直絲紫鏈霉菌A8發(fā)酵條件優(yōu)化、活性成分初步分析及對水稻紋枯病的防效研究

王明環(huán)，孫愛麗，趙聯(lián)晶，劉 列，趙添琦，董文漢，羅 瓊，黃惠川，李成云*，楊根華*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)/省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，昆明 650201）

水稻紋枯?。≧ice sheath blight disease）是由立枯絲核菌Rhizoctonia solani感染的真菌病害，是當(dāng)前水稻生產(chǎn)上的主要病害之一[1]。為了控制水稻病害，生物防治因?yàn)榫G色、高效、無公害的特點(diǎn)已經(jīng)成為當(dāng)今防治水稻病害的研究熱點(diǎn)[2]。諸多學(xué)者利用拮抗微生物包括拮抗真菌、細(xì)菌和放線菌或者其代謝產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)作為生物防治的材料來控制水稻病害的發(fā)生[3,4]。放線菌是環(huán)境中廣泛存在的一類微生物，能夠產(chǎn)生抗病原菌的生物活性物質(zhì)[5-7]。數(shù)據(jù)顯示，放線菌產(chǎn)生的10000多種生物活性次生代謝物中，有7600多種來自鏈霉菌屬，約占75%[8,9]，顯示了鏈霉菌作為藥物生產(chǎn)者的巨大價(jià)值。過去十年，不同環(huán)境中分離的鏈霉菌分泌的生物活性新型代謝物數(shù)量在不斷增長。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同主要分為多肽、醌類、大環(huán)內(nèi)酯類、萜烯類、聚酮類、吲哚類、酶、酶抑制劑以及脂類等[10]。鏈霉菌主要用于醫(yī)用抗生素和農(nóng)用抗生素的生產(chǎn)，其中產(chǎn)業(yè)化的農(nóng)用抗生素對防治農(nóng)作物病害有著重大的作用，但就目前抗生素的數(shù)量、質(zhì)量和品種而言還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要[11]。從現(xiàn)有的知識和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，鏈霉菌在未來的很長一段時(shí)間里仍是抗生素的主要來源[8]。

直絲紫鏈霉菌A8屬于鏈霉菌屬，是本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離出的一株拮抗放線菌，對引起煙用香精香料變質(zhì)的微生物包括芽胞桿菌、醋酸桿菌、土壤球菌均有明顯的抑制作用[12]，且對立枯絲核菌也有一定的抑制作用。前人對直絲紫鏈霉菌的研究較少，僅李紀(jì)順等[13]報(bào)道從山東省科學(xué)院中試基地內(nèi)的番茄根際土中分離出一株同源性與直絲紫鏈霉菌達(dá)98.9%的菌株A-29，對供試的8種植物病原真菌均有拮抗作用，且從其發(fā)酵上清液中鑒定出 4種可能起抑菌作用的活性物質(zhì)。直絲紫鏈霉菌A8發(fā)酵液中含有抑菌的活性物質(zhì)，為了進(jìn)一步提高其活性物質(zhì)的產(chǎn)量及增強(qiáng)抑菌作用，我們對直絲紫鏈霉菌A8的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件包括接種量，裝液量、初始pH和發(fā)酵溫度進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)為解析該活性物質(zhì)的構(gòu)成，本研究對菌株 A8所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物通過氣相色譜?質(zhì)譜技術(shù)（GC?MS）進(jìn)行初步檢測。將分離和鑒定出的不同組分以分析純物質(zhì)替代，以蠟狀芽胞桿菌和立枯絲核菌AG-1作為指示菌進(jìn)行生物活性測定試驗(yàn)，探究菌株A8代謝活性物質(zhì)從細(xì)菌到真菌的廣譜抗性。進(jìn)而研究菌株A8固體發(fā)酵制劑對水稻紋枯病的大田防控效果，探究其在水稻紋枯病病害生物防治中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

直絲紫鏈霉菌S.rectiviolaceus A8由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存，蠟狀芽胞桿菌B.cereus和立枯絲核菌R.solani AG-1均由本實(shí)驗(yàn)室提供，枯草芽胞桿Bacillus subtilis BT205由云南星耀生物制品有限公司提供，供試水稻品種為云粳37由楚雄市植保植檢站提供。

