PACAP27對Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)的睪丸損傷的保護(hù)作用

盧曉芳，梁英杰，廖定準(zhǔn)，王冰洋，柴翠翠*

（1中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院病理科，深圳518107；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州510080）

隨著人們生活水平的改善和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，糖尿病已成為全球范圍的流行病，且發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測，2025年受糖尿病影響的人數(shù)會增加到3億[1]。作為一種慢性代謝病，糖尿病以糖脂代謝紊亂為主要特征，長期的高血糖也引起一些并發(fā)癥，無論是I型還是II型糖尿病，均會造成一定程度的血管損害[2]。有研究表明，糖尿病患者氧化應(yīng)激及血管損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致生殖系統(tǒng)損害的主要原因[3]。

糖尿病的傳統(tǒng)治療主要以控制血糖和延緩癥狀為主，由于其局限性和不良反應(yīng)，越來越多的研究關(guān)注于內(nèi)源性多肽及其一些下游信號通路的關(guān)鍵因子[4]。1989年Arimura團(tuán)隊(duì)從綿羊的下丘腦中分離得到的一種新型促垂體神經(jīng)肽—垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP），其屬于促胰液素/胰高血糖素/血管活性腸肽家族[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PACAP在培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細(xì)胞中能刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性，顯著增加cAMP的形成，因此將它命名為垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（PACAP）。PACAP在人體的各個(gè)組織中表達(dá)，主要以PACAP38和PACAP27兩種形式存在，其中PACAP27的氨基酸序列與血管活性腸肽的同源性達(dá)到68%，因此認(rèn)定PACAP27屬促胰液素/胰高血糖素/血管活性腸肽家族[6]，功能主要表現(xiàn)在可以促進(jìn)胰島素的釋放、促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、血管舒張、細(xì)胞增殖分化等。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性PACAP27的水平與Ⅱ型糖尿病有一定的相關(guān)性，每日腹膜內(nèi)注射PACAP27，可有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠循環(huán)血糖的含量[7]。

PACAP27分布廣泛，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，其中一個(gè)非常重要作用是通過抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及氧化反應(yīng)，起到細(xì)胞保護(hù)作用；同時(shí)，由于PACAP27屬于促胰液素/胰高血糖素，其在糖尿病以及相關(guān)并發(fā)癥中的作用值得進(jìn)一步探索[8]。本研究使用構(gòu)建的糖尿病模型鼠，通過PACAP27干預(yù)，檢測其對糖尿病誘導(dǎo)的睪丸氧化應(yīng)激和睪丸血管損傷的保護(hù)作用，以及睪丸生精細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而為糖尿病引起的生殖障礙的治療提供新思路。

材料與方法

1 材料

雄性SD大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼料購自南通特洛菲飼料技術(shù)有限公司，所有實(shí)驗(yàn)操作均符合中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物倫理要求并按照實(shí)驗(yàn)動物使用原則進(jìn)行。6只對照組大鼠喂養(yǎng)普通對照飼料，另12只大鼠喂養(yǎng)高脂飼料和腹腔注射鏈脲霉素（上海生工公司），1周后開始檢測尾靜脈血糖水平（羅氏，瑞士）。大鼠的隨機(jī)血糖水平高于16.7 mmol/L即認(rèn)為是Ⅱ型糖尿?。═2DM），待糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功后（10周時(shí)），其中6只每天腹腔注射100ml 1mmol/L PACAP27進(jìn)行干預(yù)（糖尿病PACAP27干預(yù)組），另6只和對照組通過腹腔注射等體積的PBS緩沖液，持續(xù)5周后，麻醉處死所有大鼠，取出睪丸和附睪。

2 HE染色

將石蠟包埋的睪丸組織制作3mm厚切片（機(jī)器型號：LEICA RM2235)，全自動烤封染一體機(jī)染色（DAKO CoverStainer），蘇木素、伊紅試劑（DAKO)，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

3 睪丸組織活性氧和丙二醛濃度檢測

將大鼠取出的睪丸組織分成兩份分別用凍存管和裝有福爾馬林溶液的容器存儲，凍存管放入液氮罐內(nèi)長期保存，福爾馬林固定的標(biāo)本24h后經(jīng)組織前處理，石蠟包埋。從液氮罐中取出等質(zhì)量的每只大鼠睪丸組織并添加等體積的裂解液進(jìn)行研磨，勻漿物在提前預(yù)冷的離心機(jī)中10000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上清液，用于檢測。

