梨炭疽菌拮抗細(xì)菌CL01的鑒定及其抗菌活性

李朝輝，包 艷，苗成琪，凌 軍，孫偉波，趙延存，徐會(huì)永，劉鳳權(quán)

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京 210014）

梨是世界第三大水果，我國(guó)梨產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的2/3，出口量占世界總出口量的1/6[1]。梨作為我國(guó)最主要的水果產(chǎn)業(yè)之一，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，但在梨的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)受到多種病原真菌的危害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。近年來(lái)，梨炭疽病在中國(guó)發(fā)生頻繁且危害嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重制約了我國(guó)梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。2008年，梨炭疽病在碭山大爆發(fā)，部分發(fā)病嚴(yán)重的梨園，采前病果率為100%，爛果率高達(dá)70%以上，全縣直接經(jīng)濟(jì)損失7～8億元，當(dāng)?shù)乩娈a(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失慘重[4,5]。如何對(duì)梨炭疽病進(jìn)行安全有效的防治已成為梨生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題之一。

目前，梨炭疽病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但是長(zhǎng)期單一用藥等因素造成病原菌的抗藥性逐漸增強(qiáng)，農(nóng)藥施用劑量盲目增加，且防治效果不理想[6,7]。此外，化學(xué)農(nóng)藥的使用也容易造成殘留危害人們的健康，在日趨嚴(yán)格的殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)下，也降低梨的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給果農(nóng)帶來(lái)?yè)p失[8,9]。因此，對(duì)環(huán)境友好的生物防治方法在梨的生產(chǎn)中已經(jīng)越來(lái)越被重視。梨炭疽病的生物防治方面，錢(qián)鑫磊等[10]報(bào)道了一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌能夠抑制梨膠孢炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，劉郵洲等[11]報(bào)道了一株枯草芽胞桿菌對(duì)梨炭疽病菌有較好的拮抗作用，郭志華等[12]從碭山梨中分離得到一株內(nèi)生的枯草芽胞桿菌可提高碭山梨果實(shí)對(duì)病菌的抗性。通常來(lái)源不同的菌株在生物學(xué)特性、抗菌譜等方面存在明顯差異，具有菌株特異性。發(fā)掘能夠?qū)娉Ｒ?jiàn)真菌病害具有與防治效果的生防菌株對(duì)于開(kāi)發(fā)新的微生物殺菌劑具有重要的意義和價(jià)值。

根據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)的農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)[13]，目前我國(guó)已登記的有效成分包含芽胞桿菌和類芽胞桿菌的生物殺菌劑已達(dá)138個(gè)。其中枯草芽胞桿菌已登記用于蘋(píng)果炭疽病的防治，多粘類芽胞桿菌已登記用于西瓜炭疽病的防治。目前，梨樹(shù)上尚無(wú)生防菌劑登記，類芽胞桿菌屬細(xì)菌用于梨炭疽病的防治還無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究的目的是進(jìn)一步發(fā)掘生防菌株資源，為梨炭疽病的防治提供新的選擇。本研究通過(guò)對(duì)梨根際土壤細(xì)菌的分離，得到了1株對(duì)梨炭疽病菌具有較好拮抗效果的生防細(xì)菌CL01，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)生防菌株CL01進(jìn)行了鑒定，并初步明確了CL01抑制梨炭疽菌的作用機(jī)制，評(píng)估了CL01發(fā)酵液及其正丁醇粗提物對(duì)梨果實(shí)炭疽病的防治效果，以期為類芽胞桿菌CL01開(kāi)發(fā)成為防治梨真菌病害的生防菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 生防菌株CL01為本實(shí)驗(yàn)室從江蘇句容梨園根際土壤分離篩選獲得。供試病原真菌包括梨炭疽病菌Colletotrichum fructicola、梨黑斑病菌Alternaria alternata、梨輪紋病菌Botryosphaeria dothidea、梨梨腐爛病菌Valsa mali var.pyri、水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、馬鈴薯晚疫病菌Phytophthora infestans、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和油菜菌核病菌Sclerotinia scleotiorum，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 蛋白胨牛肉粉固體培養(yǎng)基（NA）[14]用于活化、純培養(yǎng)細(xì)菌；蛋白胨牛肉粉液體培養(yǎng)基（NB）用于活化搖培細(xì)菌；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）[15]用于活化、培養(yǎng)病原菌及拮抗譜測(cè)定；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）用于搖培誘導(dǎo)梨炭疽菌產(chǎn)生分生孢子；M3S培養(yǎng)基[16,17]用于梨炭疽菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌株CL01的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征鑒定 將菌株CL01劃線接種到NA平板上，將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。菌體的透射電鏡形態(tài)觀察參考魏荷芬等[18]方法進(jìn)行，取NA培養(yǎng)基上的CL01單菌落，用NB培養(yǎng)基搖培12 h后離心收集菌體，首先用2.5%的戊二醛固定12 h，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）漂洗3次，15 min/次，4 ℃、3000 r/min離心10 min收集菌體，鎢酸銨負(fù)染色，干燥后用透射電鏡觀察。革蘭氏染色和菌株的生理生化反應(yīng)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]進(jìn)行。

