基于虛擬仿真技術(shù)的細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)線上線下混合式教學(xué)改革實(shí)踐

陳瑾，秦霞，黃慧，許健

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，杭州 310053）

細(xì)胞凋亡是在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，其受一系列基因、蛋白的嚴(yán)密調(diào)控，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡異常與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)是細(xì)胞化學(xué)研究的重要技術(shù)手段。目前在細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)均已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)[2]。流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）因其快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)，并能對(duì)單個(gè)細(xì)胞逐一檢測(cè)的特征，在凋亡檢測(cè)中占據(jù)重要地位，其中基于凋亡細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl-serine, PS）外翻特征的Annexin V-FITC/PI 雙染法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，是目前最常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法[3]，許多高校加強(qiáng)了對(duì)該技術(shù)的教學(xué)重視。然而流式細(xì)胞儀為高精密度、復(fù)雜貴重儀器，高校實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地局限、儀器缺乏，教學(xué)還處于基本理論知識(shí)普及和基礎(chǔ)操作示教階段，學(xué)生僅在課堂上認(rèn)識(shí)和了解儀器結(jié)構(gòu)和原理，卻難以達(dá)到理論與應(yīng)用融會(huì)貫通[4]。

虛擬仿真實(shí)驗(yàn)通過計(jì)算機(jī)模擬并創(chuàng)建三維動(dòng)態(tài)視景和行為實(shí)體，將學(xué)習(xí)人員置于模擬實(shí)驗(yàn)環(huán)境中操作學(xué)習(xí)，并完成各種實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。利用虛擬仿真技術(shù)沉浸性、交互性和構(gòu)想性特征，全數(shù)字建模仿真，虛擬空間情景漫游，解決了課堂中復(fù)雜儀器技術(shù)艱深難懂的教學(xué)難點(diǎn)，提升學(xué)生的動(dòng)手操作能力，在節(jié)約大型儀器投入的基礎(chǔ)上，讓學(xué)生熟悉儀器原理與操作環(huán)節(jié)，成為“互聯(lián)網(wǎng)+”實(shí)踐教學(xué)改革的新起點(diǎn)[5]。但虛擬仿真操作程序是一套既定的流程，無法完全預(yù)測(cè)學(xué)生在真實(shí)操作過程中可能遇到的突發(fā)狀況，不利于學(xué)生應(yīng)變能力、分析問題和解決問題的能力培養(yǎng)[6]。因此傳統(tǒng)的線下教學(xué)與孤立的線上教學(xué)都難以取得最佳學(xué)習(xí)效果。

混合式教學(xué)即線上學(xué)習(xí)和面授學(xué)習(xí)的混合，是在“互聯(lián)網(wǎng)+”背景下，現(xiàn)代信息技術(shù)與教學(xué)過程深度融合的產(chǎn)物?；旌鲜浇虒W(xué)模式以滿足學(xué)生個(gè)性化、智能化、信息化、定制化的學(xué)習(xí)需求為目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)翻轉(zhuǎn)課堂，達(dá)成線上新知學(xué)習(xí)和線下知識(shí)內(nèi)化的完美結(jié)合[7]。針對(duì)“互聯(lián)網(wǎng)+”時(shí)代下混合式教學(xué)的學(xué)習(xí)理論、教法學(xué)基礎(chǔ)、方法論等已有系列研究[8,9]?；旌鲜綄W(xué)習(xí)用建構(gòu)主義理論解釋個(gè)性化知識(shí)的習(xí)得，用聯(lián)通主義理論解釋創(chuàng)造性知識(shí)的生成，促使教師由學(xué)科專家、知識(shí)傳授者轉(zhuǎn)變?yōu)閷W(xué)習(xí)設(shè)計(jì)者和學(xué)習(xí)促進(jìn)者。