1.2 培養(yǎng)基及種子液的制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%；LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂 2%；種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉 2%，NaCl 0.05%，KNO30.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH 7.5，發(fā)酵基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH 7.5，碳、氮源按照試驗(yàn)要求加入。

將直絲紫鏈霉菌A8均勻涂布于種子固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d至培養(yǎng)基表面菌苔出現(xiàn)紫褐色孢子。將活化好的菌株A8孢子用打孔器打成菌餅，挑取10個(gè)大小相似的菌餅接入種子培養(yǎng)基（500 mL錐形瓶裝液量200 mL），25 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，即得種子液。然后以10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL錐形瓶裝液量100 mL），相同條件培養(yǎng)7 d。

1.3 發(fā)酵碳、氮的優(yōu)化

1.3.1 碳源的選擇 玉米粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，以不接菌株A8但含有不同碳源的培養(yǎng)液作為空白對照，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min發(fā)酵7 d，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測定菌株A8菌體干重及采用牛津杯法測定菌株A8上清液對蠟狀芽胞桿菌抑菌圈的大?。ㄏ峦?，篩選出合適的碳源。菌絲干重測定[14]：取每種培養(yǎng)基的發(fā)酵液50 mL至已烘干稱重的離心管（W0）中，6000 r/min離心10 min，棄去上清液，將帶菌體的離心管置于65 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重(W1)，換算出1000 mL發(fā)酵液中菌絲體的干重，用質(zhì)量濃度表示菌體干重（g/L），計(jì)算公式為W＝（W1―W0）×1000/50。抑菌圈的測定[15]：將不同處理的發(fā)酵液6000 r/min離心15 min，發(fā)酵上清液用0.45 μm濾膜過濾除菌，同時(shí)將蠟狀芽胞桿菌（濃度約為1×107cfu/mL）菌懸液加入溶化冷卻至50 ℃的LB培養(yǎng)基中，混勻制成含菌培養(yǎng)基，將牛津杯（內(nèi)徑6 mm）置于平板上，加入200 μL發(fā)酵濾液，對照組中加入200 μL相應(yīng)的培養(yǎng)液。然后將平板于25 ℃條件下培養(yǎng)24 h，之后測量透明圈直徑（透明圈＞6 mm，說明具有抑菌作用）。

1.3.2 氮源的選擇 分別以酵母膏、黃豆粉、牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2SO4和NH4Cl和KNO3作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，以不接菌株A8但含有不同氮源的培養(yǎng)液作為空白對照，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min發(fā)酵7 d，測定菌株A8菌體干重和抑菌圈的直徑。

1.3.3 氮源比例的確定 分別將黃豆粉和酵母膏以4:1、3:2、2:3和1:4比例總共0.1%的用量作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，以不接菌株A8但含有不同比例氮源的培養(yǎng)液作為空白對照，接入種子液，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)7 d后測定菌株A8菌體干重和抑菌圈的直徑。

1.3.4 碳、氮源濃度的初步確定 采用正交法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，把已篩選出的合適碳、氮源分別以濃度梯度加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，發(fā)酵7 d，測定不同碳、氮源濃度發(fā)酵液的菌株A8菌體干重和抑菌圈大小，以確定最佳的碳、氮源濃度。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化 將種子液接入優(yōu)化碳、氮源后的培養(yǎng)基培養(yǎng)，從第1 d到第12 d每天分別取樣，過濾后取上清液放入4 ℃冰箱中備用，取樣全部結(jié)束后測定發(fā)酵液菌株A8菌體干重和抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.2 裝液量的優(yōu)化 在500 mL錐形瓶中分別裝入100、150、200、250、300、350 mL優(yōu)化碳、氮源的培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)8 d，測定不同裝液量條件下發(fā)酵液菌株A8菌體干重和抑菌活性。

1.4.3 接種量的優(yōu)化 用優(yōu)化碳、氮源后的培養(yǎng)基，分別按3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的接種量接入種子液，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)8 d，測定不同接種量條件下發(fā)酵液的菌體干重和抑菌活性。

