前列腺癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增高并與淋巴管和微血管密度呈正相關(guān)

劉維輝，張河淦，范大鉻，何清柳，黃庭芳*，顏醒愚

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科, 2福建省泉州市婦幼保健院·兒童醫(yī)院婦科，3福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，泉州 362000）

前列腺癌特指發(fā)生于前列腺的上皮性惡性腫瘤，腺癌是前列腺癌主要病理類型，約占95%以上。2015年，我國(guó)全國(guó)前列腺癌發(fā)病率為10.23/10萬(wàn)，死亡率為4.36/10萬(wàn)，近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，好發(fā)于70~80歲的老年人[1,2]。前列腺癌不僅可以通過(guò)淋巴管、血管轉(zhuǎn)移，且癌組織中淋巴管和微血管密度是決定患者預(yù)后的重要因素[3]。淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[4-6]，在維持自身耐受和避免免疫反應(yīng)過(guò)大而造成器官功能損傷中具有重要作用。本研究旨在探討Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在前列腺癌中的表達(dá)情況，分析其與前列腺癌組織中淋巴管、微血管密度的相關(guān)性，為前列腺癌的臨床診治及預(yù)后提供參考。

資料與方法

1 一般資料

自2015年1月1日至2020年11月30日，收集我院收治的前列腺癌患者100例作為觀察組，同期收集前列腺增生患者100例作為對(duì)照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診前列腺腺癌；②年齡51~82歲；③行手術(shù)治療，可獲得組織病理標(biāo)本；④同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性前列腺癌；②合并其他惡性腫瘤；③感染；④1月內(nèi)曾使用免疫調(diào)節(jié)劑；⑤肝腎功能不全；⑥嚴(yán)重心腦肺功能不全；⑦泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核；⑧其他嚴(yán)重病變。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診良性前列腺增生；②年齡55~85歲；③行手術(shù)治療，可獲得組織病理標(biāo)本；④同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性前列腺癌；②合并其他惡性腫瘤；③感染；④1月內(nèi)曾使用免疫調(diào)節(jié)劑；⑤肝腎功能不全；⑥嚴(yán)重心腦肺功能不全；⑦泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核；⑧其他嚴(yán)重病變。兩組年齡和合并癥等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 前列腺腺癌和前列腺增生患者一般資料比較Tab. 1 Comparison of general data between prostate cancer group and prostate hyperplasia group

2 主要試劑和設(shè)備

主要試劑：抗Foxp3抗體、抗Foxp3同型對(duì)照抗體、抗CD25抗體、抗CD25同型對(duì)照抗體、抗CD4抗體、染色緩沖液，固定液/穿膜劑濃縮液 （BD Bioscience公司，美國(guó)），鼠抗人CD34抗體（稀釋度1:50）、鼠抗人D2-40抗體（稀釋度1:50），酶標(biāo)抗小鼠IgG聚合物、反應(yīng)增強(qiáng)液、DAB顯色劑、檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液PBS、蘇木素試劑（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），人前列腺特異性抗原（prostate specific antigen, PSA）ELISA檢測(cè)試劑盒（內(nèi)含微孔酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、檢測(cè)抗體-HRP、洗滌緩沖液、底物A與B、終止液、封板膜）（上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司）。

主要設(shè)備：Epics XL型流式細(xì)胞儀（Beckman coulter公司，美國(guó)）；離心機(jī)：Centrifuge 5424/5424R型號(hào)高速離心機(jī)（艾本德Eppendorf，德國(guó)）；顯微鏡：CX43型號(hào)顯微鏡（奧林巴斯，日本）；淋巴細(xì)胞分離液（上海哈靈生物科技有限公司，中國(guó)）；博科全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀BIOBASE8001（山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司，中國(guó)）。