活性氧（ROS）檢測：分別取5μl各組大鼠睪丸組織的上清液，用 495μl樣品緩沖液稀釋，后轉(zhuǎn)移至24孔板內(nèi)，在室溫孵育10min后，每孔加入5μl 2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸（DCFH-DA）及40μl亞鐵離子，待轉(zhuǎn)化為熒光后，利用發(fā)射光熒光分光光度計(jì)（美國Bio-Rad公司）通過485nm激發(fā)光和530nm檢測，記錄OD值。

丙二醛（MDA）檢測：MDA水平是評估脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)，通過檢測MDA濃度，可判斷糖尿病大鼠睪丸的氧化損傷情況。將各組小鼠的睪丸的上清液各取5μl放在已經(jīng)包被好的ELISA板上，按照說明書步驟進(jìn)行操作，檢測后記錄OD值。

4 Western blot法檢測睪丸Caspase 9水平

將液氮罐中儲存的大鼠睪丸組織標(biāo)本取等質(zhì)量后，將組織放入液氮中冷凍后捻碎，后各加100μl裂解液（碧云天，P0013C），混勻后勻漿物在提前預(yù)冷的離心機(jī)中10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，然后，收集上清液，BCA檢測試劑盒（碧云天，P0010S）測試提取的睪丸總蛋白的濃度，待每個(gè)樣本的濃度調(diào)配一致后加入蛋白制樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳，每孔上樣20mg總蛋白，濃縮膠用80V的恒壓電泳至濃縮膠電泳結(jié)束，電壓調(diào)到100V繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)電泳到底部后關(guān)閉，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后截取Caspase 9和內(nèi)參GAPDH區(qū)域，封閉后，一抗Caspase 9（碧云天，AC062，鼠抗，1：1000稀釋）和GAPDH（碧云天，AF5009，鼠抗，1：1000稀釋）4℃孵育過夜，第2d取出洗膜后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗（碧云天，A0216，1：5000稀釋）1h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液ECL（碧云天，P0018S）在凝膠成像系統(tǒng)上顯色，Gel-Pro Analyzer 對 Western blot 結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，之后將這些數(shù)值錄入 Graph Pad 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

5 免疫組織化學(xué)染色

Envision法免疫組織化學(xué)染色步驟：石蠟包埋好的睪丸組織制作3μm厚度的石蠟切片，烤箱65℃烤片2h，脫蠟水化后，pH 9.0的EDTA修復(fù)液高壓修復(fù)5min，室溫冷卻20min，蒸餾水洗1min，PBS洗滌3次，每次2min，后用3%H2O2處理10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，將配備好的VEGF 抗體（Abcam，1∶200 稀釋）加在染色區(qū)域，4℃冰箱濕盒過夜孵育，次日先將濕盒室溫復(fù)溫0.5h，PBS 洗滌3次后，滴加即用型二抗（DAKO公司， K5007），37℃孵育30min，PBS洗滌3次，DAB顯色5~10min，水洗，蘇木素復(fù)染2min，流水返藍(lán)10min，最后將切片依次浸入75%、85%、95%、100%的乙醇中脫水，經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照（奧林巴斯，日本）。使用ImageJ軟件對免疫組織化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，以平均光密度代表陽性反應(yīng)強(qiáng)弱，使用Graph Pad Prism 6.0軟件進(jìn)行差異分析和制圖。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Graph Pad Prism 6.0制圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。MDA及ROS比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PACAP27緩解糖尿病大鼠體重增加和血糖升高

首先，我們使用高脂飼料飼喂，并腹腔注射鏈脲霉素構(gòu)建糖尿病大鼠模型，從1周起開始檢測尾靜脈血糖水平，10周時(shí)隨機(jī)血糖水平高于16.7mmol/L的大鼠即認(rèn)定為Ⅱ型糖尿?。═2DM）模型。將糖尿病大鼠隨機(jī)平均分為2組，其中一組腹腔注射PACAP27，另外一組和對照組通過腹腔注射等體積的PBS緩沖液，繼續(xù)飼養(yǎng)至15周，定期記錄體重和尾靜脈血糖水平。

