外周靶器官，使外周靶器官產(chǎn)生旁效應(yīng)[2-3]。因此，尋找安全、低毒、高效的輻射防護(hù)劑顯得尤為迫切。中醫(yī)將輻射歸屬于“毒邪”范疇[4]，并認(rèn)為氣血兩虛及血瘀是重離子輻射的基本病機(jī)。選自《醫(yī)學(xué)心悟》中的經(jīng)方黃芪湯具有益氣滋陰，生津養(yǎng)血之功效，可能起到防護(hù)輻射損傷的作用。為了進(jìn)一步探討黃芪湯防輻射的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Wistar大鼠腦組織給予4Gy12C6+離子束單次照射復(fù)制重離子輻射腦損傷動(dòng)物模型，觀察黃芪湯對(duì)12C6+離子輻射腦損傷模型大鼠Bcl-2/NF-κB信號(hào)通路的干預(yù)作用，初步探討黃芪湯對(duì)12C6+離子輻射腦損傷模型大鼠旁效應(yīng)臟器腎組織細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制，為輻射損傷的臨床輔助用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取體質(zhì)量為(180±20)g的50只雌雄各半的SPF級(jí)Wistar大鼠，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK(甘)2015-0002，所有動(dòng)物自由飲水、攝食1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的嚴(yán)格審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑

黃芪湯方中的黃芪、熟地、麥冬、人參、枸杞子和五味子均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)分別為：H7806580 和H7825375)；引物β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3(TaKaRa 寶生物工程(大連) 有限公司設(shè)計(jì)并合成)；引物β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3序列見(jiàn)表1。；大鼠IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)為：1812R)；兔抗大鼠Bcl-2 抗體(美國(guó) Gene Tex公司，批號(hào)：42970)；兔抗大鼠Bax 抗體(美國(guó) Gene Tex公司，批號(hào)：39988)；兔抗大鼠Caspase-3 抗體(美國(guó) Gene Tex公司，批號(hào)：42753)；GAPDH抗體(美國(guó) Gene Tex公司，批號(hào)：41323)；兔抗大鼠NF-κB 抗體(Immuno Way公司，批號(hào)：B1101)。

Tab. 1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 主要儀器

MultiskanSky型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(北京昊諾斯科技有限公司)；美國(guó) Q5000 超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海在途生物科技有限公司)；PCR熱循環(huán)儀(上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司)； 7500型實(shí)施熒光定量PCR擴(kuò)增儀(上海興曼生物科技有限公司)；Western blot分析儀(BIO-RAD)；BX53型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物給藥劑量

黃芪湯方中的所有中藥原藥材均由本校甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究室進(jìn)行質(zhì)量鑒定。黃芪湯由30 g黃芪、15 g熟地黃、15 g麥冬、15 g人參、15 g枸杞子和10 g五味子組成，人的臨床用量為：100 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法：100 g×0.018×5=9.0 g/(kg·d)，作為中劑量。則黃芪湯高、中、低劑量分別為18、9、4.5 g/(kg·d)。

1.5 動(dòng)物分組、給藥及造模

SPF級(jí)Wistar大鼠自由飲水、攝食1周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組，單純輻射模型組，黃芪湯高、中、低劑量組，每組10只。正常對(duì)照組和單純輻射模型組給予等體積生理鹽水灌胃(10 ml/(kg·d))，黃芪湯高、中、低劑量組給予黃芪湯灌胃(劑量為18、9、4.5 g/(kg·d))，連續(xù)14日。第8日腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉各組大鼠，除正常對(duì)照組大鼠外，其余各組大鼠腦組織均給予4Gy12C6+離子束單次照射[5]。重離子照射是在中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所完成的，照射過(guò)程中的束流為12C6+離子束，照射過(guò)程中的能量、線性能量傳遞(LET)、吸收劑量和照射劑量等設(shè)置根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]實(shí)施。輻射后第7日稱量各組大鼠的體質(zhì)量后，股動(dòng)脈采血處死各組大鼠，分離血清，摘取腎組織備用。

1.6 動(dòng)物體質(zhì)量及腎臟指數(shù)測(cè)定

用生理鹽水沖洗腎組織并用吸水紙吸干后稱重，計(jì)算大鼠的腎指數(shù)。大鼠腎臟指數(shù)(%)=腎質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

1.7 腎臟形態(tài)學(xué)變化觀察

將上述稱重后的左腎組織放在4%多聚甲醛固定液中24 h，常規(guī)經(jīng)過(guò)脫水、固定、包埋、脫蠟、沖洗等步驟后蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎組織結(jié)構(gòu)改變。

1.8 ELISA 法測(cè)定血清IL-6含量

股動(dòng)脈采血留取的血液靜置2 h后，2 500 r/min，離心10 min，制備血清。ELISA法測(cè)定血清IL-6的含量。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 RT-PCR觀察腎臟Bcl-2、Bax和caspase-3的基因表達(dá)