3 Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析

取前列腺癌組織、癌旁組織、前列腺增生組織制作成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，分別置入相應(yīng)的流式管進(jìn)行表面標(biāo)記：于各管中分別加入CD4、CD25抗體及同型對(duì)照（其中空白管不加任何抗體，CD25同型對(duì)照管加抗CD4抗體和抗CD25同型對(duì)照抗體，CD4CD25、Foxp3同型對(duì)照及CD4CD25Foxp3管加抗CD4抗體和抗CD25抗體），混勻，4℃避光孵育30min。加入染色緩沖液，利用密度梯度離心法，取得相應(yīng)組織中的細(xì)胞懸液，F(xiàn)oxp3同型對(duì)照、CD4CD25Foxp3管中分別加入Foxp3同型對(duì)照抗體或抗體，再次離心洗滌后懸浮于染色緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用FSC/SSC參數(shù)先找到淋巴細(xì)胞群，以CD4+CD25+雙陽(yáng)細(xì)胞設(shè)門，以Foxp3同型對(duì)照確定其陽(yáng)性信號(hào)，分析Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比。

4 淋巴管和微血管密度分析

EnVision法免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記淋巴管和微血管：取前列腺癌組織、癌旁組織、前列腺增生組織標(biāo)本用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，65℃烤片1h，常規(guī)脫蠟水化，微波法檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，PBS洗，封閉30min；入鼠抗人CD34抗體（稀釋度1:50）或鼠抗人D2-40抗體（稀釋度1:50），室溫下孵育1h；PBS沖洗后，加入反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫下孵育20min，PBS沖洗后再加入酶標(biāo)抗小鼠IgG聚合物，室溫下孵育30min；PBS沖洗后，顯微鏡下DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染后水洗，脫水、透明、封片。

微血管、淋巴管密度計(jì)數(shù)：參照Weidner計(jì)數(shù)方法，以內(nèi)皮細(xì)胞著色呈棕黃色為陽(yáng)性，其中抗CD34染色陽(yáng)性者為微血管，D2-40抗體染色陽(yáng)性者為淋巴管。先在10×物鏡下找到CD34陽(yáng)性微血管和D2-40陽(yáng)性淋巴管密集的“熱點(diǎn)”區(qū)域，再在20×物鏡下選擇4個(gè)視野，由兩名病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師采取雙盲法計(jì)數(shù)CD34陽(yáng)性微血管和D2-40陽(yáng)性淋巴管，取平均值。

5 前列腺癌組織的Gleason評(píng)分

根據(jù)前列腺癌組織腺體的分化程度，由兩名病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師對(duì)前列腺癌組織進(jìn)行Gleason 5級(jí)評(píng)分：第1級(jí)1分，分化好，每遞升1級(jí)增加1分，第5級(jí)5分，為未分化。對(duì)于同一腫瘤不同區(qū)域腺癌結(jié)構(gòu)的變異，按其主要和次要分化程度分別評(píng)分，以該兩項(xiàng)評(píng)分相加的總分作為判斷預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)，相加后的Gleason評(píng)分積分為2、3、4分者相當(dāng)于高分化腺癌，5、6、7分者相當(dāng)于中分化腺癌，8、9、10分者相當(dāng)于低/未分化癌。

6 前列腺癌患者血清前列腺特異性抗原濃度ELISA檢測(cè)

清晨采集空腹患者靜脈血2ml，室溫放置2h后于1000g離心20min，取上清，通過(guò)人PSA檢測(cè)試劑盒采用ELISA法檢測(cè)：取微孔酶標(biāo)板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，分別加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封板膜封住反應(yīng)孔，恒溫箱溫育60min，洗滌緩沖液洗板5次，再分別加入底物A、B，37℃避光孵育15min，最后加入終止液，15min內(nèi)應(yīng)用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)OD值，計(jì)算PSA濃度。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有研究數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用的形式表達(dá)，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示。3組間計(jì)量資料差異采用方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料之間的線性相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在前列腺癌組織中高表達(dá)

