川楝素誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡及其機(jī)制*

徐興軍， 李珊珊， 劉 暢， 張偉偉， 張珍珠， 邵淑麗Δ

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

近年來全球胃癌患者逐年大幅度增加，且死亡率極高[1]。目前，胃癌最常用的治療方案仍是以手術(shù)加全身化療為主[2]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃癌對常規(guī)化療藥物的耐受性極差，且預(yù)后效果不理想[3,4]。因此，迫切需要新的化療藥物。

川楝素(toosendanin, TSN)是一種四環(huán)三萜類化合物，從楝樹的樹皮或果實(shí)中提取的無色針狀晶體，最初楝樹在中國和印度生長，后來轉(zhuǎn)移到世界各地[5]。據(jù)報(bào)道，川楝素具有殺菌，殺蟲，抗炎等功能[6,7]。本實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果表明，川楝素能降低CCNB1和 CCND1基因表達(dá)量，使細(xì)胞周期阻滯于G1期[8]。然而川楝素對人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以MGC-803細(xì)胞為研究對象，探討川楝素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，為川楝素的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

人胃癌MGC-803細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所；川楝素粉末購自飛宇生物；血清購自以色列Biological Industries公司；RPMI 1640干粉購自美國Gibco公司；Bcl-2、Bax、Cyt c、APAF、β-actin一抗均購自北京博奧森生物技術(shù)公司；羊抗兔和羊抗鼠二抗以及抗體稀釋液均購自美國LI-COR公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

人胃癌MGC-803細(xì)胞于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行傳代。將人胃癌MGC-803細(xì)胞分為5組，每組3個(gè)復(fù)孔，采用氟尿嘧啶(5-FU)和0 nmol/L川楝素(TSN)分別作為陽性對照和陰性對照，其余三組分別加入終濃度為30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素。川楝素處理細(xì)胞48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位變化；酶標(biāo)法檢測Caspase-3和Caspase-9活性；利用qRT-PCR和Western blot檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Cytc和APAF-1 mRNA和蛋白水平。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L氟尿嘧啶(5-FU)作用細(xì)胞 48 h，加入吖啶橙室溫孵育2 min，以0 nmol/L TSN為陰性對照，5-FU為陽性對照，用激光共聚焦顯微鏡觀察及拍照。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，依次加入工作液(500 μl)和1×緩沖液(500 μl)，混勻后上機(jī)檢測。

1.5 Caspase-3和Caspase-9活性檢測

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，加入100 μl細(xì)胞裂解液，3 000 r/min，15 min。依次加入緩沖液(120 μl)、樣品(150 μl)和 AC-IETD-pNA(30 μl)，混勻，37℃避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測A405指標(biāo)。

1.6 qRT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

人胃癌MGC-803細(xì)胞經(jīng)0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用48 h后，Trizol 提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Cytc和APAF-1基因的引物(表1)，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR檢測。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，擴(kuò)增結(jié)束后以2-ΔΔCt方法計(jì)算凋亡相關(guān)基因 mRNA相對表達(dá)量。

Tab. 1 Primers for qRT-PCR analysis

1.7 Western blot檢測凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)

人胃癌MGC-803細(xì)胞經(jīng)0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用48 h后，提取細(xì)胞的總蛋白，在沸水中煮5 min，使蛋白質(zhì)變性。進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳再轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)上，然后用脫脂奶粉封閉 1 h。4℃條件下一抗(1∶300)孵育過夜。磷酸緩沖液洗3次，避光 4℃條件下二抗 Ig G (1∶10 000)孵育1 h，磷酸緩沖液洗3次，掃膜。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 川楝素對MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)用激光共聚焦顯微鏡(圖1)。0 nmol/L處理組細(xì)胞大小均勻一致，包膜完整，分裂正常。各川楝素處理組細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)染色體濃縮，高度聚集，部分細(xì)胞核裂解成碎片等凋亡形態(tài)，與5-FU對照組相比，50 nmol/L川楝素組細(xì)胞凋亡特征更明顯。

Fig. 1 The cell morphology of human gastric cancer MGC-803 cells treated with TSN for 48 h under laser confocal microscope (acridine orange ×400， n=3)

