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    UPLC法測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1

    2023-05-30 18:03:58楊雅雯張美秀蒲小春
    食品安全導(dǎo)刊·中旬刊 2023年2期
    關(guān)鍵詞:超高效液相色譜

    楊雅雯 張美秀 蒲小春

    摘 要:目的:研究嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的超高效液相色譜測定方法。方法:樣品經(jīng)甲醇-水溶液提取,上清液稀釋,經(jīng)免疫親和柱凈化和富集,再氮吹復(fù)溶后,用超高效液相色譜儀(熒光檢測器)分析測定。結(jié)果:黃曲霉毒素M1在0.051 5~5.150 0 ng·mL-1線性良好,回歸方程為Y=4.00×105X-8.74×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 867,檢出限為0.02 μg·kg-1,定量限為0.05 μg·kg-1;加標(biāo)回收率在81.0%~90.3%,變異系數(shù)為0.72%~3.18%,且正確度較好。結(jié)論:該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好,適用于測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的測定。

    關(guān)鍵詞:超高效液相色譜;黃曲霉毒素M1;嬰幼兒配方奶粉

    Determination of Aflatoxin M1 in Infant Formula Milk Powder by UPLC

    YANG Yawen, ZHANG Meixiu, PU Xiaochun

    (Meilu Biotech Co., Ltd., Jiujiang 332000, China)

    Abstract: Objective: To study the determination of aflatoxin M1 in infant formula milk powder by ultra-high performance liquid chromatography. Method: The sample was extracted by methanol-water solution, diluted by supernatant, purified and enriched by immunoaffinity column, and then dissolved by nitrogen blowing, then analyzed and determined by ultra-high performance liquid chromatography (fluorescence detector). Result: The linearity of aflatoxin M1 was good in 0.051 5~5.150 0 ng·mL-1, the regression equation was Y=4.00×105X-8.74×103, the correlation coefficient was 0.999 867, and the detection limit was 0.02 μg·kg-1, limit of quantitation was 0.05 μg·kg-1; The recovery rate of spiking was 81.0%~90.3%, CV was 0.72%~3.18%, and the accuracy was good. Conclusion: The method has high sensitivity and accuracy, and is suitable for the determination of aflatoxin M1 in infant formula milk powder.

    Keywords: ultra-high performance liquid chromatography; aflatoxin M1; infant formula milk powder

    黃曲霉毒素M1是一種有機(jī)化合物,主要用于新陳代謝和致癌性的研究。由于黃曲霉毒素具有強(qiáng)致癌性,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)將其列為1類致癌物[1]。當(dāng)哺乳動(dòng)物食用黃曲霉毒素污染的食物后,代謝物會分泌到乳汁中造成污染[2-3]。黃曲霉毒素M1的檢測方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法[4-6]、液相色譜法[6-9]和酶聯(lián)免疫法[6,10]等。其中酶聯(lián)免疫法檢測操作快速、方便,檢測成本相對較低,應(yīng)用廣泛;液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法準(zhǔn)確度高,靈敏度好,但液質(zhì)聯(lián)用法所需設(shè)備昂貴,檢測成本高。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》(GB 5009.24—2016)中規(guī)定使用酶聯(lián)免疫法檢出有黃曲霉毒素M1時(shí),需使用液相色譜法或是液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行確認(rèn)。在使用液相色譜法檢測黃曲霉毒素M1時(shí)發(fā)現(xiàn),黃曲霉毒素M1對液相色譜儀熒光檢測器的靈敏度要求較高,一般的熒光檢測器靈敏度度無法滿足GB 5009.24—2016中規(guī)定的特殊膳食食品中黃曲霉毒素M1檢出限為0.02 μg·kg-1的要求。本研究采用超高效液相色譜儀(Ultra-High Performance Liquid Chromatography,UPLC)的快速高通量熒光檢測器進(jìn)行黃曲霉毒素M1的檢測,并對液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    乙腈、甲醇,色譜級,F(xiàn)isher;氯化鈉、氯化鉀,分析純,天津永大;磷酸氫二鈉,分析純,西隴化工;磷酸二氫鉀,分析純,西亞試劑;鹽酸,分析純,科隆化學(xué)品;黃曲霉毒素M1免疫親和柱,浙江月旭。黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液,上海安譜。

    超高效液相色譜儀(配有熒光檢測器),Waters;分析天平,賽多利斯;水浴鍋,江蘇金怡;旋渦振蕩器,海門其林貝爾;超聲波清洗儀,國環(huán)高科;離心機(jī),湖南湘儀;固相萃取儀,博納艾杰爾;氮吹儀,奧盛儀器。

    1.2 超高效液相色譜條件

    色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18柱,100 mm×2.1 nm,1.7 μm;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A相為水,B相為乙腈。等度洗脫條件:A,70%;B,30%。流速:0.2 mL·min-1。熒光檢測波長:發(fā)射波長365 nm;激發(fā)波長:435 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10.3 μg·mL-1)用乙腈稀釋成濃度為103 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL至10 mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容至刻度,搖勻,配制為0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.4 樣品前處理

    1.4.1 樣品提取

    樣品提取參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》(GB 5009.24—2016)第二法高效液相色譜法12.1進(jìn)行處理后,樣液備用。

