電針胃俞募配穴對胃擴(kuò)張模型大鼠海馬c-fos表達(dá)水平及神經(jīng)細(xì)胞活動的影響

崔 敏，申國明，蔡榮林，王 浩，王溪陽，黃 順

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

俞募配穴是中醫(yī)臨床診療應(yīng)用廣泛的配穴方法。俞募相配，陰陽協(xié)調(diào)，相輔相成，對臟腑的陰陽平衡起調(diào)節(jié)作用，以期“陰平陽秘，精神乃治”，進(jìn)而達(dá)到治療病癥的目的。實驗研究發(fā)現(xiàn)，電針胃俞募穴可有效改善胃動力，促進(jìn)胃功能恢復(fù)。但俞募配穴的作用機(jī)制尚不明確，其中針刺穴位與靶器官的關(guān)系已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究的重點。

前期研究表明，俞募配穴針刺信號發(fā)揮對靶器官的調(diào)控作用是通過神經(jīng)環(huán)路完成的。海馬等參與調(diào)節(jié)胃運動相關(guān)的腦核團(tuán)之間存在豐富的纖維聯(lián)系。化學(xué)遺傳學(xué)和膜片鉗技術(shù)顯示，電針足三里可通過激活海馬谷氨酸能神經(jīng)細(xì)胞參與對胃運動的調(diào)節(jié)。海馬在邊緣系統(tǒng)中占關(guān)鍵地位，參與調(diào)節(jié)胃腸運動。玻璃微電極技術(shù)發(fā)現(xiàn)，胃擴(kuò)張刺激信號傳入到海馬，影響海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的電活動。CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞可能在海馬對胃擴(kuò)張刺激的反應(yīng)中起著整合作用，參與胃腸功能的調(diào)控?；诖?，本研究借助免疫熒光和微電極陣列的方法分別測定大鼠海馬c-fos表達(dá)水平和神經(jīng)細(xì)胞放電頻率，觀察海馬是否參與胃俞募配穴對胃擴(kuò)張模型大鼠胃運動的調(diào)節(jié)。

1 材料

1.1 實驗動物及分組 選用40只7周齡SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場[生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2019-0002]。置于(25±2)℃的室溫中常規(guī)飼養(yǎng)，確保大鼠自由及充足的攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為模型組、中脘組、胃俞組、中脘+胃俞組、非經(jīng)非穴組。實驗過程中嚴(yán)格遵循《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細(xì)則》，所有動物實驗均按照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要儀器與試劑 胃腸壓力換能器(型號 YP200)：北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司；雙導(dǎo)智能胃腸電圖儀(型號 EGEG-2D)：合肥奧源科技發(fā)展有限公司；生物信號采集系統(tǒng)(Power Lab 8/30)：埃德儀器國際貿(mào)易有限公司；異氟烷(批號 20052802)：深圳瑞沃德生命科技有限公司；包埋機(jī)(型號 JB-P5)：武漢俊杰電子有限公司；c-fos一抗(貨號 sc-166940)：Santa Cruz；DAPI染液(批號 071618190213)、抗熒光淬滅封片劑(批號 111318190306)：Beyotime。

2 方法

2.1 模型復(fù)制方法 參考宗勇等的模型復(fù)制方法。取乳膠條狀氣球和聚乙烯軟管，制成原始容積為0.1 mL的胃內(nèi)留置球囊。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，將大鼠固定于鼠臺。并將石蠟油涂在軟管管壁上，然后將球囊緊貼大鼠口腔后壁插入胃內(nèi)，在胃竇部(見圖1)固定，從胃竇引出的聚乙烯軟管與Power Lab 8/30生理信號采集系統(tǒng)相連，以記錄到大鼠胃內(nèi)壓≥40 mmHg時為模型復(fù)制成功的標(biāo)志。每天予以20 min胃擴(kuò)張刺激，連續(xù)7 d。