右腎組織RNA提取用 4℃的Trizol試劑，提取后立即上機(jī)測(cè)定RNA含量和OD260/OD280的比值。RT-PCR法合成模板cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性40 s，58℃退火50 s，60℃延伸2 min。共 42個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)樣品至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，用 2-△△Ct來(lái)表示基因相對(duì)表達(dá)含量。

1.10 免疫組化法觀察腎臟Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB 的蛋白表達(dá)

將脫蠟后的大鼠腎組織石蠟切片用3% H2O2進(jìn)行封閉、然后經(jīng)過(guò)微波修復(fù)、血清封閉，(1∶200、1∶100、1∶300、1∶200)的兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB一抗 4℃ 孵育過(guò)夜，(1∶1500)二抗37℃孵育、DAB顯色等步驟完成免疫組化染色。染色判定依據(jù)為腎小管和腎間質(zhì)胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為染色陽(yáng)性[6]。在顯微鏡下采集腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB的蛋白表達(dá)進(jìn)行拍照。用免疫組化數(shù)據(jù)分析軟件 Image proplus 6.0 對(duì)各組照片的染色結(jié)果進(jìn)行分析，每組隨機(jī)選取10張切片，每張切片連續(xù)選取3個(gè)不同視野，將10張切片中每張切片連續(xù)3個(gè)不同視野得出的光密度值再取其平均數(shù)即為平均積分光密度(integrated optical density，IOD)

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，單純輻射模型組大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)較正常對(duì)照組均明顯下降(P<0.01)；黃芪湯高劑量組大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)較單純輻射模型組均顯著升高(P<0.05)。

Tab. 2 Effects of Huangqi decoction on the weight and renal index in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

2.2 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響

圖1結(jié)果顯示，正常對(duì)照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常；單純輻射組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，腎小管間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血，腎小管管腔狹窄、不規(guī)則。黃芪湯低、中劑量組黃芪湯可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，腎小管間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血，腎小管排列紊亂；黃芪湯高劑量組可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞增生情況明顯改善，腎小管輪廓清晰。

Fig. 1 Effects of Huangqi decoction on the pathomorphological changes of renal tissues in rats induced by 12C6+ radiation brain (HE ×20)

2.3 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠血清IL-6含量的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，單純輻射模型組大鼠血清IL-6含量顯著升高(P<0.01)；與單純輻射模型組比較，黃芪湯各干預(yù)組大鼠血清IL-6含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

Tab. 3 Effects of Huangqi decoction on the serum content of IL-6 in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

2.4 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠腎臟Bcl-2、Bax和caspase-3基因表達(dá)的影響

表4結(jié)果顯示，單純輻射模型組大鼠腎組織Bcl-2基因表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低，Bax和caspase-3基因表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(P< 0.01)；黃芪湯各干預(yù)組大鼠腎組織Bcl-2基因表達(dá)較單純輻射模型組顯著升高，Bax和caspase-3基因表達(dá)較單純輻射模型組顯著降低(P<0.01)。

Tab. 4 Effects of Huangqi decoction on the gene expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 of renal tissue in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

2.5 黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦損傷模型大鼠腎臟Bcl-2、Bax 、caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表5結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，單純輻射模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，Bax、Caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與單純輻射模型組大鼠比較，黃芪各干預(yù)組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量組大鼠Bax、Caspase-3和黃芪各干預(yù)組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01， 圖2-5)。

Tab. 5 Effects of Huangqi decoction on the IOD vslue of protein expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and NF-κB of renal tissues in rats induced by 12C6+ radiation brain(IOD， n=10)

Fig. 2 Effects of Huangqi decoction on the Bcl-2 protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

Fig. 3 Effects of Huangqi decoction on the Bax protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

Fig. 4 Effects of Huangqi decoction on the Caspase-3 protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

Fig. 5 Effects of Huangqi decoction on the NF-κB protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

3 討論

放療是目前惡性腫瘤的主要治療手段之一，其主要并發(fā)癥是輻射性損傷。中醫(yī)將這種輻射損傷歸屬于“熱毒”范疇。中醫(yī)認(rèn)為熱毒熾盛直中臟腑，消耗人體正氣，導(dǎo)致氣血虧虛，痰瘀血瘀、臟腑功能失調(diào)。治法以“補(bǔ)氣生津、活血化瘀”為主。黃芪湯主要由黃芪 30 g、熟地黃15 g、麥冬15 g、人參15 g、枸杞子15 g，五味子10 g配伍而成。方中熟地黃、枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、滋陰清熱功效；五味子具有滋腎養(yǎng)陰，益氣生津功效；麥冬具有潤(rùn)肺清心，養(yǎng)陰生津功效；黃芪具有補(bǔ)中益氣功效；人參大補(bǔ)元?dú)?，具有補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血功效。諸藥合奏發(fā)揮益氣滋陰，生津養(yǎng)血之功效。根據(jù)方解分析，黃芪湯對(duì)重離子輻射損傷能夠起到防護(hù)作用。且有研究發(fā)現(xiàn)[7]，12C6+束照射大鼠輻射損傷模型的中醫(yī)證候?qū)傩允菤怅巸商撟C，黃芪湯對(duì)12C6+束照射導(dǎo)致的氣陰兩虛證具有明顯的緩解作用，但是其具體的分子機(jī)制未明。