    1.4.2 凈化

    免疫親和柱取出恢復(fù)至室溫。將免疫親和柱連接于50 mL注射器下,空氣壓力泵與免疫親和柱連接,免疫親和柱內(nèi)的液體放空后,將上述樣液移至50 mL注射器筒中,調(diào)節(jié)壓力使溶液以2~3 mL·min-1(1~2滴/s)流速緩慢通過免疫親和柱,至溶液全部抽空。更換10 mL注射器與親和柱連接,在注射器中加入10 mL水,調(diào)節(jié)壓力使水以6 mL·min-1流速清洗親和柱;準(zhǔn)確加入4 mL乙腈洗脫,流速為1~2 mL·min-1,收集全部洗脫液于玻璃試管中,在50 ℃下氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?,用初始流?dòng)相定容至1 mL,渦旋30 s溶解殘留物,用0.22 μm濾膜過濾,收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜條件選擇

    2.1.1 檢測波長選擇

    在相同儀器條件下噪音水平相當(dāng),峰高越高靈敏度越高。對比不同波長的響應(yīng)效果,在其他條件一致的情況下,發(fā)射波長365 nm,激發(fā)波長435 nm處的峰響應(yīng)比發(fā)射波長360 nm,激發(fā)波長430 nm處的峰響應(yīng)更高,見圖1。因此選用發(fā)射波長365 nm,激發(fā)波長435 nm。

    2.1.2 流動(dòng)相選擇

    對比水-(甲醇+乙腈)(70∶30)、水-(甲醇+乙腈)(75∶25)、水-乙腈(70∶30)和水-乙腈(75∶25)4種流動(dòng)相體系,發(fā)現(xiàn)使用水-乙腈、水-(甲醇+乙腈)均能夠有效分離黃曲霉毒素M1。由圖2可以看出,使用水-乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí),峰響應(yīng)要優(yōu)于水-(甲醇+乙腈)的流動(dòng)相體系。水-乙腈(70∶30)的流動(dòng)相體系和水-乙腈(75∶25)的流動(dòng)相體系可以獲得相似的保留情況,但使用水-乙腈(70∶30)作為流動(dòng)相可以獲得更尖銳的峰形,從而提高靈敏度。因此本文選擇使用水-乙腈(70∶30)作為流動(dòng)相。

    2.2 方法的線性范圍、檢出限及定量限

    采用質(zhì)量濃度為0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)樣分析,以黃曲霉毒素M1濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,黃曲霉毒素M1在0.051 5~5.150 0 ng·mL-1線性關(guān)系良好,線性方程為Y=4.00×105X-8.74×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 867。

    2.3 方法的檢出限和定量限

    以3倍基線噪音時(shí)的濃度為檢出限衡量指標(biāo)(S/N≥3),黃曲霉毒素M1在0.02 μg·kg-1濃度添加量的信噪比(S/N)12.06>3。以10倍基線噪音時(shí)的濃度為定量限衡量指標(biāo)(S/N≥10),黃曲霉毒素M1在0.05 μg·kg-1添加量的信噪比38.62>10。方法的檢出限、定量限符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》(GB 5009.24—2016)的規(guī)定。

    2.4 方法回收率和精密度

    準(zhǔn)確稱取空白樣品3組,每組6份,分低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo),加標(biāo)量為0.07 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1,按照1.4步驟處理后進(jìn)行測定,計(jì)算平行樣品黃曲霉毒素M1測定結(jié)果的回收率和精密度,結(jié)果見表1?!秾?shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄F.1回收率中規(guī)定被測組分含量<0.1 mg·kg-1,回收率在60%~120%;附錄F.3精密度中規(guī)定被測組分含量≤0.1 μg·kg-1時(shí),變異系數(shù)<43%,被測組分含量在0.1~1.0 μg·kg-1時(shí)變異系數(shù)小于30%[11]。本實(shí)驗(yàn)平均加標(biāo)回收率為81.0%~90.3%,變異系數(shù)為0.72%~3.18%,符合要求。

    2.5 正確度

    選用中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心的能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行黃曲霉毒素M1的檢測,檢測結(jié)果見表2。由表2可知,本實(shí)驗(yàn)室與能力驗(yàn)證樣品指定值的檢測偏差為0.36%,說明該方法正確度較好。

    2.6 樣品分析

    《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中規(guī)定嬰幼兒配方食品黃曲霉毒素M1不得超過0.5 μg·kg-1[12]。隨機(jī)抽取某公司的嬰幼兒配方產(chǎn)品3批次,使用該方法進(jìn)行黃曲霉毒素M1的測定,結(jié)果均為未檢出(<0.02 μg·kg-1),檢測結(jié)果符合限量要求。

    3 結(jié)論

    本文建立了測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的超高效液相色譜法,結(jié)果表明該方法的檢出限、定量限、回收率、精密度及正確度較好,能夠用于嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的準(zhǔn)確測定。

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    [12]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會,國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量:GB 2761—2017[S].北京:國家標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

    作者簡介:楊雅雯(1987—),女,江西九江人,本科,助理工程師。研究方向:食品檢測。

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