體重記錄結(jié)果表明：0—10周時(shí)，兩組糖尿病造模大鼠（糖尿病組、PACAP27+糖尿病組）體重顯著高于對照組；而在PACAP27干預(yù)后（11-15周），對照組大鼠體重進(jìn)一步增加，而兩組糖尿病造模大鼠體重減少，其中與單純糖尿病組相比，PACAP27干預(yù)后的糖尿病大鼠（PACAP27+糖尿病組）體重減少較少（圖1A）。

尾靜脈血糖值變化發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，糖尿病組血糖顯著升高；而使用PACAP27干預(yù)后，糖尿病大鼠的血糖水平顯著下降，但仍高于非糖尿病對照組（圖1B）。

圖1 PACAP27對糖尿病大鼠體重及血糖的影響。A，體重變化曲線；B，血糖濃度變化曲線；與對照組比較：**0.001

2 PACAP27干預(yù)減輕糖尿病大鼠睪丸組織形態(tài)改變

HE染色檢測3組大鼠睪丸組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)：糖尿病組大鼠的睪丸組織形態(tài)明顯受損，部分曲系精管塌陷，形狀不規(guī)則，生精細(xì)胞和精子減少（圖2B）；當(dāng)用PACAP27干預(yù)5周后，睪丸組織形態(tài)受損明顯減輕，曲系精管形態(tài)結(jié)構(gòu)趨向于恢復(fù)，生精細(xì)胞和精子數(shù)量恢復(fù)（圖2C）。

圖2 HE染色檢測3組大鼠的睪丸組織形態(tài)。A，對照組；B，糖尿病組；C，糖尿病PACAP27干預(yù)組；比例尺，200μmFig. 2 HE staining for examination of the morphological change in rat testicular tissues. A, control group; B, diabetes group; C, PACAP27 intervention diabetes group; scale, 200μm

3 PACAP27干預(yù)減輕糖尿病大鼠睪丸及附睪氧化應(yīng)激

活性氧（ROS）和MDA水平是判斷氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。檢測3組大鼠睪丸及附睪組織中的ROS和MDA的濃度發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，糖尿病組中的ROS和MDA的濃度均顯著增加，分別為照組的221%與196%；而PACAP27干預(yù)后，ROS和MDA濃度均較糖尿病組顯著降低（圖3）。

圖3 PACAP27干預(yù)對糖尿病大鼠睪丸和附睪中活性氧和丙二醛水平的影響。A，ROS；B，MDA；***P<0.001, **0.001

4 PACAP27緩解了糖尿病誘導(dǎo)的大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡水平

Western blot檢測顯示，糖尿病組Caspase 9蛋白水平顯著增加，PACAP27干預(yù)能夠顯著降低糖尿病大鼠Caspase 9蛋白水平（圖4）。

圖4 PACAP27干預(yù)對糖尿病大鼠睪丸組織中Caspase 9水平的影響。A，大鼠睪丸組織中Caspase 9水平代表性Western blot檢測結(jié)果；B，Caspase 9水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*P<0.001Fig.4 Effect of PACAP27 intervention on the level of Caspase 9 in the testicular tissues of diabetic rats. A, representative results of Caspase 9 level detected by Western blot; B, statistical analysis for Caspase 9 level;*P<0.01

5 PACAP27干預(yù)抑制糖尿病大鼠睪丸組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的降低

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）可促進(jìn)血管的生成和通透性，主要在血管組織中表達(dá)。檢測睪丸中VEGF的表達(dá)，可反應(yīng)睪丸中血管的健康狀況[9]。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)：正常睪丸組織，VEGF免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物定位于生精細(xì)胞（精原細(xì)胞強(qiáng)陽性，其它各級生精細(xì)胞弱陽性）及成熟精子，而睪丸間質(zhì)細(xì)胞及曲細(xì)精管之間的結(jié)締組織均陰性或散在個(gè)別細(xì)胞弱陽性；與對照組相比，糖尿病組大鼠睪丸組織中各級生精細(xì)胞及成熟精子數(shù)量均減少，其VEGF免疫反應(yīng)性亦顯著低于對照組；與糖尿病組相比，PACAP27干預(yù)組大鼠睪丸組織中各級生精細(xì)胞數(shù)量均有所恢復(fù)，其VEGF免疫反應(yīng)性亦較糖尿病組大鼠明顯恢復(fù)（圖5）。