2.2 川楝素對MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位影響

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h，線粒體膜電位變化檢測用流式細(xì)胞儀(圖2)。與0 nmol/L處理組相比，各川楝素組線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)。且當(dāng)川楝素濃度為50 nmol/L時(shí)，線粒體膜電位最低。與5-FU對照組相比，50 nmol/L川楝素組線粒體膜電位明顯低于5-FU組(P<0.01)。

Fig. 2 The mitochondrial membrane potential of the MGC-803 cells treated with TSN for 48 h(n=3)

2.3 川楝素對MGC-803細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性影響

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU處理人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h。表2結(jié)果顯示，與0 nmol/L TSN組相比，各川楝素處理組Caspase-3和Caspase-9相對活性均顯著升高(P<0.01)，且50 nmol/L川楝素組Caspase-3和Caspase-9相對活性均顯著高于5-FU組(P<0.01)。

Tab. 2 Effects of TSN on the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in MGC-803 cells n=3)

2.4 川楝素對MGC-803細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU處理人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h。表3結(jié)果顯示，與0 nmol/L 處理組相比，各川楝素處理組Bax(P<0.01)、Cytc(P<0.01)和APAF-1 (P<0.01)mRNA表達(dá)量均明顯增加，Bcl-2 (P<0.01)mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of TSN on mRNA expression levels of apoptosis-related genes in human gastric cancer MGC-803 cells n=3)

2.5 川楝素對MGC-803細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU處理人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h。圖3結(jié)果顯示，與0 nmol/L 處理組相比，各川楝素處理組Bax(P<0.01)、Cytc(P<0.01)和APAF-1 (P<0.01)蛋白表達(dá)量明顯增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01，表4)。

Fig. 3 Effects of TSN on protein expression levels of apoptosis-related genes in human gastric cancer MGC-803 cells

Tab. 4 Effects of TSN on protein expression of apoptosis-related genes in human gastric cancer MGC-803 cells n=3)

3 討論

近年來全球胃癌患者逐年增加，且死亡率極高。目前，臨床上治療胃癌的常用化療藥物主要是希羅達(dá)、5-氟尿嘧啶等，其毒副作用較大[9]。因此尋找毒副作用小，治療胃癌效果好的化療藥物勢在必行。川楝素為川楝子和苦楝皮提取物。已有研究表明，川楝素可以誘導(dǎo)人卵巢癌A2870細(xì)胞[10]和人肺癌A549細(xì)胞凋亡[11]。但川楝素是否能誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用終濃度為0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU處理人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，且線粒體膜電位隨著川楝素濃度的增大而降低。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞有序主動的死亡，在生物學(xué)中至關(guān)重要[12]。研究表明細(xì)胞凋亡主要有三條通路：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[13]。其中線粒體途徑中Bcl-2和Bax是最有代表性的凋亡相關(guān)基因，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程的分子開關(guān)，在凋亡中起著關(guān)鍵作用[14]。TSN可通過上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，該作用就涉及線粒體途徑的參與[15]。線粒體途徑受Bcl-2家族成員調(diào)控的同時(shí)還依賴Cytc因子的釋放[16]。當(dāng)Cytc被釋放到細(xì)胞質(zhì)中與APAF-1結(jié)合，激活Caspase家族中的Caspase-9，進(jìn)而激活下游蛋白Caspase-3，來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。據(jù)報(bào)道，白花蛇舌草可通過增強(qiáng)Caspase-3、Caspase-9基因表達(dá)誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞MNK-45細(xì)胞凋亡[18]，白扁豆多糖可通過調(diào)節(jié)Bax-Bcl-2-caspase3通路，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901凋亡[19]。補(bǔ)腎壯督方含藥血清通過促進(jìn)Bax、Cytc和APAF-1基因的表達(dá), 抑制Bcl-2基因的表達(dá)來誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)用0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU處理人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h 后，Bax、Cytc和APAF-1的mRNA和蛋白水平顯著升高，Bcl-2的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低，Caspase-3和Caspase-9的活性顯著增強(qiáng)，提示川楝素可通過線粒體途徑誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡。

綜上所述，川楝素能夠使人胃癌MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位降低，上調(diào)Bax、Cytc和APAF-1基因表達(dá)，下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗胃癌的作用。