基于理性設(shè)計(jì)提高枯草芽孢桿菌角蛋白酶的熱穩(wěn)定性

苗周迪,陳希文,彭政,冒鑫哲,堵國(guó)成,張娟

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江南大學(xué) 協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無(wú)錫,214122) 4(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

角蛋白是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不溶于水的蛋白質(zhì),主要存在于羽毛、羊毛、毛發(fā)、蹄和指甲中[1]。全世界每年會(huì)產(chǎn)生大量的角蛋白廢棄物,比如羽毛廢棄物和劣質(zhì)羊毛[2]。這些富含角蛋白的廢棄物能夠轉(zhuǎn)化成為其他增值產(chǎn)品,如飼料和肥料[3]。目前物理法和化學(xué)法處理是提取的主要策略,這些策略常常涉及到高溫或強(qiáng)酸強(qiáng)堿的使用,不僅會(huì)造成空氣、土壤和水的污染,也會(huì)降低角蛋白分解產(chǎn)物的價(jià)值[4]。由真菌、放線菌等多種微生物產(chǎn)生的角蛋白酶能有效地水解角蛋白廢棄物,是一種有效的替代方法[5]。角蛋白酶因其寬泛的底物專一性以及較強(qiáng)的水解能力,廣泛地運(yùn)用于飼料[6]、制革[7]、化妝品[8]、醫(yī)藥[9]等領(lǐng)域。

雖然角蛋白酶能夠有效降解角蛋白廢棄物,但是在具體應(yīng)用場(chǎng)景中的耐受性和穩(wěn)定性仍然受到挑戰(zhàn)[10]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn),角蛋白酶KerZ1的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,并在此溫度下對(duì)羽毛角蛋白廢物有著高效的水解作用。但是,KerZ1在60 ℃下的半衰期僅為18 min,這對(duì)于整個(gè)催化過(guò)程顯然是不利的[11]。由于較高的反應(yīng)溫度不僅能夠提高催化反應(yīng)速率并且能夠降低微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)[12],因此,提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性將可以有效提升其在實(shí)際應(yīng)用中的價(jià)值。

目前,蛋白質(zhì)工程是提高生物催化劑熱穩(wěn)定性的有效手段,主要分為定向進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)兩類[13]。定向進(jìn)化是一種較為普遍的策略,因?yàn)槠鋵?duì)蛋白質(zhì)的相關(guān)信息需求較小,但是該策略需要消耗大量的時(shí)間和資源進(jìn)行突變文庫(kù)的篩選和數(shù)據(jù)分析[14]。而理性設(shè)計(jì)以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息為基礎(chǔ),通過(guò)計(jì)算機(jī)分析出可能會(huì)提高熱穩(wěn)定性的氨基酸相互作用,然后利用定點(diǎn)突變手段引入突變位點(diǎn)并驗(yàn)證效果[15]。與定向進(jìn)化相比,理性設(shè)計(jì)可以有效減少突變庫(kù)的大小,增加定向進(jìn)化的效率,是一種可行性較高的策略。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的柔性環(huán)區(qū)域loop是提高其穩(wěn)定性的潛在目標(biāo)。Loop是一類多樣化的二級(jí)結(jié)構(gòu),包括轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲以及其他連接二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸鏈[16]。大量的研究結(jié)果表明,loop在調(diào)節(jié)酶的催化作用[17],穩(wěn)定性[18]以及底物特異性[19]方面發(fā)揮著重要作用。因此,預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域,剛化該柔性區(qū)域可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。B-factor分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬是兩種常用的研究蛋白質(zhì)柔性區(qū)域的方法。B-factor是從X光衍射晶體結(jié)構(gòu)中獲得的,可以有效反映氨基酸殘基的靈活性,但是它依賴于晶體結(jié)構(gòu)的分辨率,不同分辨率的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)會(huì)影響對(duì)氨基酸靈活性的預(yù)測(cè)[20]。分子動(dòng)力學(xué)模擬主要是在原子水平上模擬蛋白質(zhì)在某個(gè)時(shí)間段的運(yùn)動(dòng)軌跡,并可以準(zhǔn)確提供蛋白質(zhì)在其生理環(huán)境中的靈活性。與B-factor分析相比,分子動(dòng)力學(xué)模擬需要消耗大量的計(jì)算資源,對(duì)計(jì)算機(jī)的運(yùn)算能力也有較高的要求。目前,已經(jīng)有各種方法改造柔性區(qū)域從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,比如添加鹽橋[21],引入二硫鍵或脯氨酸[22]以及迭代飽和突變[23]等。