1.4.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 將種子液按7%接種量接種于優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，將發(fā)酵培養(yǎng)基分別在22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)8 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，測定不同溫度條件下菌株A8菌體干重和抑菌活性，篩選出最適發(fā)酵溫度。

1.4.5 初始pH的優(yōu)化 將發(fā)酵液初始pH分別調(diào)節(jié)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，每個(gè)處理重復(fù)3次，7%接種量接入種子液，28 ℃、120 r/min發(fā)酵8 d，測定不同初始pH條件下菌株A8菌體干重和抑菌活性，篩選出最適的初始pH。

1.5 活性物質(zhì)粗提物的制備

取10 L菌株A8發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液8000 r/min離心10 min，吸取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，得到含有活性物質(zhì)的發(fā)酵濾液。乙酸乙酯作為萃取劑，與濾液等體積混合于1000 mL分液漏斗中，充分振蕩后室溫靜置15 min，收集上層有機(jī)相于1000 mL錐形瓶中，萃取操作重復(fù)3次，使物質(zhì)萃取充分，每1000 mL有機(jī)相中加入10 g無水硫酸鈉，室溫過夜干燥脫水。有機(jī)相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮，以回收液成滴狀下流為最佳蒸餾狀態(tài)。收集濃縮物，加入乙酸乙酯定量至1000 μL，用0.20 μm針式濾膜過濾器2次過濾后收集于1.5 mL棕色樣品瓶中[16]。

1.6 有機(jī)相和無機(jī)相抑菌活性的測定

將10 L乙酸乙酯萃取的發(fā)酵濾液有機(jī)相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃蒸餾濃縮至干，得到的黃褐色膏狀粗提物經(jīng)DMSO溶解，稀釋成1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%的DMSO溶解液，采用平板對扣法以立枯絲核菌為指示菌測定其抑菌活性，方法為：吸取400 μL不同濃度粗提物的DMSO溶液均勻涂布在PDA平板上，取活化好的立枯絲核菌菌餅，接于PDA平板中央，與涂有粗提物的DMSO溶液平板對扣、密封，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以涂布400 μL DMSO溶液的平板作為對照，待對照平板菌絲長滿培養(yǎng)皿時(shí)觀察并測量各培養(yǎng)皿的菌落直徑，每處理5個(gè)重復(fù)[17]，抑制效果用抑制率表示，抑制率（%）＝（對照培養(yǎng)菌落直徑—處理菌落直徑）/（對照培養(yǎng)菌落直徑—菌餅直徑）×100。

1.7 菌株A8揮發(fā)性活性成分的GC-MS檢測

將1.5中收集的粗提物采用島津GCMS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測定。GC條件：進(jìn)樣口溫度 250 ℃，柱箱溫度 65 ℃；進(jìn)樣方式：分流；載氣：He；初始壓力 500～900 kPa；流量控制方式：線速度；壓力：59.4 kPa；總流量：24.0 mL/min；柱流量：1.0 mL/min；線速度 36.6 cm/sec；吹掃流量：3.0 mL/min；分流比：20.0。MS條件：離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時(shí)間：3 min；檢測器電壓：0.1 kV。利用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對含量，3次重復(fù)檢測。

1.8 揮發(fā)性純品物質(zhì)對絲核菌AG-1的抑菌檢測

用分析純品物質(zhì)代替氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）分離鑒定出的不同組分來檢測不同組分的生物活性。分別吸取揮發(fā)性活性物質(zhì)400 μL以25、125、250、500、1000 μL/mL的濃度梯度均勻涂布在PDA平板上，采用1.6中平板對扣法[17]測定揮發(fā)性純品物質(zhì)的抑菌活性。

1.9 揮發(fā)性純品物質(zhì)對蠟狀芽胞桿菌的抑菌檢測

將分析純品物質(zhì)分別用20%的DMSO溶解并配制成濃度為10、50、100、200、400 μg/mL的溶液，以20%的DMSO無菌溶液作為對照，采用1.3.1中牛津杯法[15]測定不同濃度的純品物質(zhì)對蠟狀芽胞桿菌的抑菌圈大小，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.10 直絲紫鏈霉菌A8對水稻紋枯病的田間防效