因此，本文以細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)為例，著力構(gòu)建線上線下聯(lián)動(dòng)教學(xué)，以線上虛擬仿真操作為主，掌握實(shí)驗(yàn)原理、儀器結(jié)構(gòu)和基本操作，培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力；輔以線下重點(diǎn)示教，解讀凋亡流式檢測(cè)過程中的注意事項(xiàng)和問題分析，提升學(xué)生綜合實(shí)踐能力。

1 教學(xué)目標(biāo)

知識(shí)目標(biāo)：通過線上虛擬演練、線下示教，學(xué)生掌握細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)的基本原理、操作與技術(shù)要求，并掌握Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染法流式檢測(cè)結(jié)果的解讀。

能力目標(biāo)：在線上虛擬仿真操作中，培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)，發(fā)現(xiàn)問題、分析問題的能力，鍛煉獨(dú)立探索精神，結(jié)合線下重點(diǎn)示教、疑難解答，加強(qiáng)團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)，提升解決問題的能力。

2 教學(xué)理念與方法

在教學(xué)中，采用“建構(gòu)主義”教學(xué)思想[10]，最直接的體現(xiàn)就是以學(xué)生為中心，根據(jù)學(xué)生的不同狀況實(shí)施相應(yīng)的教學(xué)，實(shí)現(xiàn)因材施教，由傳統(tǒng)的知識(shí)歸納、邏輯演繹式的講解轉(zhuǎn)變?yōu)閯?chuàng)設(shè)情境、協(xié)作學(xué)習(xí)、自主學(xué)習(xí)，真正動(dòng)手操作實(shí)驗(yàn)，成為知識(shí)的探索者和學(xué)習(xí)認(rèn)知主體。采用線上線下虛實(shí)結(jié)合教學(xué)法（圖1）。

圖1 線上線下虛實(shí)結(jié)合教學(xué)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the online and offline mixed teaching mode

2.1 虛擬教學(xué)法

通過虛擬仿真技術(shù)在線還原流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)的真實(shí)場(chǎng)景，完成細(xì)胞樣本準(zhǔn)備、流式細(xì)胞儀調(diào)試、檢測(cè)方案建立、數(shù)據(jù)采集與結(jié)果分析等在線虛擬操作，讓學(xué)生在虛擬實(shí)驗(yàn)中掌握流式凋亡檢測(cè)原理、操作方法和注意事項(xiàng)等知識(shí)點(diǎn)。

2.2 現(xiàn)實(shí)教學(xué)法

虛擬仿真實(shí)驗(yàn)按既定標(biāo)準(zhǔn)流程設(shè)置，針對(duì)實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題不能很好示范教學(xué)，因此在課堂教學(xué)中輔以樣品前處理操作和流式細(xì)胞儀檢測(cè)示教，重點(diǎn)指出流式凋亡檢測(cè)注意事項(xiàng)。

樣本制備：流式樣本要求單細(xì)胞懸液，樣本制備好壞直接影響檢測(cè)結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)中采用Raw264.7細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，在收集細(xì)胞懸液過程更要注意消化過程對(duì)細(xì)胞活力影響。

儀器調(diào)試：流式的復(fù)雜在于其參數(shù)的設(shè)置，在檢測(cè)過程中，考慮流式細(xì)胞儀閾值、電壓、補(bǔ)償、圈門不合理對(duì)結(jié)果的影響。

上述注意點(diǎn)在虛擬仿真實(shí)驗(yàn)中無法細(xì)致展示，通過課堂教學(xué)彌補(bǔ)，達(dá)到以虛促實(shí)，虛實(shí)結(jié)合的教學(xué)目的，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生發(fā)發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，解決問題的能力。

3 教學(xué)過程實(shí)施

3.1 視頻演示自學(xué)