基于同源性分析的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。一種相對(duì)典型的方法就是將目標(biāo)蛋白酶的序列或結(jié)構(gòu)與嗜熱蛋白酶進(jìn)行比較,確定突變的關(guān)鍵位點(diǎn)。β-轉(zhuǎn)角是最小的二級(jí)結(jié)構(gòu),由4個(gè)殘基(位置i,i+1,i+2,i+3)組成,通常分布在柔性區(qū)域中[24]。對(duì)構(gòu)成426條蛋白質(zhì)鏈的7 153個(gè)β-轉(zhuǎn)角殘基的統(tǒng)計(jì)分析表明,在特定的β-轉(zhuǎn)角上,某些氨基酸的出現(xiàn)頻率會(huì)高于其他氨基酸[24],所以將不同位置上的氨基酸替換為頻率更高的氨基酸就有可能提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性?；谶@些假設(shè),我們通過(guò)在柔性區(qū)域中的β-轉(zhuǎn)角引入氨基酸突變以提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性,獲得了熱穩(wěn)定提高的角蛋白酶,拓寬了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB600及質(zhì)粒pP43 NMK均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

PrimeSTAR?Max DNA Polymerase,大連寶生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶DpnI,Thermo-Fisher Scientific公司;Bradford試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;HisTrapTMHP預(yù)裝柱,GE Healthcare公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

本研究中PCR擴(kuò)增所用引物通過(guò)上海生工生物工程股份有限公司來(lái)合成,引物見(jiàn)表1。

1.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 5、蛋白胨 10、NaCl 10,固體培養(yǎng)基則加20 g/L的瓊脂粉,121 ℃滅菌15 min。根據(jù)實(shí)際需要添加相應(yīng)的抗生素。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used for PCR in this study

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 20、酵母粉 10、蛋白胨 20、Na2HPO4·12H2O 6、KH2PO43、MgSO4·7H2O 0.3,121 ℃滅菌15 min。枯草芽孢桿菌發(fā)酵使用。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)溫度37 ℃,旋轉(zhuǎn)式搖床220 r/min。

1.2 突變體酶的構(gòu)建

利用Quick ChangeTM定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建突變體角蛋白酶[25]。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DpnI酶切處理后,轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB平板上(100 μg/mL氨芐青霉素),于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。從LB平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒之后送上海生工進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)載體B.subtilisWB600,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB平板上(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。得到的轉(zhuǎn)化子即為目標(biāo)角蛋白酶重組菌。

1.3 突變體酶的表達(dá)及純化

挑取B.subtilisWB600轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至2 mL LB培養(yǎng)基中(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃、220 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)的種子液按體積分?jǐn)?shù)2%轉(zhuǎn)接至25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵獲得的菌液于4 ℃、7 000 r/min離心10 min,得到粗酶液。利用鎳離子親和色譜柱純化蛋白質(zhì)。用20 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液平衡預(yù)裝柱,將處理后的粗酶液上樣,然后用含有50 mmol/L咪唑的20 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫得到純酶。利用SDS-PAGE和Bradford試劑盒檢測(cè)蛋白的純度和濃度。

1.4 角蛋白酶酶活力的測(cè)定

取50 μL適當(dāng)稀釋的酶液,加入150 μL 50 mmol/L的Gly-NaOH溶液(pH 10)作為緩沖液和100 μL 25 g/L的水溶性角蛋白作為底物,混勻后于60 ℃下反應(yīng)20 min;加入200 μL 0.5 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng),室溫12 000 r/min離心2 min。取上清液200 μL,加入1 mL 50 g/L的Na2CO3溶液和200 μL的福林酚試劑,混勻后于50 ℃下顯色10 min,使用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)660 nm下的吸光度;空白對(duì)照是在加入底物之前先加入反應(yīng)終止劑三氯乙酸,其余操作同上。

