ASA處理對蘋果果實抗壞血酸
——谷胱甘肽循環(huán)和膜脂過氧化水平的影響

鄧惠文，王應(yīng)強(qiáng)，韓 雍，孟建剛

(1.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；2.天池鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，甘肅 環(huán)縣 745700)

蘋果是我國大宗類水果之一主要以鮮食為主[1-2]。富士蘋果以其營養(yǎng)豐富，色澤鮮艷、香氣怡人、肉質(zhì)甜脆而深受消費者的喜愛[3-4]。霉心病、青霉病、灰霉病和炭疽病是蘋果貯藏期的主要病害，粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)是引起霉心病造成果實爛損的主要的病害之一[5]。霉心病主要發(fā)生在果實貯藏期，包括干腐和濕腐，其發(fā)病癥狀表現(xiàn)為果肉呈現(xiàn)水漬狀、褐色、味苦[6]。目前主要采用化學(xué)殺菌劑控制，但長期使用化學(xué)殺菌劑對人體健康、環(huán)境存在危害并且會產(chǎn)生病原物抗藥性增加[7-8]等問題。

乙酰水楊酸(Acetyl Salicylic Acid,ASA)在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)換為SA，作為小分子信號物質(zhì)在誘導(dǎo)植物抗病性方面有著明顯的效果[9-11]。研究顯示：采前ASA噴灑處理通過促進(jìn)苯丙烷代謝和抗氧化酶活性誘導(dǎo)活性氧代謝，能夠有效誘導(dǎo)采后哈密瓜果實的抗病性[12]。此外，甜瓜抗病性研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)抗病與果實膜脂過氧化及丙二醛的積累密切相關(guān)[13]。然而，關(guān)于ASA對蘋果抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)和膜脂過氧化水平的影響尚未見報道。本文以隴東地區(qū)“富士”蘋果為材料，探究采后ASA處理對損傷接種T.roseum蘋果果實果肉及果心病斑直徑的影響，旨在探討ASA處理對抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)及果實膜脂過氧化的影響，以期為蘋果霉心病的防治提供基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以“紅富士”蘋果為材料，采自甘肅省慶陽市西峰區(qū)溫泉鄉(xiāng)，于2018年9月底采摘無機(jī)械損傷和病蟲害、大小均一的果實。

供試粉Troseum分離于自然發(fā)病的富士蘋果，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)上保存待用。

本試驗用的ASA分析純，三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、亞油酸、NaOH、HCL、硼酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GY-Ⅰ型水果硬度計，杭州托普儀器有限公司；WYT-Ⅱ型阿貝折光儀，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；Thermo8600超低溫冰箱，杭州明凱科技有限公司；TGL-16低溫離心機(jī)，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

2mmol/L ASA浸泡處理，以自來水為對照(CK)，在溫度20±2℃、RH60±5%條件下貯藏10d。貯藏期間每隔2d取樣一次測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

果心病斑直徑：參照Serdani M的方法[14]。無菌條件下，將表面消毒后的蘋果縱切，每個蘋果用牙簽在心皮刺孔2次，接種1×105個/mLT.roseum孢子懸浮液10μL；無菌水為對照，保鮮膜密封后，在無光照25℃條件下培養(yǎng)，十字交叉法測定病斑直徑。果肉病斑直徑：參照葛永紅的方法[15]。

丙二醛(MDA)含量：參照Hodges等的方法[16]，3.0g果肉組織中加入5mL100g/L三氯乙酸(TCA)提取液研磨成勻漿，4℃12,000×g條件下離心20min。取2mL上清液，加入2mL0.67%的2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混合后煮沸20min，對照空白管中加入2mL100g/L TCA溶液代替提取液。分別測定反應(yīng)液在450nm、532nm和600nm處的吸光度值，MDA含量用(nmol/g FW)表示。

脂氧合酶(LOX)活性：參照劉歡等的方法[13]。

AsA和DHA含量的測定：分別參照Tanaka的方法[17]和Arakawa的方法[18]，取果肉組織3.0g加5mL預(yù)冷的100mmol/L鹽酸提取液冰浴研磨，然后在4℃、7800r/min條件下離心10min，上清液立即用于AsA和DHA的測定。AsA的測定：取100μL上清液加入2mL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)再加入0.5mL蒸餾水在265nm下測定其吸光度值?？侫SA的測定：取100μL上清液加入2mL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)再加入0.5mL 2mmol/L DTT置于室溫下(25℃)反應(yīng)8min使DHA全部還原為AsA，之后在265nm下測定其吸光度值。則DHA含量=總AsA含量-AsA含量。結(jié)果以μg·gFw-1表示。