課程首先通過細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)畫演示視頻，引導(dǎo)學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞術(shù)的基本概念、原理、檢測(cè)步驟等，達(dá)到知識(shí)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其原理是凋亡早期細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸由細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層，其對(duì)FITC標(biāo)記的Annexin V具有高度親和力，顯示綠色熒光；PI不能通過細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞處于晚期凋亡和壞死狀態(tài)，細(xì)胞膜受損時(shí)，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并嵌入DNA雙鏈顯示紅色熒光[11]。而流式細(xì)胞儀可對(duì)經(jīng)過特異熒光素染色的單細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行逐一檢測(cè)，樣本被特定波長(zhǎng)的激光束照射，細(xì)胞表面的熒光素產(chǎn)生熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射，這些混合的光信號(hào)經(jīng)光電倍增管和光電二極管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?hào)，并經(jīng)過模數(shù)轉(zhuǎn)換器以電子脈沖的形式被計(jì)算機(jī)系統(tǒng)接收并分析得出細(xì)胞的生物學(xué)特征[12]。因此將Annexin V-FITC與PI聯(lián)用，在488nm激光器照射下，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，Annexin-V陰性-PI陰性代表正常細(xì)胞；Annexin-V陽性-PI陰性代表凋亡早期的細(xì)胞；Annexin-V陽性-PI陽性代表凋亡晚期的細(xì)胞或壞死的細(xì)胞；Annexin-V陰性-PI陽性，代表壞死細(xì)胞。學(xué)生通過線上自主學(xué)習(xí)后，在微助教上完成前測(cè)知識(shí)答題，評(píng)價(jià)自學(xué)情況。這一過程一方面有助于讓學(xué)生對(duì)照實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)找出學(xué)習(xí)薄弱環(huán)節(jié)，針對(duì)易錯(cuò)點(diǎn)，課堂上重點(diǎn)闡述；另一方面可以激活先備知識(shí)，將相關(guān)的細(xì)胞化學(xué)、分子生物學(xué)、儀器分析等知識(shí)點(diǎn)串聯(lián)起來，逐步建立知識(shí)體系。

3.2 線上虛擬仿真教學(xué)

學(xué)生在線完成細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)模擬演練。首先是樣本制備，包括獲得暴露后的單細(xì)胞懸液、Annexin-V-FITC孵育、洗滌離心后PI孵育。隨后模擬操作流式細(xì)胞儀開機(jī)質(zhì)控，掌握流式檢測(cè)技術(shù)的基本操作及儀器性能評(píng)價(jià)。質(zhì)控通過后，方可開始檢測(cè)。進(jìn)入虛擬仿真實(shí)驗(yàn)練習(xí)環(huán)節(jié)，每一操作步驟均設(shè)置了說明，指導(dǎo)學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)方案建立，上樣、數(shù)據(jù)采集、結(jié)果解讀（圖2）。在關(guān)鍵步驟設(shè)置提問，如在流式細(xì)胞儀調(diào)試中，判讀質(zhì)控結(jié)果，包括變異系數(shù)（coefficient of variation, CV）和熒光強(qiáng)度均值（mean fluorescence intensity, MFI）；在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中涉及多色熒光，注意熒光補(bǔ)償?shù)恼_調(diào)節(jié)，系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程智能指導(dǎo)，學(xué)生與線上教師進(jìn)行互動(dòng)提問與答疑，教師掌握每一位學(xué)生的線上學(xué)習(xí)狀態(tài)。系統(tǒng)具有錯(cuò)誤提示和自動(dòng)評(píng)價(jià)的功能，學(xué)生通過人機(jī)交互的方式，實(shí)現(xiàn)邊練習(xí)、邊學(xué)習(xí)、邊調(diào)整，錯(cuò)誤和不足之處及時(shí)得到改正和補(bǔ)充，增強(qiáng)體驗(yàn)感和互動(dòng)趣味性。

圖2 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)線上虛擬仿真演練流程Fig. 2 Operation stream of the online virtual simulation of cell apoptosis detection by flow cytometry