1.10.1 菌株A8生防固體制劑的制備 由于固態(tài)菌劑的菌體孢子數(shù)量大，且便于保存和運(yùn)輸，將谷殼、麥麩和水以3:2:3的配比總共800 g加入到5 L的錐形瓶中，滅菌，每個(gè)錐形瓶中接入400 mL菌株A8發(fā)酵液，每天搖晃3～4次，使之均勻混合。室溫發(fā)酵10 d后倒出在陰涼處晾干備用。

1.10.2 大田試驗(yàn)區(qū)設(shè)計(jì) 根據(jù)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)實(shí)際，試驗(yàn)時(shí)間為2019年4月4—24日。試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在云南省楚雄市東華鎮(zhèn)新柳村委會苴午村（N24°57′39.98″，E101°28′51.40″）。稻田土壤肥力中等，常年稻瘟病、紋枯病發(fā)生較重。試驗(yàn)小區(qū)采用單因素隨機(jī)區(qū)組排列設(shè)計(jì)，設(shè)6個(gè)處理，分別為：CK（對照）、F-1（40%稻瘟靈乳油）、BT（枯草芽胞桿菌BT205）、A8-1（250 g菌株A8生防固體制劑）、A8-2（450 g菌株A8生防固體制劑）、A8-3（650 g菌株A8生防固體制劑），每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)10 m2，試驗(yàn)田總面積1200 m2。

生防菌施用時(shí)間、用量和方法：7月15號水稻分蘗中期和8月10號孕穗期F-1小區(qū)施用40%稻瘟靈1.2 mL，兌水750 mL，噴霧施藥；7月29號在水稻處于孕穗期，施入A8生防菌到水稻田中，均勻撒開，其中A8-1小區(qū)施用250 g菌株A8固體生防制劑，A8-2小區(qū)施用450 g菌株A8固體生防制劑，A8-3小區(qū)施用650 g菌株A8固體生防制劑；同時(shí)BT小區(qū)施入枯草芽胞桿菌BT205，每個(gè)小區(qū)施用2 g，兌水1000 mL，在水稻抽穗后（施藥后28 d）開始調(diào)查病害。

1.10.3 病害程度和發(fā)病率調(diào)查 在水稻生長至分蘗末期和抽穗前期，此時(shí)試驗(yàn)小區(qū)中的環(huán)境高溫高濕，易發(fā)生病害，此時(shí)調(diào)查水稻的總株數(shù)、病株數(shù)和病情指數(shù)。分級標(biāo)準(zhǔn)：0級（植株健康，全株無?。?級（稻株基部葉鞘或葉片發(fā)病，3級（頂葉或劍葉以下第三葉鞘、葉片發(fā)?。?，5級（頂葉或劍葉以下第二葉鞘、葉片發(fā)?。?，7級（頂葉或劍葉以下第二葉鞘、葉片發(fā)?。?級（頂葉葉鞘、葉片發(fā)病[18]。發(fā)病率（%）＝（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%，病情指數(shù)＝∑（病級株數(shù)×各級代表數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級代表數(shù)值）×100。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選結(jié)果

不同碳源培養(yǎng)基中，玉米粉和可溶性淀粉有利于菌株A8的生長，菌體干重分別3.12和2.29 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）；可溶性淀粉處理的抑菌圈直徑最大，為19.3 mm，顯著高于以玉米粉作為碳源的處理（P＜0.05），更有利于菌株A8代謝活性物質(zhì)的產(chǎn)生（表1）。因此，綜合考慮選用可溶性淀粉作為最佳碳源。

2.2 氮源篩選結(jié)果

不同氮源試驗(yàn)處理中，酵母膏和黃豆粉有利于菌株A8發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)，抑菌圈直徑分別為22.7和21.2 mm，顯著高于蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4等處理（P＜0.05）；在不同氮源菌株A8的生物量上，黃豆粉和蛋白胨處理的菌體干重最大，為4.51和4.22 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）（表2）。但蛋白胨價(jià)格貴，不適于生產(chǎn)應(yīng)用，綜合材料價(jià)格和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量考慮選用酵母膏和黃豆粉作為菌株A8發(fā)酵培養(yǎng)的氮源。

