海洋魚骨膠原低聚肽及杜仲協(xié)同氨基葡萄糖-硫酸軟骨素對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度及骨代謝的影響

夏凱,周志橋,李海枝,馬喜山,吳逸民, 苑鵬,劉士偉,段盛林*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015) 2(功能主食創(chuàng)制與慢病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100015)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種骨代謝性疾病,以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性改變?yōu)橹饕卣?臨床多表現(xiàn)為骨脆性增加和易骨折,在中老年人群中十分常見,尤其是絕經(jīng)后婦女[1-2]。骨質(zhì)疏松作為一個(gè)日趨嚴(yán)峻的公共健康問題已成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)[3]。補(bǔ)充鈣質(zhì)和維生素D能改善骨質(zhì)疏松、避免骨質(zhì)疏松及骨折的發(fā)生,但單純補(bǔ)充鈣質(zhì)對(duì)改善骨密度(bone mineral density,BMD)及降低骨質(zhì)疏松、骨折發(fā)生率的效果并不理想[4]。

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素是軟骨組織的重要組成成分,是有助于提升骨關(guān)節(jié)健康的膳食成分,具有預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[5-8],但兩者聯(lián)用治療骨質(zhì)疏松和提高絕經(jīng)后女性骨密度時(shí),存在起效較慢、用藥劑量大、服用周期長(zhǎng)等問題[9-10]。海洋魚骨膠原低聚肽是以海洋魚骨為原料的低聚肽產(chǎn)品,由2～6個(gè)氨基酸組成,可以直接被機(jī)體吸收利用,且魚骨膠原蛋白肽可以促進(jìn)卵巢切除大鼠的鈣吸收,增加股骨中鈣含量,起到增強(qiáng)骨密度的作用[11-12]。杜仲是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥,杜仲能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,激活骨重建,改善骨代謝,防治OP[13]。目前,關(guān)于海洋魚骨膠原低聚肽和杜仲在骨相關(guān)疾病方面已有一定的研究基礎(chǔ)和運(yùn)用,但兩者是否會(huì)對(duì)氨基葡萄糖-硫酸軟骨素經(jīng)典組合在增加骨密度和改善骨代謝方面起到協(xié)同增效的作用,尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究旨在評(píng)價(jià)海洋魚骨膠原低聚肽與杜仲提取物聯(lián)合氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復(fù)合物改善去卵巢大鼠的骨密度和骨代謝的作用,以期為防止骨質(zhì)疏松相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

鹽酸氨基葡萄糖,江蘇九壽堂生物制品有限公司;硫酸軟骨素鈉,嘉興恒杰生物制藥有限公司;海洋魚骨膠原低聚肽,浙江海氏生物科技有限公司;杜仲,安徽佰順堂中藥飲片有限公司;戊巴比妥鈉,山東西亞化學(xué)股份有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所;雌二醇(estradiol,E2)、骨鈣素(bone gla-protein,BGP)、降鈣素(calcitonin,CT)檢測(cè)試劑盒,北京百奧萊博科技有限公司;生理鹽水,江西科倫藥業(yè)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雙能 X射線QDR-4000型骨密度儀,美國(guó)Hologic公司;MK3型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;羅氏Mdoular P型全自動(dòng)生化分析儀,德國(guó)羅氏診斷有限公司;GS-6R型低溫臺(tái)式離心機(jī),美國(guó)Beckman公司;DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;MDS-6G型微波消解/萃取合成系統(tǒng),上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周,體質(zhì)量100～120 g的SPF級(jí)雌性SD大鼠60只,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2) ℃,濕度為40%～60%,明暗交替(12 h∶12 h)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始正式試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲提取物制備[14]

取杜仲1 kg,加入6倍量水浸泡30 min后煎煮1 h,過濾,保留濾液;殘?jiān)^續(xù)加入6倍量水煎煮1 h,過濾后合并2次濾液并進(jìn)行減壓濃縮,濃縮液經(jīng)噴霧干燥后制得杜仲提取物55 g。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與造模

60只按照體重隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組、去卵巢對(duì)照組、氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復(fù)合物組(受試物A組)、復(fù)合物+海洋魚骨膠原低聚肽組(受試物B組)、復(fù)合物+杜仲提取物組(受試物C組)、復(fù)合物+海洋魚骨膠原低聚肽+杜仲提取物組(受試物D組),每組10只。