NF-κB是一個(gè)參與細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖基因的轉(zhuǎn)錄，以及調(diào)控多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的多功能轉(zhuǎn)錄因子，主要是以形成P50-P65 異源二聚體來(lái)發(fā)揮生理功能的。通常情況下，NF-κB 與 IκB 以三聚體的無(wú)活性方式存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)受到炎癥因子(IL-1α、IL-1β)、細(xì)菌脂多糖、受損細(xì)胞釋放的產(chǎn)物等刺激時(shí)，使三聚體中IκB發(fā)生磷酸化被蛋白水解酶水解，促進(jìn)了NF-κB 的釋放并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，入核的NF-κB結(jié)合細(xì)胞核基因上的 κB 位點(diǎn)，又會(huì)調(diào)控一系列炎癥性細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-12 /23)、趨化因子 (IL-8、MIP-1α、MCP-1)、NO產(chǎn)物、黏附分子(ICAM、VCAM、E-選擇素) 等的基因表達(dá)，調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[8-9]。IL-6是由T、B淋巴細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫反應(yīng)的多向潛能因子[10]，是判定炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明，單純輻射模型組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，腎小管間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血，腎小管管腔狹窄、不規(guī)則。單純輻射模型組體質(zhì)量和腎指數(shù)均明顯降低，IL-6含量和NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，預(yù)先給予12C6+輻射腦損傷大鼠黃芪湯灌胃的結(jié)果顯示，黃芪湯高劑量組大鼠的體質(zhì)量和腎臟指數(shù)明顯增加，腎組織病理?yè)p傷程度明顯減輕，黃芪湯各干預(yù)組大鼠血清IL-6含量和腎組織NF-κB蛋白表達(dá)均明顯下降。說(shuō)明黃芪湯對(duì)12C6+輻射腦模型鼠誘發(fā)的旁效應(yīng)器官腎病理?yè)p傷具有減緩作用，機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路的炎癥因子IL-6的分泌有關(guān)。

受重離子照射的中樞神經(jīng)系統(tǒng)極易引起周圍靶器官的損傷，而腎臟是屬于放射中樞神經(jīng)系統(tǒng)旁效應(yīng)靶器官損傷中最敏感組織。NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的激活可能是引起腎損傷的關(guān)鍵因素。激活的NF-κB入核后可調(diào)控下游凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax及細(xì)胞增殖相關(guān)基因Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控[11-12]。Bcl-2是屬于Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白，Bax是屬于Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，Caspase-3是Bcl-2 家族通過(guò)線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡的下游促凋亡蛋白[13-15]。在線粒體凋亡調(diào)控通路中，當(dāng)Bax形成Bax-Bax同源二聚體時(shí)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax形成Bax-Bcl-2異源二聚體時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞凋亡[15]。重離子輻射會(huì)激活機(jī)體受損組織的Bax過(guò)度表達(dá)，過(guò)度表達(dá)的Bax可通過(guò)線粒體途徑激活下游的Caspase-3， 激發(fā)Caspase發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)受損組織的細(xì)胞凋亡[16]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，單純輻射模型組大鼠腎臟的Bcl-2的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)在12C6+離子輻射后7d均顯著降低，而腎臟的Bax、Caspase-3的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)及NF-κB的蛋白表達(dá)則在12C6+離子輻射后7d均顯著升高，與以往的研究基本相符[5,17-18]；而預(yù)先給予黃芪湯干預(yù)的結(jié)果則顯示，黃芪湯中、高劑量組腎組織的Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)均顯著降低，黃芪湯各干預(yù)組腎組織的Bcl-2的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均顯著升高、Bax和Caspase- 3腎組織的基因表達(dá)均顯著降低，NF-κB腎組織的蛋白表達(dá)也均顯著降低。說(shuō)明，黃芪湯通過(guò)調(diào)控Bcl-2/NF-κB信號(hào)通路中的Bcl-2、Bax和Caspase-3，以其多藥效部位多作用靶點(diǎn)的形式參與12C6+離子輻射后腎臟細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗輻射損傷的作用。

綜上，黃芪湯可能是通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路中Bcl-2表達(dá)水平的上調(diào)和Bax、Caspase-3、NF-κB的表達(dá)水平的下調(diào)，以抑制重離子輻射腦模型鼠受損腎的細(xì)胞凋亡，也可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的炎癥因子IL-6的分泌來(lái)抑制腎的炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步延緩受損腎組織的病理形態(tài)改變，發(fā)揮對(duì)輻射的干預(yù)作用。本文從NF-κB信號(hào)通路的凋亡和炎癥反應(yīng)的雙向調(diào)控靶點(diǎn)上對(duì)黃芪湯的干預(yù)機(jī)制進(jìn)行了初探，以期為輻射防護(hù)劑的研發(fā)提供新的思路。