酶活力單位定義:一個(gè)活力單位(U)為吸光度在波長(zhǎng)660 nm下每分鐘升高0.001[11]。

1.5 酶的熱穩(wěn)定性研究

半衰期(t1/2)測(cè)定:將純化后的KerZ1及其突變體酶置于60 ℃水浴中,每隔10 min取樣并測(cè)定殘余酶活力。以水浴處理前酶活力為100%,以后每次取樣酶活力為相對(duì)酶活力。作以殘余酶活力的ln值為縱坐標(biāo),時(shí)間t為橫坐標(biāo)的散點(diǎn)圖,通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性擬合獲得角蛋白酶失活速率常數(shù)k,然后帶入公式:t1/2=ln2/k計(jì)算半衰期[26]。

半失活溫度(T50)測(cè)定:將純化后的KerZ1及其突變體酶置于不同的溫度下(30～80 ℃)水浴處理20 min,測(cè)定其殘余酶活力。以各自最高酶活力為100%,其余溫度下酶活力為相對(duì)酶活力。以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo),溫度為橫坐標(biāo)作圖,計(jì)算半失活溫度。

1.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究

將角蛋白底物按照體積分?jǐn)?shù)稀釋(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%),參照酶活力測(cè)定方法測(cè)定不同底物濃度下的反應(yīng)初速,計(jì)算米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax),并進(jìn)一步計(jì)算催化常數(shù)kcat以及催化效率kcat/Km。

1.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬

角蛋白酶KerZ1與模板greglin以及subtilisin的復(fù)合蛋白體KerA(PDB 4 gi3,1.75 ? resolution)的成熟酶氨基酸序列具有99%的同源性,通過(guò)在線模擬服務(wù)器SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive),以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中KerA的晶體結(jié)構(gòu)為模板,同源模擬角蛋白酶KerZ1及其突變體酶的晶體結(jié)構(gòu)。使用AMBER16進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,力場(chǎng)選定ff14SB[27],以水分子盒子包裹同源建模模型,并設(shè)定盒子邊界與蛋白質(zhì)表面的最小距離為12 ?,在溶劑中添加150 mmol/L的NaCl以平衡系統(tǒng)的正負(fù)電荷,整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬包括水平衡、側(cè)鏈平衡、能量最小化、50 ps的0～300 K的升溫過(guò)程和20 ns的動(dòng)力學(xué)模擬。利用AMBER16自帶的分析工具計(jì)算每個(gè)氨基酸殘基的均方根浮動(dòng)(root mean square fluctuation,RMSF)。

2 結(jié)果與分析

2.1 角蛋白酶柔性環(huán)區(qū)域的改造

利用PyMOL軟件對(duì)KerZ1(PDB 4 gi3)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)注,一共確定了15個(gè)loop環(huán)區(qū)域。通過(guò)將KerZ1的PDB文件提交至在線服務(wù)器HotSpot Wizard 3.0(http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspot-wizard)中計(jì)算每個(gè)氨基酸殘基的B-factor值[28]。B-factor主要反映原子構(gòu)象狀態(tài)的一種“模糊度”,其值越高,模糊度越大,對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)構(gòu)象越不穩(wěn)定。每個(gè)loop環(huán)區(qū)域的B-factor通過(guò)環(huán)路內(nèi)每個(gè)氨基酸殘基的平均B-factor計(jì)算得到,KerZ1的15個(gè)loop環(huán)區(qū)域及其B-factor值計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 基于B-factor值的Loop環(huán)靈活性等級(jí)表Table 2 Flexibility rank of loops based on B-factors

各loop環(huán)區(qū)域的B-factor值比較結(jié)果如圖1所示。Loop8 127～130和Loop13 238～240表現(xiàn)出最高的靈活性。Loop9 152～173由22個(gè)氨基酸殘基組成,是角蛋白酶結(jié)構(gòu)中最長(zhǎng)的環(huán)區(qū)域,也表現(xiàn)出較高的靈活性。

圖1 角蛋白酶KerZ1中l(wèi)oop環(huán)區(qū)域的B-factor值比較Fig.1 Comparison of B-factor of loops in KerZ1