1.2.2 生防菌株CL01的分子鑒定 收集CL01菌體后使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自北京天根生化科技有限公司 貨號(hào)：DP302-02）按照操作說(shuō)明書(shū)提取菌株CL01的基因組DNA。采用16S rDNA通用引物 27F（5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′）和 1492R（5′?TACGGCTACCTTGTTACGACTT?3′）[19]擴(kuò)增 CL01的 16S rDNA 序列。采用引物對(duì) rpoB1689f_AW（5′?AACATTGGTTTGATCAAC?3′）和rpoB2335_R（5′?AACATTGGTTTGATCAAC?3′）[20]擴(kuò)增 CL01 的 rpoB 基因序列。 PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：ddH2O 21 μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）25 μL，27F 和 1492R 引物各 1 μL，模板 2 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性1 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72 ℃下延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)誤后送至上海生工測(cè)序，所測(cè)的序列在GenBank中進(jìn)行BLASTA 序列相似性比對(duì)。選取比對(duì)結(jié)果中相似性高的模式菌株序列，使用MEGA 7.0.26軟件進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.3 生防菌株CL01對(duì)梨炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性測(cè)定 采用平板對(duì)峙法[21]測(cè)定CL01對(duì)梨炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性。將梨炭疽菌接種于PDA上進(jìn)行活化，置于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d后備用。將CL01單菌落接種于NB培養(yǎng)基中28 ℃搖培24 h備用。用直徑為5 mm的打孔器在梨炭疽菌菌落邊緣處打取菌餅，接種于新的PDA平板中央。在接種的菌餅兩側(cè)距培養(yǎng)皿邊緣為皿直徑 1/4處用滅菌的平頭牙簽蘸取CL01菌液畫(huà)兩道平行的線，然后將培養(yǎng)皿放入28 ℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)4 d后，測(cè)量抑菌帶寬度，并用光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX31）拍攝受抑制一側(cè)真菌菌落邊緣菌絲的分支情況。

1.2.4 生防菌株CL01對(duì)梨炭疽菌分生孢子萌發(fā)的抑菌活性測(cè)定 用PDB液體培養(yǎng)基搖培梨炭疽菌的菌餅誘導(dǎo)其產(chǎn)生分生孢子[22]。搖培3 d后用無(wú)菌濾布過(guò)濾，離心收集分生孢子備用。將CL01單菌落接種于NB培養(yǎng)基中28 ℃搖培24 h后備用。將分生孢子加入M3S培養(yǎng)基中，濃度調(diào)為2×105分生孢子/mL。分別吸取15 μL分生孢子懸浮液和15 μL生防菌CL01菌液滴加在載玻片上混合均勻，放入鋪有吸水濾紙的保鮮盒中，于28 ℃保濕培養(yǎng)。以不加生防菌液和加入無(wú)生防作用的大腸桿菌Escherichia coli菌液的分生孢子懸浮液作為兩組對(duì)照。分別在孵育后4、8、12、24 h用光學(xué)顯微鏡觀察拍照并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.2.5 掃描電鏡觀察生防菌株CL01處理對(duì)梨炭疽菌菌絲的影響 同1.2.4的方法獲得濃度為2×105孢子/mL的梨炭疽菌分生孢子懸浮液和CL01搖瓶發(fā)酵菌液。吸取20 μL分生孢子懸浮液滴加在蓋玻片上孵育12 h使其萌發(fā)形成菌絲，然后在每個(gè)菌絲培養(yǎng)物液滴中加入10 μL的CL01發(fā)酵液繼續(xù)共培養(yǎng)6 h。以不加生防菌液和加入無(wú)生防作用的大腸桿菌菌液的分生孢子懸浮液作為兩組對(duì)照。將處理組和對(duì)照組的蓋玻片分別放入盛有1×PBS的培養(yǎng)皿中輕柔漂洗3遍，然后滴加500 μL 2.5%的戊二醛到蓋玻片上，放入4 ℃冰箱固定過(guò)夜。樣品的后續(xù)處理過(guò)程參考范瑛閣等[23]的方法進(jìn)行，磷酸緩沖液浸泡2次，每次15 min；然后在10%、20%、30%、50%、70%、90%梯度酒精浸泡，每次15 min；最后100%酒精浸泡2次，每次20 min；叔丁醇沖洗2次，最后1次放4 ℃冰箱固化；K750X冷凍干燥機(jī)冷凍干燥；ETD-2000小型離子濺射儀鍍金；ZEISS EVO-LS10掃描電鏡觀察，拍照。