2.3 不同氮源比例試驗(yàn)結(jié)果

不同比例的酵母膏和黃豆粉替代初始培養(yǎng)基中的氮源對菌體生長和抑菌活性影響表明，隨著黃豆粉和酵母膏比例中酵母膏的增加，菌體的生物量隨之減少，而抑菌活性隨之上升，這與不同氮源篩選的試驗(yàn)結(jié)果相吻合。在黃豆粉、酵母膏比例為3:2和2:3時(shí)抑菌活性最高，抑菌圈直徑都為23.2 mm，但黃豆粉、酵母膏比例為3:2時(shí)菌體干重為4.07 g/L，顯著高于黃豆粉、酵母膏比例為2:3組合（P＜0.05）。因此選擇黃豆粉、酵母膏為3:2組合（表3）。

2.4 正交試驗(yàn)對發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇可溶性淀粉作為碳源，黃豆粉和酵母膏比例為3:2作為氮源組合，設(shè)計(jì)A、B兩因素4水平L16（42）正交試驗(yàn)，因素水平和試驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。從表5結(jié)果中可知編號11（組合A3B3）最為合適，該組合中抑菌圈直徑達(dá)到28.2 mm，抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量相較其他試驗(yàn)組合高，菌體干重為7.15 g/L，生物量相對較高，說明菌絲生長狀況良好。故確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉3%、黃豆粉0.6%、酵母膏0.4%、NaCl 0.05%、K2HPO4·3H2O 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeSO4·7H2O 0.001%。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基的L16（42）正交試驗(yàn)因素和水平Table 4 The orthogonal experiment factors and level L16 (42) of optimal medium

2.5 發(fā)酵時(shí)間對菌體生長和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

放線菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，菌株A8對營養(yǎng)物質(zhì)的利用速度在不同發(fā)酵時(shí)間的生長量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量表現(xiàn)出如下規(guī)律，發(fā)酵2 d基本無抑菌活性物質(zhì)分泌，第3 d時(shí)菌株A8有一定的生長量和少量的抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生，此后菌株的生長量和活性物質(zhì)的分泌越來越多，在第8 d達(dá)到最高的生長量和最大抑菌活性，分別為8.04 g/L和28.7 mm，顯著高于前7 d的生長量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量（P＜0.05），第9 d后生長量和抑菌活性有下降的趨勢，但幅度不大（圖1）。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對菌株A8菌體生長和抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different culture time on strain A8 antifungal activity and bacteria growth mass

2.6 裝液量對菌體生長和菌株抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

500 mL錐形瓶中不同體積的培養(yǎng)液造成相對空氣量和傳質(zhì)阻力的不同，不同處理的抑菌圈大小和菌體干重存在著明顯的區(qū)別（表 6）。多個(gè)處理表現(xiàn)出空氣量大，氧氣傳質(zhì)阻力小，菌株生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量高的趨勢。其中100、150、200和250 mL裝液量處理顯著高于300和350 mL處理（P＜0.05）。

表6 不同裝液量對菌株A8菌體生長和抑菌活性的影響Table 6 Effects of different loaded liquid on the antifungal activity and bacteria growth mass of strain A8

2.7 接種量對菌體生長和菌株抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)接種量為3%～7%時(shí)，菌株A8的生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量較高，沒有顯著差異。其中接種量在7%時(shí)，菌株A8的生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量最高，分別為29.5 mm和9.26 g/L。接種量超過7%時(shí)，生長量逐漸降低，接種量為9%～15%處理顯著低于3%～7%處理（P＜0.05）；接種量超過9%時(shí)，活性物質(zhì)產(chǎn)量也逐漸降低，接種量為11%～15%處理顯著低于3%～9%處理（P＜0.05）（表7）。

2.8 培養(yǎng)溫度對菌體生長和菌株抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度在25 ℃～34 ℃，均適合菌株A8的生長，其中28 ℃培養(yǎng)菌株A8的生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為31.0 mm和10.00 g/L；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于22 ℃或者高于34 ℃，都不利于菌株A8的生長，生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量較低，顯著低于其他處理（P＜0.05）（表8）。說明該菌株比較適宜在相對偏高的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