GSH和GSSG含量的測定：參照Griffith[19]的方法。取3g果肉組織，加入5mL冰冷的6%的偏磷酸(pH2.8)，冰浴研磨，勻漿液于4℃、12500r/min離心20min，取上清液來立即測定GSH和GSSG的含量或儲存在-20℃下等待測定。總的GSH和GSSG含量測定：500μL提取液加2.5mL反應(yīng)液包含800μL反應(yīng)液1(110mmol·L-1Na2HPO4·7H20，40mmol·L-1NaH2PO4·H2O，15mmol·L-1EDTA，0.3mmol·L-1DTNB，0.04%BSA)、800μL反應(yīng)液2(1mmol·L-1EDTA，50mmol·L-1咪唑和0.02%BSA)、800μL反應(yīng)液3(5%Na2HPO4，pH7.5的溶液稀釋50倍)和100μL 9.0mmol·L-1NADPH。以6%的偏磷酸(pH2.8)代替提取液作為對照，蒸餾水作參比，在412nm下測其吸光值，則OD總GSH+GSSG=OD樣品-OD對照。GSSG含量測定：500μL提取液加入2.5mL乙烯吡啶(稀釋50倍)在25℃下水浴1h，以6%的偏磷酸(pH2.8)代替提取液作為對照，蒸餾水作參比，在412nm下測其吸光值，則ODGSSG=OD樣品-OD對照。GSH的=總的GSH和GSSG含量-GSSG。

GR活性的測定：參照Foyer和Halliwell[20]的方法。APX和DHAR活性的測定：參照Nakano和Asada[21]的方法。MDHAR活性的測定：參照Hossain等[22]的方法。試驗中各測定指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件和EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASA處理對損傷接種T.roseum果肉和果心組織病斑直徑的影響

由圖1A可知，對照和ASA處理在貯藏6-15d病斑直徑均呈現(xiàn)上升趨勢。ASA處理的果實在整個貯藏期間病斑直徑均顯著(P<0.05)低于對照組果實。ASA處理可以抑制由T.roseum侵染引起霉心病在果肉組織病斑的擴(kuò)展。

由圖1B可知，對照和ASA處理果實的果心在貯藏4-7d病斑直徑均呈現(xiàn)上升趨勢。在整個貯藏期間，ASA處理果實的果心病斑直徑顯著(P<0.05)低于對照組果實果心。ASA處理可以降低由T.roseum侵染引起霉心病在果心病斑直徑。

圖1 ASA處理對損傷接種T.roseum果肉病斑直徑(A)和果心組織病斑直徑(B)的影響

2.2 ASA處理對果實丙二醛(MDA)含量的影響

由圖2可知，對照組果實在貯藏0-8d MDA含量迅速上升。ASA處理的果實MDA含量上升較為緩慢。經(jīng)過ASA處理的果實在整個貯藏期間MDA含量顯著(P<0.05)低于對照組果實。ASA處理通過延緩丙二醛含量的上升，抑制膜脂過氧化程度。

圖2 ASA處理對蘋果果實丙二醛(MDA)含量的影響

2.3 ASA處理對果實脂氧合酶(LOX)活性的影響

由圖3可知，對照組果實在貯藏0-6d LOX活性快速上升，隨后下降。ASA處理的果實0-6d LOX活性相對緩慢，6-8d下降。ASA處理的果實在同一貯藏時間LOX酶活顯著(P<0.05)低于對照組果實。ASA處理通過降低蘋果果實LOX活性，抑制膜脂過氧化。

圖3 ASA處理對脂氧合酶(LOX)活性的影響

2.4 ASA處理對果實非酶抗氧化物質(zhì)含量的影響

由圖4A可知，貯藏期間ASA處理組果實AsA含量均顯著(P<0.05)高于對照組果實。AsA含量對照組果實在貯藏0-6d上升速度較快，6-8d呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。ASA處理組果實0-2d上升迅速，隨后2-6d緩慢上升，最后下降。由圖4B可知，對照組和ASA處理組蘋果果實貯藏期間DHA含量均呈現(xiàn)上升趨勢，并且ASA處理組果實DHA含量均顯著(P<0.05)低于對照組果實。由圖4C可知，貯藏期間ASA處理組果實GSH含量均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實GSH含量在貯藏0-6d上升迅速，之后緩慢下降。由圖4D可知，貯藏期間ASA處理組果實GSSG含量均顯著(P<0.05)低于對照組果實。0-8d對照組果實和處理組果實GSSG含量均呈現(xiàn)下降趨勢，但相對于對照組果實ASA處理下降較為緩慢。上述結(jié)果表明，ASA處理可有效地提高蘋果果實AsA和GSH含量，降低果實中DHA和GSSG含量。AsA和GSH作為抗氧化物質(zhì)能夠直接清除果實中積累的活性氧，從而抵御外界傷害。