1.2.6 生防菌株CL01抑菌活性物質(zhì)的粗提取及其在PDA平板上的抑菌活性測(cè)定 菌株CL01發(fā)酵液的粗提取參考王雨等[24]的研究方法進(jìn)行。將菌株CL01接種于LB液體培養(yǎng)基中，置 28 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 48 h后，得到菌株 CL01 發(fā)酵液。分別采用正丁醇萃取法、乙酸乙酯萃取法和硫酸銨飽和沉淀法獲得相應(yīng)的發(fā)酵液提取物。正丁醇萃取法[24]：用正丁醇有機(jī)溶劑對(duì)CL01發(fā)酵液按照 1:1 的比例進(jìn)行萃取，得到上層正丁醇萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥得到正丁醇粗提物，用甲醇作為溶解劑將正丁醇粗提物調(diào)至濃度為50 mg/mL。乙酸乙酯萃取法[25]：用乙酸乙酯有機(jī)溶劑對(duì)CL01發(fā)酵液按照 1:1 的比例進(jìn)行萃取，得到上層乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥得到乙酸乙酯粗提物，用甲醇作為溶解劑將乙酸乙酯粗提物調(diào)至濃度為50 mg/mL。硫酸銨飽和沉淀法[24]：取菌株CL01發(fā)酵液離心上清液，緩慢加入硫酸銨直至飽和，于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，4 ℃、10000 r/min離心 30 min，進(jìn)行干燥得CL01蛋白粗提物，用Tris-HCl作為溶解劑將蛋白粗提物調(diào)至濃度為50 mg/mL。

粗提物在PDA平板上的抑菌活性測(cè)定：向PDA平板中央接入直徑為5 mm的梨炭疽菌菌餅，在以菌餅為中心的十字交叉對(duì)角線上距離培養(yǎng)皿邊緣為皿直徑1/4處的4個(gè)點(diǎn)各打一直徑為5 mm的孔，其中3個(gè)孔注入粗提物30 μL（粗提物濃度為50 mg/mL），另外一個(gè)孔注入等體積的粗提物相對(duì)應(yīng)的溶解劑作為對(duì)照。每處理重復(fù)3次。于28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)量各皿抑菌帶寬度。

1.2.7 生防菌株CL01發(fā)酵液及其正丁醇粗提物對(duì)果實(shí)上梨炭疽病斑擴(kuò)展的抑制效果測(cè)定 參考Kim等[26]的方法進(jìn)行防效測(cè)定，取新鮮的香梨，用水沖洗干凈，用70%酒精進(jìn)行表面消毒后創(chuàng)傷接種梨炭疽病菌分生孢子液，保濕培養(yǎng)12 h后將CL01發(fā)酵液（2×109cfu/mL）和發(fā)酵液正丁醇粗提物（50 mg/mL）分別用長(zhǎng)、寬為5 mm的滅菌濾紙蘸取后貼在果實(shí)創(chuàng)傷接種處，然后繼續(xù)放入盛水保濕的保鮮盒中室溫培養(yǎng)5 d，觀察病斑擴(kuò)展大小并測(cè)量病斑直徑。CL01發(fā)酵液處理組以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，發(fā)酵液正丁醇粗提物處理組以溶解劑甲醇處理作為對(duì)照。參考古麗孜熱·曼合木提等[27]的方法計(jì)算防治效果，防治效果（%）＝[（對(duì)照病斑面積－處理病斑面積）/（對(duì)照病斑面積）]×100，病斑面積＝π(d/2)2，d為果實(shí)病斑直徑平均值。