表8 培養(yǎng)溫度對菌株A8菌體生長量和抑菌活性的影響Table 8 Effects of different temperature on antifungal activity and bacteria growth mass of strain A8

2.9 pH對菌體生長和菌株抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH 5.0～10.0均能生長且有抑菌物質(zhì)的分泌，在pH 6.0～9.0的條件下菌株生長量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量較大，其中在 pH 7.0中性條件下菌株生長量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到最大，分別為32.0 mm和10.38 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）。pH 6.0以下或者pH 9.0以上隨著酸度或者堿度的增大，菌株生長量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量都隨之減?。ū?）。

2.10 無機(jī)相和有機(jī)相抑菌活性測定

通過對發(fā)酵濾液粗提物的抑菌活性測定結(jié)果表明，水相中的物質(zhì)對絲核菌AG-1沒有抑制作用，有機(jī)相中存在抑制絲核菌AG-1的活性物質(zhì)，且隨著活性物質(zhì)濃度的增加，抑制率也隨之增加，且不同活性物質(zhì)濃度間的差異顯著（P＜0.05）（圖2）。

2.11 揮發(fā)性活性物質(zhì)分析

菌株A8發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物GC-MS分析總離子流見圖3，由總離子流圖中分離度、分辨率和基線的穩(wěn)定性可看出本次實(shí)驗(yàn)的分離鑒定方法的條件選擇是有效的?？偣卜蛛x出151個(gè)色譜峰，出峰時(shí)間主要集中在前22.5 min和后45 min，中間存在斷斷續(xù)續(xù)出峰的現(xiàn)象，其中在13.5 min左右時(shí)峰面積最大，其次是18、28.5和46 min。

圖3 直絲紫鏈霉菌A8發(fā)酵液乙酸乙酯相GC-MS圖譜Fig.3 The GC-MS spectrum of the Ethyl acetate phase from the strain A8

將所得質(zhì)譜信息與NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照分析，質(zhì)譜峰匹配度大于85的物質(zhì)視為檢出物，按峰面積歸一化法確定各組分在揮發(fā)性物質(zhì)中的相對含量，具體信息詳見表10。菌株A8所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要有醇類、酮類、酰胺類、烷烴類、脂類、羧酸類和芳香烴類物質(zhì)。其中脂類物質(zhì)相對含量最高，達(dá)到15.7%以上，其次為芳香烴類和羧酸類物質(zhì)，相對含量在11.7%和11.3%。

2.12 揮發(fā)性純物質(zhì)對立枯絲核菌的生物活性測定

通過GC-MS分析菌株A8產(chǎn)生的揮發(fā)性活性物質(zhì)，NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索得到26種組分，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，有些物質(zhì)不存在抑菌作用，或者因毒性較高安全起見沒有做相關(guān)生物活性測定試驗(yàn)，此外，還有一些物質(zhì)較難買到，因此總共購得 12 種不同組分的化合物替代菌株A8檢出物進(jìn)行生物活性測定試驗(yàn)。

進(jìn)行生物活性測定試驗(yàn)的 12種分析純物質(zhì)包括：鄰苯二酚（Catechol）、1,2,4,5-四甲基苯（Benzene,1,2,4,5-tetramethyl-）、十六烷（Hexadecane）、鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate）、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate）、鄰苯二甲酸二異辛酯（Diisooctyl phthalate）、鄰苯二甲酸二壬酯（1,2-Benzenedicarboxylic acid,dinonyl ester）、鄰苯二甲酸二（7-甲基辛基）酯（Phthalic acid,bis(7-methyloctyl) ester）、2-呋喃羧酸，酰肼（2-Furancarboxylic acid,hydrazide）、N-（2-苯乙基）-乙酰胺（Acetamide,N-(2-phenylethyl)-）、二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮（2,5-Furandione,dihydro-3-methylene-）、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮（1,2-Cyclopentanedione,3-methyl-）。生測試驗(yàn)結(jié)果表明鄰苯二甲酸二（7-甲基辛基）酯、十六烷、鄰苯二甲酸二壬酯、鄰苯二甲酸二異辛酯和N-（2-苯乙基）-乙酰胺5種物質(zhì)的抑菌率在20%以下。另外7種物質(zhì)的抑菌作用隨著接種濃度的增加而增強(qiáng)，其中 3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1,2,4,5-四甲基苯和二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮的抑菌作用明顯，在接種400 μL時(shí)達(dá)到70%以上（表11）。