各組大鼠手術(shù)[15-16]過程如下:①假手術(shù)對(duì)照組:腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液30 mg/(kg·bw)麻醉,腹位固定后于腹中線距陰道口3～4 cm處去毛并消毒,縱向切開皮膚,分離肌肉并用鑷子提起脂肪團(tuán),露出與子宮相連的卵巢并觀察,后逐層縫合切口并再次消毒;②去卵巢對(duì)照組及4個(gè)受試物組:麻醉及進(jìn)入腹腔方法同上,露出與子宮相連的卵巢后,結(jié)扎并完整摘除雙側(cè)卵巢,余下組織送入腹腔內(nèi),后逐層縫合切口并再次消毒。

1.2.3 劑量設(shè)計(jì)

4個(gè)受試物組按照表1要求給予的受試物及劑量配制樣品液灌胃;假手術(shù)對(duì)照組及去卵巢對(duì)照組大鼠以等體積的去離子水灌胃。所有藥物給藥量均按人體推薦劑量的10倍折算,所有動(dòng)物灌胃量為10 mL/(kg·bw),每天1次,連續(xù)灌胃90 d,每周稱重并結(jié)合體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

表1 各試驗(yàn)組受試物給予情況Table 1 Administration of test substance in each experimental group

1.2.4 觀測(cè)指標(biāo)及方法

90 d后,麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈采血,將其離心后取血清,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。后處死大?取出雙側(cè)股骨,于105 ℃烘至恒重,稱量左側(cè)股骨質(zhì)量,并采用原子吸收分光光度法測(cè)定其骨鈣含量;測(cè)量大鼠右側(cè)股骨全長(zhǎng),通過其中點(diǎn),沿橫截面方向畫一直線,此為股骨中心點(diǎn)測(cè)量點(diǎn)(截面),測(cè)定此處的BMD;于大鼠右側(cè)股骨遠(yuǎn)心端關(guān)節(jié)凹槽最下緣處確定測(cè)量點(diǎn),通過此點(diǎn)劃與上述股骨中點(diǎn)處標(biāo)記平行的直線,此為股骨遠(yuǎn)心端測(cè)量點(diǎn)(截面),測(cè)定此處的BMD[17-18]。

試驗(yàn)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清中Ca、P及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量[19],并根據(jù)各試劑盒中檢測(cè)方法,測(cè)定血清中TRAP、E2、BGP、CT的含量[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及處理,多組樣本間的差異采用單因素方差分析,t檢驗(yàn)法,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般觀察指標(biāo)及體質(zhì)量的變化

所有組別大鼠均存活。試驗(yàn)期間,假手術(shù)對(duì)照組大鼠活動(dòng)相對(duì)正常,毛色有光澤;去卵巢對(duì)照組大鼠活動(dòng)力減弱,毛色光澤度下降,精神相對(duì)萎靡;與去卵巢對(duì)照組比較,各受試物組大鼠活躍度有所增強(qiáng),毛色光澤度及精神狀態(tài)有一定程度改善。

由表2可見,第4周開始,與假手術(shù)對(duì)照組相比,去卵巢對(duì)照組及各受試物組大鼠體質(zhì)量均有增加趨勢(shì),但無顯著性差異;試驗(yàn)第8周及試驗(yàn)?zāi)?與假手術(shù)對(duì)照組相比,去卵巢對(duì)照組及受試物A、B、C和D組大鼠體質(zhì)量均顯著增加(P<0.05),與去卵巢對(duì)照組相比,受試物A、B、C和D組大鼠體質(zhì)量均有不同程度下降,但組間均無顯著性差異。

表2 受試物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(n=10)Table 2 Effects of test substance on the body weight of rats(n=10)

2.2 受試物對(duì)大鼠股骨質(zhì)量及骨鈣的影響

由表3可見,與假手術(shù)對(duì)照組相比,去卵巢對(duì)照組大鼠股骨質(zhì)量、骨鈣含量及總鈣量均顯著降低(P<0.05),表明大鼠骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功。

表3 受試物對(duì)大鼠股骨質(zhì)量及骨鈣的影響(n=10)Table 3 Effects of test substance on femur quality and bone calcium content in rats(n=10)

與假手術(shù)對(duì)照組相比,受試物A、B、C和D組大鼠骨鈣含量及總鈣量均顯著降低(P<0.05);與去卵巢對(duì)照組相比,受試物B、C和D組大鼠骨鈣含量及總鈣量均顯著增加(P<0.05),而受試物A組骨鈣含量及總鈣量增加但差異不顯著;與受試物A組比較,受試物D組大鼠骨鈣含量及總鈣量均顯著增加(P<0.05)。