3.3 線下實(shí)操演示

在課堂實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，因課時(shí)限制，凋亡樣本由教師提前制備好，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)演示，在此過程中強(qiáng)調(diào)流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)的注意事項(xiàng)，如消化處理產(chǎn)生的死細(xì)胞及細(xì)胞碎片在流式結(jié)果中的判斷，從而提示學(xué)生回憶樣本制備虛擬操作過程中細(xì)胞消化時(shí)間、離心條件設(shè)置等注意點(diǎn)，學(xué)會(huì)合格樣本的判斷；又如在補(bǔ)償調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，無補(bǔ)償和有補(bǔ)償情形下，各群細(xì)胞的分布，學(xué)生直觀領(lǐng)悟參數(shù)合理設(shè)置的重要性。最后針對(duì)流式應(yīng)用中，學(xué)生普遍反映的難點(diǎn)—流式圖譜解讀進(jìn)行重點(diǎn)講述（圖3）。根據(jù)凋亡檢測(cè)結(jié)果，闡述流式圖譜橫縱坐標(biāo)參數(shù)類型，結(jié)合視頻中流式采集信號(hào)原理，理解不同參數(shù)代表的信號(hào)類型、不同群體細(xì)胞揭示的生物學(xué)含義，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生積極思考，能舉一反三，真正學(xué)以致用。

在本實(shí)驗(yàn)中，首先通過散射光信號(hào)，包括前向角散射光和側(cè)向角散射光，圈出目的細(xì)胞群，調(diào)節(jié)儀器閾值排除碎片干擾；隨后根據(jù)FITC單標(biāo)管和PI單標(biāo)管調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償；最后在Annexin-V-FITC和PI雙參數(shù)散點(diǎn)圖中，設(shè)置十字門，分析各象限細(xì)胞群含義及比例（圖3）。象限左下為雙陰性群為活細(xì)胞的比例，象限右下為Annexin-V-FITC單陽細(xì)胞群為凋亡早期細(xì)胞的比例，象限右上為雙陽性群為凋亡晚期細(xì)胞的比例，象限左上為PI單陽性群為壞死細(xì)胞群比例。

圖3 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)結(jié)果解讀。A，空白管；B ，F(xiàn)ITC單標(biāo)管；C， PI單標(biāo)管；D 雙標(biāo)管Fig. 3 Interpretation of the flow cytometry results of cell apoptosis. A, blank tube; B, FITC single stained tube; C, PI single stained tube; D, FITC and PI double stained tube

3.4 課后拓展

課程結(jié)束后，選取以往凋亡檢測(cè)中出現(xiàn)的幾種異常結(jié)果進(jìn)行案例討論，思考實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題以及解決方案，如有的樣本結(jié)果PI單染細(xì)胞比例較高，提示有較多壞死細(xì)胞，可能的原因是什么？判斷熒光補(bǔ)償不足與過度？最后結(jié)合理論介紹的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，形態(tài)變化、DNA斷裂檢測(cè)、線粒體膜電位變化等，比較各方法特點(diǎn)，引導(dǎo)學(xué)生實(shí)現(xiàn)知識(shí)的進(jìn)一步內(nèi)化，充分理解凋亡進(jìn)程。

4 教學(xué)效果評(píng)價(jià)