1.2.8 菌株CL01的抑菌譜測(cè)定 采用平板對(duì)峙法，參考楊曉蕾等[28]的研究方法，在PDA平板中央接種新鮮的梨炭疽菌菌餅（直徑5 mm），在以菌餅為中心的十字交叉對(duì)角線上距離培養(yǎng)皿邊緣為皿直徑1/4處的4個(gè)點(diǎn)上分別接種3個(gè)生防菌CL01菌懸液和1個(gè)無(wú)菌水對(duì)照各2 μL，28 ℃培養(yǎng)4 d，拍照觀察抑菌效果并測(cè)定抑菌帶寬。同樣的方法測(cè)定和評(píng)估生防菌CL01對(duì)梨黑斑病菌、梨輪紋病菌、梨腐爛病菌3種梨樹(shù)重要病原菌及水稻紋枯病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、馬鈴薯晚疫病菌4種重要植物病原菌的拮抗活性。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism軟件和 Excel軟件，差異顯著性檢驗(yàn)法采用 Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株CL01的鑒定

菌株CL01在NA平板上形成圓形乳白色單菌落，菌落表面隆起、邊緣整齊、中間乳白色邊緣半透明（圖 1A）。CL01單個(gè)菌體為桿狀，革蘭氏染色不定（gram variable）（圖1B），長(zhǎng)3～6 μm，寬0.6～0.8 μm，周生鞭毛（圖1C）。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表1），CL01在接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解、V-P反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、檸檬酸鈉利用、明膠液化試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，而氧化酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陰性。在耐鹽性測(cè)試中，CL01在1%和2%的NaCl中能夠生長(zhǎng)，而在5%和10%的NaCl中不能生長(zhǎng)。綜合其形態(tài)特征和生理生化特性可初步將菌株CL01歸于類芽胞桿菌屬。16S rDNA和rpoB基因序列Blast分析結(jié)果表明，菌株CL01與模式菌株奧托威類芽胞桿菌MS2379的序列一致性最高，分別達(dá)到99.35%和96.47%?；?6S rDNA和rpoB基因序列采用最大似然法分別構(gòu)建類芽胞桿菌屬模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2和圖3所示，CL01均與奧托威類芽胞桿菌親緣關(guān)系最近，聚成一個(gè)分支。菌株CL01的16S rDNA和rpoB基因序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列檢索號(hào)為MW332460和MW590224。綜合其形態(tài)特征、生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，將CL01鑒定為奧托威類芽胞桿菌。

圖1 菌株CL01的菌落和菌體形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of strain CL01

圖3 基于rpoB基因序列采用最大似然法構(gòu)建的菌株CL01系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain CL01 constructed based on rpoB gene sequence using maximum likelihood method

2.2 菌株CL01對(duì)梨炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

CL01在PDA平板上可以明顯抑制梨炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)，抑菌帶寬達(dá)8 mm以上（圖4A，表2）。通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在 PDA平板上靠近CL01一側(cè)的菌落邊緣，菌絲稠密，分支增多，生長(zhǎng)方向紊亂（圖4B）。進(jìn)一步通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CL01處理后的梨炭疽菌菌絲皺縮、凹陷，而未經(jīng)細(xì)菌處理的對(duì)照組菌絲和經(jīng)無(wú)生防作用的大腸桿菌處理的菌絲均呈現(xiàn)出圓潤(rùn)飽滿的形態(tài)（圖4C）。這些結(jié)果說(shuō)明CL01產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)能夠抑制菌絲的生長(zhǎng)、干擾菌絲的分支方式、破壞菌絲細(xì)胞壁的完整性。

2.3 對(duì)梨炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制作用

分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌CL01可以有效地抑制梨炭疽菌分生孢子的萌發(fā)。如圖5所示，未經(jīng)細(xì)菌處理的對(duì)照組分生孢子懸浮液在孵育后4 h，萌發(fā)率即可達(dá)到80%以上；加入無(wú)生防作用的大腸桿菌處理組中，分生孢子的萌發(fā)率在8 h時(shí)，能達(dá)到80%以上，并且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和大腸桿菌處理組的芽管均在伸長(zhǎng)。而CL01發(fā)酵液處理的孢子懸浮液，萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度均明顯低于對(duì)照組，并且即使延長(zhǎng)孵育時(shí)間至24 h，CL01發(fā)酵液處理的分生孢子仍有50%以上不能萌發(fā)，萌發(fā)形成的芽管也不能充分延伸。