對(duì)前列腺癌組織、前列腺增生組織和癌旁組織（各22例）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：前列腺癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占9.22±1.61%，顯著高于前列腺增生組織的7.45±1.38%和癌旁組織的8.12±1.51%（P<0.05）（圖 1）。

圖1 癌旁組織（A）、前列腺增生（B）和前列腺癌（C）中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fig. 1 Flow cytometry analysis of the proportion of Foxp3+regulatory T cells in para-carcinoma (A) tissues, prostate hyperplasia (B) and prostate cancer(C)

2 前列腺癌組織中淋巴管和微血管密度增加

對(duì)前列腺癌組織、前列腺增生組織和癌旁組織進(jìn)行淋巴管和微血管免疫組織化學(xué)染色后，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞D2-40染色陽(yáng)性的淋巴管密度和CD34染色陽(yáng)性的微血管密度檢測(cè)顯示：前列腺癌組織中淋巴管密度為5.76±3.02，顯著高于前列腺增生組織中的2.32±1.45和癌旁組織中的3.64±1.54；前列腺癌組織中的微血管密度為42.21±10.15，顯著高于前列腺增生組織中的21.87±8.25和癌旁組織中的30.92±9.64（圖2，表2）。

圖2 CD34和D2-40表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析前列腺癌組織和癌旁組織中微血管和淋巴管密度。前列腺癌組織中CD34陽(yáng)性的微血管（A）和D2-40陽(yáng)性的淋巴管（B）密度較癌旁組織中CD34陽(yáng)性的微血管（C）和D2-40陽(yáng)性的淋巴管（D）密度顯著增高；比例尺，A，50μm; B，C，D，100μmFig. 2 Analysis of the densities of microvessels and lymphatic vessels in prostate cancer and adjacent tissues by immunohistochemical detection of the expression of CD34 and D2-40. The densities of CD34 positive microvessels (A) and D2-40 positive lymphatics (B) in prostate cancer were significantly higher than those of CD34 positive microvessels (C) and D2-40 positive lymphatics (D) in adjacent tissues. Scale bar, 50μm in A and 100μm in B to D

表2 前列腺癌組織、前列腺增生組織和癌旁組織中淋巴管、微血管密度比較Tab.2 Comparison of lymphatic vessel and microvessel densities in prostate cancer tissues, prostatic hyperplasia tissues and para-carcinoma tissues

3 前列腺癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比與淋巴管和微血管密度正相關(guān)

將前列腺癌組織中Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比與淋巴管密度和微血管密度分別進(jìn)行線性相關(guān)分析顯示：Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比與淋巴管密度和微血管密度均呈正相關(guān)（表3）。

表3 前列腺癌組織中Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比與淋巴管、微血管密度的相關(guān)性Tab.3 Correlation between Fox3+ regulatory T cells percentage and lymphatic vessel and microvessel density in prostate cancer tissues

4 前列腺癌組織的Gleason評(píng)分與Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度正相關(guān)

根據(jù)前列腺癌組織腺體分化程度進(jìn)行評(píng)分顯示，前列腺癌組織的Gleason評(píng)分為7.37±1.02。將Gleason評(píng)分與Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度進(jìn)行線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：Gleason評(píng)分與前列腺癌組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度均呈正相關(guān)（表4）。

表4 前列腺癌組織Gleason評(píng)分與Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度的相關(guān)性Tab.4 Correlation between Gleason score and Fox3+ regulatory T cells percentage, lymphatic vessels and microvessel density in prostate cancer tissues

5 前列腺癌患者血清中前列腺特異性抗原濃度與前列腺癌組織中Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度的相關(guān)性

收集前列腺癌患者通過(guò)全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定的血清中前列腺特異性抗原PSA濃度，結(jié)果顯示PSA濃度為17.717±8.65ng/ml。將PSA濃度與前列腺癌組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度進(jìn)行線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：PSA濃度與前列腺癌組織中Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度均呈正相關(guān)（表5）。