基于虛擬仿真技術(shù)的細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)線上線下混合式教學(xué)改革，形成了“多層次、多形式、多內(nèi)容”的立體化實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系。通過課堂前測(cè)、后測(cè)及虛擬仿真考核模塊，構(gòu)建雙線考核評(píng)價(jià)和教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控體系，切實(shí)提高學(xué)生學(xué)習(xí)成效。虛擬仿真系統(tǒng)通過人機(jī)對(duì)話模式，實(shí)行實(shí)時(shí)考核方式，系統(tǒng)將根據(jù)學(xué)生在考核中的表現(xiàn)給出系統(tǒng)評(píng)價(jià)和具體的數(shù)據(jù)分析，通過可視化圖形方式直觀體現(xiàn)學(xué)生操作過程中正確、錯(cuò)誤及未完成步驟，并給予正確的前10%學(xué)生獎(jiǎng)勵(lì)分（圖4A），既調(diào)動(dòng)學(xué)生積極性，又能及時(shí)對(duì)薄弱的部分進(jìn)行強(qiáng)化改進(jìn)，真正實(shí)現(xiàn)過程中全方位評(píng)價(jià)，并使考核、效果評(píng)估進(jìn)一步規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化。課堂評(píng)測(cè)注重理論知識(shí)點(diǎn)的掌握，虛擬仿真考核模塊側(cè)重學(xué)生觀察能力、思維能力和操作能力，兩者相互補(bǔ)充。課后對(duì)課堂滿意度及學(xué)習(xí)效果開展問卷調(diào)查（圖4B），對(duì)教學(xué)設(shè)計(jì)、虛擬仿真演練、課后拓展及考核形式的滿意度分別為82.1%、68.2%、88.3%和70.4%，其中對(duì)于虛擬仿真演練主要存在問題是軟件操作界面友好性，有待后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)。在學(xué)習(xí)效果方面，混合式教學(xué)對(duì)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、探索精神、實(shí)踐能力、自主學(xué)習(xí)能力和分析解決問題能力均有明顯提升（圖4C）。

圖4 教學(xué)效果評(píng)價(jià)Fig. 4 Evaluation of the teaching effect

5 討論

傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)教學(xué)以實(shí)體課堂為教學(xué)形態(tài)，學(xué)校、教材和教師主導(dǎo)著教學(xué)的整個(gè)過程，學(xué)生學(xué)習(xí)受到時(shí)空和資源等方面條件限制，凋亡檢測(cè)多采用形態(tài)觀察，與目前研究中的先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)脫節(jié)。虛擬仿真技術(shù)有效規(guī)避高校實(shí)驗(yàn)室硬件環(huán)境不足的限制，可促進(jìn)細(xì)胞化學(xué)教學(xué)體系的完善。虛擬仿真項(xiàng)目已成為混合式教學(xué)中優(yōu)質(zhì)在線資源的重要組成部分，本實(shí)驗(yàn)依托流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)虛擬仿真項(xiàng)目，開展線上線下混合式教學(xué)改革。線上虛擬演練，其無時(shí)間、空間限制的“游戲式”網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)，提高了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)自主學(xué)習(xí)能力；線下重點(diǎn)示教，加深理論知識(shí)的內(nèi)化，將課堂教學(xué)中理論講解的深刻特點(diǎn)與虛擬仿真實(shí)踐操作中高度靈活的自由特點(diǎn)相結(jié)合，形成混合式教學(xué)模式，更有助于提升教學(xué)效果[13]。

在教學(xué)過程及反饋中也發(fā)現(xiàn)了一些問題：首先，線上自學(xué)過程依賴學(xué)生自覺性及領(lǐng)悟性，存在學(xué)生個(gè)體差異，對(duì)線下的重點(diǎn)示教造成一定難度，后續(xù)將進(jìn)一步加強(qiáng)線上學(xué)習(xí)的過程管理，開展個(gè)性化指導(dǎo)，補(bǔ)齊短板；其次，對(duì)于虛擬仿真演練，鼠標(biāo)的點(diǎn)擊與實(shí)際動(dòng)手操作存在差異，無法完全預(yù)測(cè)學(xué)生在真實(shí)操作過程中可能遇到的突發(fā)狀況，尤其在流式參數(shù)設(shè)置中，隨樣本狀態(tài)需不斷調(diào)整，但針對(duì)大型儀器課堂教學(xué)無法滿足人人都有操作機(jī)會(huì)，因此鼓勵(lì)學(xué)生課外多參與學(xué)科競(jìng)賽，讓科研反哺教學(xué)，提升學(xué)生創(chuàng)新能力。