圖5 PACAP27干預(yù)對糖尿病大鼠睪丸組織中VEGF免疫反應(yīng)性的影響。A1，對照組。A2，糖尿病組。A3，PACAP27干預(yù)組。比例尺：A1和A2，20μm；A3，50μm。B，VEGF免疫反應(yīng)性陽性強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；***P<0.001Fig.5 Effect of PACAP27 intervention on the vascular endothelial growth factor immunoreactivity in the testicular tissues of diabetic rats. A1, control group. A2, diabetes group. A3, PACAP27 intervention diabetes group. Scale bar: A1 and A2, 20μm; A3, 50μm. B, statistical analysis for VEGF immunoreactivity; ***P<0.001

討 論

糖尿病是以長期高血糖癥為主要特征并伴隨著慢性炎癥的代謝性疾病，目前全球已有4億多的糖尿病患者，其中大部分是Ⅱ型糖尿病患者。當(dāng)前針對Ⅱ型糖尿病的治療主要以通過改善胰島素抵抗和提高胰島素功能，但相關(guān)類藥物的長期使用具有局限性和一些副作用。因此，探尋新穎和治療效果好的生物藥物成為當(dāng)前的熱點(diǎn)[9,10]。

糖尿病是一種慢性代謝疾病，長期的代謝失調(diào)會導(dǎo)致身體其它器官的損傷，例如男性睪丸的損傷，其主要原因是糖尿病患者氧化應(yīng)激及血管微循環(huán)障礙。隨著糖尿病的多發(fā)趨勢，緩解、治療糖尿病引起的睪丸血管損傷，是保護(hù)男性生殖健康的重要研究領(lǐng)域[11,12]。

PACAP27是血管活性腸肽/分泌素/胰高血糖素的家族成員，研究已證實(shí)PACAP27不僅可以保護(hù)各種細(xì)胞免受神經(jīng)毒素的損害或應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還能通過不同途徑減輕糖尿病引起的各種并發(fā)癥[13]。另有研究證實(shí)升高內(nèi)源性PACAP不但可以提升精子的活力和穿透力，而且對缺乏內(nèi)源性PACAP的小鼠導(dǎo)致的精子功能異?？善鸬礁纳谱饔肹14]。近期有研究發(fā)現(xiàn)PACAP可通過調(diào)節(jié)男性性激素（T、E2、FSH和LH）水平來減少睪丸生精細(xì)胞凋亡，從而提高肥胖小鼠精子和早期胚胎質(zhì)量，而PACAP27是PACAP的主要亞型[9]。

在本研究中，PACAP27干預(yù)后的糖尿病大鼠（PACAP27+糖尿病組）體重減少，血糖水平顯著下降，這與之前的研究結(jié)果一致，說明PACAP27多肽是治療糖尿病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制尚不清楚[14]。我們通過組織形態(tài)觀察以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)的糖尿病大鼠睪丸組織形態(tài)明顯受損，ROS和丙二醛濃度顯著增加，凋亡蛋白水平顯著上調(diào)；而使用PACAP27干預(yù)5周后，能夠顯著改善糖尿病引起的大鼠睪丸氧化應(yīng)激和睪丸血管損傷。以上結(jié)果充分說明PACAP27對雄性糖尿病大鼠的睪丸生殖能力有明顯的改善作用。先前的研究證明，PACAP可增強(qiáng)精子的活力和穿透能力，促進(jìn)小鼠和人類的受精，而內(nèi)源性PACAP的缺乏導(dǎo)致精子功能異常，外源性的PACAP通過激活PKA/CREB/Sirt1/p53信號通路來保護(hù)肥胖誘導(dǎo)的男性生殖損傷，從而減少生精細(xì)胞的凋亡[14]。本研究進(jìn)一步探索PACAP的主要亞型PACAP27主要通過減輕糖尿病大鼠睪丸氧化應(yīng)激水平、保護(hù)睪丸血管生成，從而改善糖尿病大鼠的生殖能力，將有望開發(fā)成為改善糖尿病引起的男性生殖障礙的新型藥物。