2.3 受試物對(duì)大鼠股骨長(zhǎng)度及骨密度的影響

由表4可見,各組大鼠股骨長(zhǎng)度無顯著性差異。與去卵巢對(duì)照組相比,受試物B、C和D組大鼠股骨中心骨密度及股骨遠(yuǎn)心端密度均顯著增加(P<0.05),而受試物A組呈增加趨勢(shì)但差異不顯著;與受試物A組相比,受試物D組大鼠股骨中心骨密度及股骨遠(yuǎn)心端密度顯著增加(P<0.05);結(jié)果表明4組受試組均能提高骨密度,受試物D組改善效果最好。

表4 受試物對(duì)大鼠股骨長(zhǎng)度及骨密度的影響(n=10)Table 4 Effects of test substance on femur length and bone mineral density in rats(n=10)

2.4 受試物對(duì)大鼠血清Ca、P及ALP含量的影響

血清ALP是常用的評(píng)價(jià)骨形成、骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)。由表5可見,各組大鼠血清Ca、P含量均無顯著性差異;與假手術(shù)對(duì)照組比較,去卵巢對(duì)照組、受試物A、B和C組大鼠血清ALP含量均顯著升高(P<0.05),而受試物D組血清ALP含量差異不顯著;與去卵巢對(duì)照組比較,受試物B、C和D組大鼠血清ALP含量均顯著性降低(P<0.05),而受試物A組大鼠血清ALP含量呈下降趨勢(shì)但差異不顯著;與受試物A組比較,受試物C、D組大鼠血清ALP含量顯著降低(P<0.05)。

表5 受試物對(duì)大鼠血清Ca、P及ALP含量的影響(n=10)Table 5 Effects of test substance on Ca,P and ALP content in rats(n=10)

2.5 受試物對(duì)大鼠血清TRAP、E2、BGP及CT含量的影響

血清TRAP水平的檢測(cè)能反映破骨細(xì)胞的活性及骨吸收狀態(tài),而BGP是由成骨細(xì)胞分泌,其數(shù)值的高低可反映成骨細(xì)胞的活躍度,血清BGP可作為評(píng)估骨轉(zhuǎn)換率及骨形成的特異性指標(biāo)。因此由表6可知,與假手術(shù)對(duì)照組比較,去卵巢對(duì)照組大鼠血清TRAP及BGP含量均顯著升高(P<0.05),血清E2含量顯著降低(P<0.05);與去卵巢對(duì)照組比較,受試物B、C和D組大鼠血清TRAP及BGP含量均顯著降低(P<0.05),受試物C、D組大鼠血清E2含量顯著升高(P<0.05);與受試物A組比較,受試物D組大鼠血清TRAP和BGP含量均顯著降低(P<0.05),血清E2含量顯著升高(P<0.05),而受試物C組大鼠血清BGP含量顯著降低(P<0.05);各組大鼠血清CT含量無顯著性差異。

表6 受試物對(duì)大鼠血清TRAP、E2、BGP及CT含量的影響(n=10)Table 6 Effects of test substance on TRAP,E2,BGP and CT content in rats(n=10)

3 結(jié)論與展望

在本實(shí)驗(yàn)條件下,去卵巢對(duì)照組大鼠的骨鈣含量、總鈣量和骨密度均顯著低于假手術(shù)對(duì)照組,其中骨密度是預(yù)測(cè)骨丟失的臨床指標(biāo),因此表明利用去卵巢手術(shù)成功建立了大鼠骨質(zhì)疏松模型。海洋魚骨膠原低聚肽和杜仲提取物協(xié)同氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復(fù)合物具有明顯的增加骨密度、改善骨代謝、提高雌激素水平的作用,且兩者聯(lián)合使用時(shí),協(xié)同效果更加顯著。且在本研究中采用去卵巢致大鼠骨質(zhì)疏松模型模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理狀態(tài),與去卵巢對(duì)照組相比,喂養(yǎng)添加杜仲提取物的大鼠體質(zhì)量較其他組下降幅度大,且血清雌激素E2含量顯著升高,這可能是受試物中的杜仲提取物刺激了大鼠體內(nèi)雌激素水平上升,從而在一定程度上抑制由于雌激素降低而誘發(fā)的體質(zhì)量代償機(jī)制。

本研究首次探討了海洋魚骨膠原低聚肽及中藥杜仲聯(lián)合氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復(fù)合物對(duì)去卵巢大鼠骨密度及骨代謝的影響。在動(dòng)物試驗(yàn)層面上,明確了其可增加骨密度、改善骨代謝等作用,為研究預(yù)防與骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病的功能性食品提供了理論基礎(chǔ)。