2.13 分析純物質(zhì)對蠟狀芽胞桿菌的生物活性測定

通過菌株 A8活性物質(zhì)不同組分對蠟狀芽胞桿菌的抑菌作用研究表明：鄰苯二甲酸二（7-甲基辛基）酯、鄰苯二甲酸二壬酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、1,2,4,5-四甲基苯和十六烷無抑菌圈的形成，對蠟狀芽胞桿菌沒有抑制作用。其他7種化合物對蠟狀芽胞桿菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，都隨著濃度的增加抑菌作用增強(qiáng)，且不同濃度間的差異顯著（P＜0.05）。其中二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮、2-呋喃羧酸，酰肼、鄰苯二酚和3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮在微劑量的濃度（50 μg/mL）下就形成較大的抑菌圈，分別是27.0、25.9、26.7和22.0 mm，二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮、2-呋喃羧酸，酰肼和鄰苯二酚在400 μg/mL的濃度下更是達(dá)到37.0、34.7和33.0 mm（圖4）。

2.14 生防菌A8對水稻紋枯病發(fā)病程度的防治結(jié)果

由表12可知，施藥后28 d，施了稻瘟靈和生防菌的水稻的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.05）。發(fā)病率和病情指數(shù)由高到低的處理分別為A8-3、A8-2、枯草芽胞桿菌、A8-1、稻瘟靈以及對照組，A8防效與枯草芽胞桿菌相近，且隨A8施加量的增加，對水稻紋枯病的防效越好。

表12 生防菌和農(nóng)藥對水稻紋枯病的田間防效Table 12 Field control effects of biocontrol bacteria and pesticides on rice sheath blight

3 討論

放線菌的生長繁殖和生物活性次生代謝產(chǎn)物的分泌與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和環(huán)境條件密切相關(guān)，針對篩選出的有拮抗活性的放線菌深入地研究其營養(yǎng)及發(fā)酵條件，對于拮抗放線菌的進(jìn)一步開發(fā)研究及以后可能的工廠化生產(chǎn)均有重要意義[19]。直絲紫鏈霉菌A8在不同的營養(yǎng)和環(huán)境條件下菌絲生長量和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量有著顯著的差異。在營養(yǎng)條件方面，可溶性淀粉和玉米粉作為緩效碳源比起葡萄糖、麥芽糖等速效碳源更加有利于菌株A8菌絲的生長和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。Nagato等[20]研究發(fā)現(xiàn)速效碳葡萄糖有利于Streptomyces griseoviridus G-89菌絲體的生長，但肽內(nèi)酯抗生素neoviridogrisein II的產(chǎn)量低，而以緩效碳作為碳源時(shí)，菌株G-89的生長雖慢，但是抗生素產(chǎn)量高。黃豆粉和酵母膏組合作為有機(jī)氮源其菌絲生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量比起無機(jī)氮源KNO3要更高，說明有機(jī)氮源更加適合菌株A8的發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源正交實(shí)驗(yàn)中，適量的增加培養(yǎng)基中碳、氮源的含量能明顯提高菌株A8的菌絲生長量和活性物質(zhì)的產(chǎn)量，但是可溶性淀粉、黃豆粉和酵母膏含量過大后，培養(yǎng)基的液態(tài)性較差而影響搖床培養(yǎng)，因此兼顧較好的產(chǎn)量及培養(yǎng)液性狀，選擇3%含量的可溶性淀粉，0.6%黃豆粉和0.4%酵母膏作為最佳的碳、氮源配比濃度。同時(shí)碳、氮源配比濃度的增加菌株A8的生物量也更高，但是其活性物質(zhì)的產(chǎn)量并沒有隨之增加，說明菌株A8次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量并不完全由菌絲體的生物量決定，其代謝途徑復(fù)雜[11]。發(fā)酵環(huán)境條件對菌株A8的發(fā)酵培養(yǎng)也有著顯著的影響，研究結(jié)果表明，該菌株最適宜的培養(yǎng)溫度是28 ℃～31 ℃，初始pH 7.0～8.0，裝液量是500 mL錐形瓶裝液100～200 mL，相對空氣量高、氧氣傳質(zhì)阻力小更有利于菌株A8的生長，接種量3%～7%，過高的接種量其次生代謝物質(zhì)含量高從而在菌株A8生長前期階段可能影響其擴(kuò)大生長繁殖。本試驗(yàn)菌株A8發(fā)酵條件的優(yōu)化是在高氏一號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，雖然菌絲的生物量和代謝活性物質(zhì)產(chǎn)量經(jīng)過碳、氮源以及發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化有一定的提高，但是相關(guān)微量元素如Na+、K+、Fe2+等的優(yōu)化并未驗(yàn)證，有待進(jìn)一步的研究。