表5 前列腺癌患者血清中前列腺特異性抗原PSA濃度與前列腺癌組織中Fox3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比、淋巴管及微血管密度的相關(guān)性Tab.5 Correlation between prostate specific antigen concentration of prostate cancer patients and Fox3+ regulatory T cells percentage, lymphatic vessels and microvessel density in prostate cancer tissues

討 論

免疫在多種癌癥中發(fā)揮了重要作用[7]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞，對(duì)維持機(jī)體的免疫耐受具有重要意義。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞于胸腺產(chǎn)生后輸出至外周，調(diào)控反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖。但在腫瘤患者中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增高，并通過(guò)抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞等的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫耐受[8]。

1995年Sakaguchi第一次報(bào)道了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[9]，其參與了感染、心血管疾病、免疫性疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。目前調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腫瘤免疫是學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域[10]。腫瘤患者中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以通過(guò)免疫抑制、免疫無(wú)功能作用，抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，幫助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可分為多個(gè)亞群，以CD4+CD25+為代表的Th1型細(xì)胞、Th3型細(xì)胞為主，外周血約2%~10%CD4+T細(xì)胞為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[11]。有研究指出，由于CD25既是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志，又是細(xì)胞活化的標(biāo)志，因此不能以CD25+作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的代表，應(yīng)以CD4+CD25高表達(dá)作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的代表[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞根據(jù)CD25表達(dá)程度，將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分為CD4+CD25陰性、CD4+CD25低表達(dá)、CD4+CD25高表達(dá)三種類型，但大部分CD4+CD25低表達(dá)及幾乎所有CD4+CD25高表達(dá)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)Foxp3表達(dá)，由此指出應(yīng)以CD4+CD25+Foxp3+作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性代表[13]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化及維持生理功能的過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3可發(fā)揮重要功能，并可在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中特異性表達(dá)，F(xiàn)oxp3已成為檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一種特異性標(biāo)志。

目前，已有研究探討了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在前列腺癌發(fā)生及進(jìn)展中的作用。研究顯示誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡，可以促進(jìn)前列腺癌患者免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[14]。前列腺癌組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)增加，與前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)，且正常前列腺組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與Gleason評(píng)分亦存在正相關(guān)性[15]。前列腺癌組織中微血管密度、淋巴管密度增高，是前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的必要條件。微血管密度、淋巴管密度可以直接反映癌組織中新生微淋巴管和微血管的活躍程度[16]。本研究顯示前列腺癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平增高，與微血管密度、淋巴管密度正相關(guān)，提示Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，與患者預(yù)后不良有關(guān)。Gleason評(píng)分是一種被廣泛采用的前列腺癌組織學(xué)分級(jí)方法[17,18]，與前列腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后關(guān)聯(lián)良好，Gleason評(píng)分成為了制定前列腺癌治療方案的重要參考指標(biāo)[19,20]。Gleason評(píng)分越高，患者預(yù)后越差[21]。本研究顯示Gleason評(píng)分越高的前列腺癌患者，其癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平也越高，且淋巴管和微血管密度也越大，具有顯著正相關(guān)性。PSA是由前列腺上皮細(xì)胞合成分泌，廣泛應(yīng)用于前列腺癌的診斷與治療后隨訪監(jiān)測(cè)，與患者預(yù)后密切相關(guān)[22-24]。本研究顯示前列腺癌患者血清PSA含量水平越高的患者，癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)越高，淋巴管和微血管密度也越大，呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。結(jié)合Gleason評(píng)分和PSA與Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性分析，我們推測(cè)前列腺癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平增高與患者預(yù)后不良有關(guān)，F(xiàn)oxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有望成為前列腺癌診斷與預(yù)后判斷的標(biāo)志物。

綜上所述，F(xiàn)oxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在前列腺癌組織中高表達(dá)，與淋巴管、微血管密度正相關(guān)，且與前列腺癌患者Gleason評(píng)分和PSA水平正相關(guān)，可用來(lái)預(yù)測(cè)前列腺癌患者的預(yù)后。