圖4 ASA處理對蘋果果實抗壞血酸含量(A)、脫氫抗壞血酸(B)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的影響

2.5 ASA處理對果實抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響

由圖5A可知，在貯藏期間ASA處理組果實APX活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實APX酶活在貯藏0-6d呈上升趨勢，隨后下降；由圖5B可知，貯藏期間ASA處理組果實GR活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實APX酶活在貯藏0-8d整體呈現(xiàn)較緩慢的上升趨勢。ASA處理組果實0-2d上升速度較快，2-6d逐漸上升，之后下降。上述結(jié)果表明，ASA處理可提高蘋果果實APX和GR活性。APX和GR作為AsA-GSH循環(huán)中重要抗氧化酶，通過提高APX和GR活性，提高果實的抗氧能力，使ASA-GSH循環(huán)維持平衡。

圖5 ASA處理對蘋果果實抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響

2.6 ASA處理對果實脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性的影響

由圖6A可知，貯藏期間ASA處理組果實DHAR活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實DHAR活性在貯藏0-6d呈上升趨勢，6-8d逐漸下降。由圖6B知，貯藏期間ASA處理組果實MDHAR活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和MDHAR活性在貯藏0-4d逐漸上升，4-8d緩慢下降。ASA處理組果實0-2d迅速上升，隨后下降。上述結(jié)果表明，ASA處理可使DHAR和MDHAR活性維持在一個較高的水平。DHAR和MDHAR是促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)有效運轉(zhuǎn)的酶，使得活性氧能夠及時被清除。

圖6 ASA處理對蘋果果實脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性的影響

3 討論

先前試驗顯示[23]ASA能夠誘導(dǎo)果實的抗病性，降低果實采后病斑直徑，從而顯著降低采后爛損。本研究顯示ASA處理通過促進(jìn)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，抑制膜脂過氧化程度增加果實抗病性，從而有效抑制損傷接種T.Roseum蘋果果實果肉及果心組織病斑直徑的擴(kuò)展。

馬玄等[24]在杏子果實，以及前期試驗結(jié)果[23]顯示ASA采后誘導(dǎo)抗病性與活性氧代謝密切相關(guān)。外界生物或誘抗劑脅迫下，活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)瞬間大量積累使細(xì)胞膜損傷，植物體內(nèi)存在一套完整的抗氧化體系能夠迅速將ROS的水平降低到正常水平，其中抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)是主要的清除系統(tǒng)。AsA-GSH循環(huán)主要由4種抗氧化酶和4種非酶抗氧化物質(zhì)組成。試驗結(jié)果表明，ASA處理能夠提高抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性，增加抗壞血酸(AsA)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量，而一定程度上降低脫氫抗壞血酸(DHA)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量。由于ASA處理組果實較對照組果實能夠維持較高的APX、GR、DHAR、MDHAR活性，從而促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)高效運轉(zhuǎn)，增加果實活性氧的清除能力；AsA、GSH含量增加，DHA和GSSG含量將低,增大AsA/DHA和GSH/GSSG比值，從而使AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質(zhì)維持在較高的還原態(tài)，能夠有效猝滅瞬間氧爆產(chǎn)生的ROS。

ROS代謝和細(xì)胞膜質(zhì)過氧化息息相關(guān)。果實體內(nèi)ROS大量積累會導(dǎo)致膜脂過氧化，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)的完整性和功能[25]。LOX是植物脂肪酸氧化途徑中的關(guān)鍵酶，LOX不僅對質(zhì)膜產(chǎn)生破壞，并且催化產(chǎn)生的過氧化物等還對有機(jī)體的活性物質(zhì)造成損傷[26]。MDA積累是反映植物組織膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)[26,27]。試驗結(jié)果顯示，ASA處理果實能夠抑制MDA含量升高，降低LOX酶活性，從而減緩果實膜脂過氧化程度，保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，增加耐貯性。

4 結(jié)論

ASA處理有效控制由T.Roseum引起的蘋果霉心?。惶岣吖麑嵵蠥sA和GSH含量，降低DHA、GSSG的含量，增加APX、GR、DHAR和MDAR酶的活性，增強(qiáng)果實的ROS清除能力；降低果實MDA含量和LOX酶活性，減少過量ROS對細(xì)胞膜的造成的傷害。