圖5 CL01對(duì)梨炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of CL01 on conidia germination of C.fructicola

2.4 菌株CL01的發(fā)酵液粗提物對(duì)梨炭疽菌的抑制效果

如圖6所示，CL01發(fā)酵液經(jīng)正丁醇萃取后的粗提物表現(xiàn)出抑菌活性，抑菌帶寬為（7.3±0.2）mm。而乙酸乙酯萃取后的粗提物和硫酸銨沉淀的方法得到的粗提物均無(wú)明顯的抑菌活性（圖6B，C）。這些結(jié)果表明CL01產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)存在于正丁醇有機(jī)相中。

圖6 CL01發(fā)酵液粗提物對(duì)梨炭疽菌的抑制效果Fig.6 The inhibitory effect of crude extract of CL01 fermentation broth on C.fructicola

2.5 菌株CL01發(fā)酵液及其正丁醇粗提物對(duì)果實(shí)上梨炭疽病斑擴(kuò)展的抑制效果

果實(shí)接種試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，直接進(jìn)行傷口接種的果實(shí)上炭疽病病斑的直徑在接種5 d后達(dá)（2.11±0.13）cm，而同樣條件下經(jīng)過(guò)CL01發(fā)酵液處理后接種的果實(shí)炭疽病病斑直徑為（1.30±0.45）cm（圖7A，C）。用CL01發(fā)酵液的正丁醇粗提物處理得到了類似的抑制效果（圖7B，C）表明，用粗提物溶解劑甲醇處理后的果實(shí)接種梨炭疽菌5 d后，病斑直徑可達(dá)到（1.99±0.16）cm，而用發(fā)酵液粗提物處理后的果實(shí)在同樣的條件下病斑直徑僅為（0.82±0.19）cm，CL01發(fā)酵液和發(fā)酵液正丁醇粗提物的防治效果分別達(dá)62.0%和83.0%。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，CL01及其發(fā)酵液的正丁醇粗提物在梨果實(shí)上均能夠有效地抑制梨炭疽病斑的擴(kuò)展，且正丁醇粗提物的效果好于CL01發(fā)酵液。

圖7 CL01發(fā)酵液（A）和發(fā)酵液正丁醇粗提物（B）對(duì)梨炭疽病病斑擴(kuò)展的抑制效果（C）Fig.7 Inhibitory effect of CL01 fermentation broth (A) or its n-butanol crude extract (B) on pear anthracnose lesion expansion (C)

2.6 菌株CL01的抑菌譜測(cè)定

結(jié)果如表2所示，CL01對(duì)梨樹(shù)上4種供試病原真菌的抑菌帶寬均在6 mm以上，對(duì)其他4種供試作物病原菌的抑菌帶寬在4 mm以上。這些結(jié)果說(shuō)明CL01不僅對(duì)梨炭疽菌具有較好抑制作用，還對(duì)梨上的其他3種常見(jiàn)病原真菌梨黑斑病菌、梨輪紋病菌、梨梨腐爛病菌，以及其他作物常見(jiàn)的病原真菌水稻紋枯病菌、大豆疫霉病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌的菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

表2 奧托威類芽胞桿菌CL01對(duì)8種植物病原菌的抑菌活性Table 2 Diameter of the inhibitory zone after inoculating the P.ottowii strain CL01 against 8 phytopathogens

3 討論

隨著生活水平的提高，人們對(duì)果品的消費(fèi)逐漸由數(shù)量型向質(zhì)量型轉(zhuǎn)變，優(yōu)質(zhì)安全的果品越來(lái)越受到人們的青睞，無(wú)公害梨、綠色梨及有機(jī)梨在發(fā)達(dá)國(guó)家及國(guó)內(nèi)高檔市場(chǎng)的消費(fèi)需求越來(lái)越旺盛[1]。近年來(lái)，隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥對(duì)果品和果園環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重，病害防治與農(nóng)藥污染的矛盾已成為果樹(shù)生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。提高果品質(zhì)量，控制農(nóng)藥污染，生產(chǎn)無(wú)公害果品和綠色果品，已是當(dāng)務(wù)之急。微生物殺菌劑因具有相對(duì)安全、無(wú)殘留、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)越來(lái)越被重視，成為國(guó)際綠色農(nóng)藥發(fā)展的重點(diǎn)。本研究從江蘇省句容梨園的根際土壤中分離得到一株對(duì)梨炭疽病等真菌病害具有良好拮抗效果的奧托威類芽胞桿菌CL01，在對(duì)峙試驗(yàn)中CL01菌液對(duì)梨炭疽病的抑制帶寬達(dá)到（8.2±0.4）mm，室內(nèi)防效測(cè)定試驗(yàn)表明CL01的發(fā)酵液對(duì)果實(shí)炭疽病的防效可達(dá)到62.0%。梨炭疽病菌主要以菌絲和分生孢子的形式在果園中越冬，翌年，溫度和濕度適宜時(shí)產(chǎn)生大量的分生孢子，隨風(fēng)雨傳播。分生孢子是梨炭疽病病害循環(huán)中的初侵染源和再侵染源，因此篩選對(duì)于梨炭疽病菌分生孢子具有顯著抑制作用的防治手段是梨炭疽病菌防治過(guò)程的關(guān)鍵。本研究中，奧托威類芽胞桿菌CL01對(duì)梨炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，顯示出防治炭疽病的能力，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力。