利用鏈霉菌等拮抗微生物的生物活性次級代謝產(chǎn)物是防治植物病害的一種有效途徑[21]。最近研究表明，微生物揮發(fā)性有機(jī)化合物(MVOCs)在抑制病原菌生長，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和對非生物脅迫的耐受性有著重要的影響[22,23]。近些年來，Ahsan等[7]通過GC-MS技術(shù)從鏈霉菌KX852460產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中提取和鑒定出二十烷、鄰苯二甲酸二丁酯等抗真菌活性物質(zhì)，能抑制絲核菌AG-3菌株的生長。Jalaluldeen等[24]從辣椒根際土壤分離的鏈霉菌 KJ872546產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中鑒定出的主要成分有六氫-吡咯并{1,2-a}吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo{1,2-a}pyrazine-1,4-dioe,hexahydro-）、六氫-3-（2-甲基丙基）-吡咯并{1,2-a}吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo{1,2-a}pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(2-methylpropyl)-）和 5,10-二乙氧基-2,3,7,8-四氫-1H，6H-二吡咯并{1,2-a; 1,2-d}吡嗪（5,10-Diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo{1,2-a;1,2- d}pyrazine）等物質(zhì)，其能抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長。Prabavathy等[25]從鏈霉菌PM5中分離得到兩種脂肪族化合物 SPM5C-1和SPM5C-2分別帶有內(nèi)酯和酮羰基，兩種化合物對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用。但是這些報(bào)道的生防菌只是對真核真菌具有抑制作用。本研究直絲紫鏈霉菌A8次級代謝物質(zhì)中含有豐富的生物活性化合物，在進(jìn)行生物活性測定試驗(yàn)的12種分析純物質(zhì)中，鄰苯二酚、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、2-呋喃羧酸，酰肼、二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮和3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮對立枯絲核菌AG-1和蠟狀芽胞桿菌的生長均具有抑制作用，其中3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮和二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮在低濃度下就能對立枯絲核菌AG-1和蠟狀芽胞桿菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，具有潛在的同時(shí)抑制真菌和細(xì)菌的作用，為開發(fā)廣譜生防制劑提供很好的材料。目前關(guān)于這兩種酮類揮發(fā)性物質(zhì)對立枯絲核菌 AG-1和蠟狀芽胞桿菌的抑制效果尚未報(bào)道，針對其抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究只進(jìn)行了菌株A8的揮發(fā)性活性物質(zhì)的檢測鑒定，關(guān)于其非揮發(fā)性活性物質(zhì)還有待研究。

目前，國內(nèi)外用于防治水稻紋枯病的微生物主要有真菌中的木霉菌Trichoderma sp.[26]、細(xì)菌中的芽胞桿菌Bacillus sp.[27,28]和假單胞菌Pseudomonas sp.[29]，以及放線菌中的鏈霉菌Streptomyces sp.等[30,31]，但尚未有用直絲紫鏈霉菌防治水稻紋枯病的研究報(bào)道。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)直絲紫鏈霉菌A8對水稻紋枯病有一定的防效，為水稻紋枯病病害的生物防控提供新的生防材料。