分子動(dòng)力學(xué)模擬也被用于分析KerZ1結(jié)構(gòu)的靈活性。在300 K下,對(duì)KerZ1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,并計(jì)算每個(gè)氨基酸殘基的RMSF值,結(jié)果如圖2所示。RMSF值反映了構(gòu)象的靈活度,其值越高,對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)柔性越大。結(jié)果表明,RMSF值雖然從不同的角度反映構(gòu)象的靈活度,但是總體的結(jié)果與B-factor分析的結(jié)果一致,說(shuō)明兩者在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)柔性區(qū)域方面具有相似性。盡管相關(guān)性很強(qiáng),但是結(jié)果中也存在一定差異。例如,根據(jù)在300 K下分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算的RMSF值,KerZ1最靈活的3個(gè)環(huán)區(qū)域是loop8、loop9以及l(fā)oop5,而B-factor分析下最靈活的3個(gè)區(qū)域是loop8、loop13以及l(fā)oop9。因此,結(jié)合B-factor分析與分子動(dòng)力學(xué)模擬,最終確定KerZ1的2個(gè)柔性環(huán)區(qū)域作為改造對(duì)象,分別是loop8 127～130和loop9 152～173。

圖2 在300 K下角蛋白酶KerZ1氨基酸殘基的RMSF值Fig.2 Normalized RMSF values of KerZ1 amino acid residues at 300 K

同源性分析最典型的例子是將目標(biāo)蛋白酶的序列或結(jié)構(gòu)與嗜熱蛋白酶進(jìn)行比對(duì),確定突變的關(guān)鍵位點(diǎn)。YU等[29]基于同源性分析對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶柔性區(qū)域的β-轉(zhuǎn)角進(jìn)行了改造,提高了熱穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)β-轉(zhuǎn)角殘基的統(tǒng)計(jì)分析,不同類型β-轉(zhuǎn)角上的部分氨基酸頻率會(huì)高于其它氨基酸。例如,在Ⅱ型β-轉(zhuǎn)角的i位置上,半胱氨酸與脯氨酸的出現(xiàn)頻率最高,如果Ⅱ型β-轉(zhuǎn)角的i位置的氨基酸不是半胱氨酸或脯氨酸,將其突變?yōu)槠渲幸环N就有可能提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。因此,基于這些假設(shè),我們從PDBsum數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了角蛋白酶3個(gè)柔性環(huán)區(qū)域內(nèi)的β-轉(zhuǎn)角信息,設(shè)計(jì)引入了13個(gè)單點(diǎn)突變體,設(shè)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 基于β-轉(zhuǎn)角氨基酸位置偏好的突變體設(shè)計(jì)Table 3 Design of variants based on β-turn amino acid positional preference.

2.2 角蛋白酶及其突變體酶的表達(dá)與純化

利用Quick ChangeTM將表3確定的氨基酸殘基引入KerZ1,構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B.subtilisWB600中進(jìn)行突變體酶的表達(dá)。為了初步確定突變體酶的熱穩(wěn)定性,測(cè)定了KerZ1及突變體酶粗酶液在60 ℃水浴處理1 h條件下的殘余酶活力,結(jié)果如圖3所示,突變體酶A128D表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性,其殘余酶活力高于KerZ1,而其他突變體酶的殘余酶活力均低于KerZ1。通過(guò)鎳親和色譜柱進(jìn)一步純化KerZ1與A128D,并進(jìn)行SDS-PAGE分析,KerZ1與A128D的分子質(zhì)量約為30 kDa(圖4)。

圖3 KerZ1及其突變體酶在60 ℃下處理1 h的殘余酶活力Fig.3 Residual enzyme activity of KerZ1 and its mutants at 60 ℃ for 1 h

M-蛋白marker;泳道1-KerZ1;泳道2-A128D圖4 KerZ1和A128D的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of KerZ1 and A128D

2.3 角蛋白酶熱穩(wěn)定性測(cè)定

將純化后的KerZ1和A128D置于不同溫度下(30～80 ℃)水浴處理20 min研究其溫度適應(yīng)性。如圖5-a所示,KerZ1和A128D在50～80 ℃明顯下降。KerZ1在60和80 ℃水浴處理時(shí)分別損失了48%和100%的酶活性,A128D表現(xiàn)出比KerZ1更好的熱穩(wěn)定性,A128D的熱失活溫度(T50)為67.4 ℃,與KerZ1的熱失活溫度61.6 ℃相比有所提高。考慮到60 ℃是KerZ1的最佳酶活性溫度,且在該溫度下酶活力下降明顯,因此選擇60 ℃條件進(jìn)一步驗(yàn)證其熱穩(wěn)定性的提高。

a-不同溫度下的熱穩(wěn)定性;b-60 ℃下的半衰期圖5 KerZ1和A128D的熱穩(wěn)定性及半衰期測(cè)定Fig.5 Determination of thermostability and half-life of KerZ1 and A128D