類芽胞桿菌Paenibacillus spp.廣泛分布于土壤、植物表面、水體、農(nóng)業(yè)廢棄物等各種生境中，具有廣譜的抗菌活性和較強(qiáng)的逆境適應(yīng)性，和芽胞桿菌 Bacillus spp.一起被認(rèn)為是最具有應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力的有益微生物之一。類芽胞桿菌作為重要的生防資源，對(duì)植物病害的防控機(jī)理包括拮抗作用、競(jìng)爭(zhēng)定殖、促生作用和誘導(dǎo)抗性等。目前，類芽胞桿菌屬的多粘類芽胞桿菌已被登記為微生物殺菌劑的有效成分，用于西瓜炭疽病、黃瓜角斑病、水稻紋枯病、小麥赤霉病、煙草赤星病等病害的防治[13]。奧托威類芽胞桿菌是Velazquez等[20]從處理過(guò)牛糞厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的巴氏消毒液中首次分離報(bào)道的類芽胞桿菌屬新成員。目前關(guān)于奧托威類芽胞桿菌用于植物病害防治方面還未有報(bào)道。本研究從梨園根際土壤中分離得到的奧托威類芽胞桿菌菌株CL01在抑菌譜測(cè)定試驗(yàn)中，對(duì)梨黑斑病菌、梨輪紋病菌、梨梨腐爛病菌、水稻紋枯病菌、大豆疫霉病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌7種其他植物病原菌也有較好的抗性，有較好應(yīng)用前景。然而，其在田間的定殖能力和防效還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

梨炭疽病的防治藥劑較少，目前中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)登記的僅有嘧菌酯和苯醚·噻霉酮用于該病害的防治[13]?；瘜W(xué)防治藥劑種類單一，長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)使用容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。由于開(kāi)發(fā)安全、高效化學(xué)殺菌劑的成本高昂，投資風(fēng)險(xiǎn)巨大，近年來(lái)，登記用于防治梨樹(shù)真菌病害的新型化學(xué)殺菌劑也很少。類芽胞桿菌在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，從中分離純化出的抗菌活性物質(zhì)，可作為農(nóng)藥先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)出新型的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥[29]。類芽胞桿菌產(chǎn)的抗菌物質(zhì)種類較多，除了有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和酯類物質(zhì)外，研究較多的是細(xì)菌素和抗菌肽[30]。范磊等[31]從多粘類芽胞桿菌中分離到了Fusaricidins類抗真菌活性物質(zhì)，F(xiàn)usaricidins粗提物對(duì)黃瓜灰霉病的防效可達(dá)到 98.3%。沈小波等[32]從類芽胞桿菌 B69中分離得到了Pelgipeptins類抗菌物質(zhì)，能夠有效地抑制多種土傳病害病原真菌的生長(zhǎng)。本研究中對(duì)比CL01活性物質(zhì)不同的粗提取方法，發(fā)現(xiàn)CL01的抑菌活性物質(zhì)可以通過(guò)正丁醇萃取獲得，其粗提物在平板上的抑菌帶寬達(dá)到了（7.3±0.2）mm，對(duì)接種果實(shí)的梨炭疽病的防效可達(dá)到83.0%，表現(xiàn)出較好的抑菌活性。本研究為純化和鑒定奧托威類芽胞桿菌的抑菌活性物質(zhì)奠定了前期基礎(chǔ)，粗提物中抑菌活性物質(zhì)的明確仍需進(jìn)行系統(tǒng)的分離和鑒定。