將KerZ1和A128D置于60 ℃水浴中處理1 h,每隔10 min取樣測(cè)其殘余酶活力并計(jì)算60 ℃條件下的半衰期(t1/2),結(jié)果如圖5-b所示,A128D的半衰期(t1/2)為30.44 min,是KerZ1半衰期(18.12 min)的1.68倍。綜上所述,在KerZ1的β-轉(zhuǎn)角中引入的突變D128有效提高了角蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

2.4 角蛋白酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以不同濃度的角蛋白為底物測(cè)量KerZ1和A128D在60 ℃下的酶活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果如表4所示,A128D的Km值低于KerZ1,表明A128D對(duì)底物的親和力有所提升。而在催化效率方面,A128D的kcat/Km與KerZ1相比提高了6.29%,表明催化效率有所提高。因此,A128D在熱穩(wěn)定性提升的同時(shí)在動(dòng)力學(xué)方面的表現(xiàn)也優(yōu)于KerZ1。

表4 KerZ1和A128D的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of KerZ1 and A128D

2.5 突變體酶的穩(wěn)定性機(jī)制分析

分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算得到的RMSF值揭示了其熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制。如圖6所示,引入的突變D128與A128相比有更低的RMSF值,整個(gè)loop8區(qū)域的氨基酸殘基的RMSF都明顯降低,這說(shuō)明A128D的loop8的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定,從而提高了KerZ1的熱穩(wěn)定性。通過(guò)突變體A128D的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析了KerZ1熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制。

圖6 KerZ1和A128D殘基靈活性比較Fig.6 The residual flexibility of KerZ1 and A128D

如圖7-a所示,A128所在的loop8位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面,但是其周圍的氨基酸G126、G127、S129、G130以及S131都是親水性氨基酸。因此,作為一種疏水性氨基酸,A128可能破壞了loop8結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,從而導(dǎo)致KerZ1穩(wěn)定性的下降。通過(guò)降低蛋白質(zhì)表面的疏水性提高其熱穩(wěn)定性已經(jīng)在黃素氧化還原蛋白的研究中得到了證實(shí)[30]。在本研究中,當(dāng)A128突變?yōu)镈后,作為一種親水性氨基酸,D128與周圍親水性氨基酸提高了蛋白質(zhì)表面的親水性,這可能使loop8變得更加穩(wěn)定(圖7-b)。因此,A128D表面親水性的增加可能是其熱穩(wěn)定性提高的主要原因之一。

圖7 KerZ1 (a)和A128D (b)三維結(jié)構(gòu)以及突變殘基位置的示意圖Fig.7 Schematic diagram of the three-dimensional structure and mutant residue positions of KerZ1 (a) and A128D (b)

3 結(jié)論

角蛋白酶KerZ1在其最適反應(yīng)溫度60 ℃下的熱穩(wěn)定性較差,這限制其實(shí)際應(yīng)用的潛力。通過(guò)B-factor分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)角蛋白酶KerZ1中的柔性環(huán)區(qū)域進(jìn)行了不穩(wěn)定性預(yù)測(cè),并基于β-轉(zhuǎn)角的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果在柔性環(huán)區(qū)域的β-轉(zhuǎn)角中引入了氨基酸突變,獲得一個(gè)熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體酶A128D。進(jìn)一步,基于分子動(dòng)力學(xué)模擬分析了突變體熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制,結(jié)果表明,與KerZ1相比,A128D在柔性環(huán)loop8這一區(qū)域中表現(xiàn)出了更低的RMSF值。通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析突變位點(diǎn)殘基以及周圍氨基酸殘基的分布,發(fā)現(xiàn)引入的D128為親水性更好的氨基酸,與周圍的親水性氨基酸一起增加了蛋白質(zhì)表面的親水性,從而提高了熱穩(wěn)定性?？傊?本研究首次對(duì)角蛋白酶中的β-轉(zhuǎn)角進(jìn)行了改造,有效地提高了角蛋白酶的熱穩(wěn)定性,也為其他工業(yè)用酶的熱穩(wěn)定性改造提供了思路。