圖1 胃擴(kuò)張模型球囊位置示意圖

2.2 干預(yù)方法 模型復(fù)制7 d后開始干預(yù)，每次20 min，共7 d。模型組予以胃擴(kuò)張刺激，電針組依據(jù)華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》以及在實驗期間觀察到的大鼠體表的骨性標(biāo)志，“中脘”穴定位于大鼠腹正中線臍上約20 mm，“胃俞”穴定位于第13胸椎下旁開約5 mm。非經(jīng)非穴組對照刺激點則選取雙脅下髂嵴上10 mm，后正中線旁開20 mm處。各電針組分別行毫針直刺相應(yīng)穴位2～3 mm，在確保毫針與電針儀導(dǎo)線連接好的基礎(chǔ)上，選擇疏密波，電壓9 V，頻率20～100 Hz，電流2～3 mA。

2.3 胃內(nèi)壓記錄 大鼠于實驗前禁食不禁水12 h，實驗時腹腔注射麻醉，束縛于鼠臺，在聚乙烯軟管管壁上涂上石蠟油，將氣囊插入胃內(nèi)，在胃竇部固定，從胃竇引出的聚乙烯軟管與Power Lab 8/30生理信號采集系統(tǒng)連接，記錄大鼠胃內(nèi)壓振幅變化情況，每次記錄時間為60 min。

2.4 胃電圖記錄 將大鼠麻醉后并仰臥位固定于鼠板上，以大鼠肚臍與胸劍結(jié)合部連線的中點為胃竇體表投影處，胃竇體表投影處向左旁開1 cm稍上方為胃體體表投影區(qū)。分別將電極放置在胃竇、胃體體表投影區(qū)，其中參考電極、接地電極分別置于大鼠右上肢內(nèi)側(cè)、右下肢內(nèi)側(cè)踝部(圖2)。打開儀器，開始采集體表胃電信號，記錄時間為5 min。

圖2 體表胃電實驗電極接放位置示意圖

2.5 免疫熒光法檢測海馬CA1區(qū)c-fos表達(dá)水平 將固定好后的腦組織常規(guī)脫水、包埋、制成5 μm石蠟切片、抗原修復(fù)。接著進(jìn)行封閉、抗體孵育、DAPI染色等處理，將切片置于熒光顯微鏡下，于低倍鏡下明確視野，高倍鏡下采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理與分析系統(tǒng)分析所選視野的c-fos陽性細(xì)胞，以高倍鏡下海馬同一區(qū)域c-fos陽性細(xì)胞數(shù)代表c-fos表達(dá)水平。

2.6 微電極陣列技術(shù)記錄海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞放電 將大鼠麻醉后，先將其固定于腦立體定位儀上，調(diào)平之后在大鼠頭部正中剪一平滑切口，暴露前囟(Bregma)點，墨水標(biāo)記。依據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》，精確定位于海馬CA1(前囟后3.0～3.8 mm，中線旁開2.0～2.4 mm，顱骨平面以下2.0～3.0 mm)。在海馬CA1區(qū)鉆開顱骨窗，將8通道微電極陣列固定于腦立體定位儀上，用紫銅網(wǎng)覆蓋以屏蔽干擾信號。電極勻速向下推進(jìn)，速度1 μm/s，直至目標(biāo)腦區(qū)。打開在體電生理信號記錄系統(tǒng)，觀察放電活動情況，待觀察到穩(wěn)定的神經(jīng)電活動后，開始記錄5 min。

3 結(jié)果

3.1 電針胃俞募配穴對胃擴(kuò)張大鼠胃內(nèi)壓的影響 5組大鼠的胃收縮波形具有顯著性差異，見圖3。與模型組比較，中脘組、胃俞組、中脘+胃俞組大鼠胃內(nèi)壓顯著升高(

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05)，而非經(jīng)非穴組大鼠胃內(nèi)壓無明顯變化(

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05)；中脘+胃俞組胃內(nèi)壓較中脘組、胃俞組顯著升高(

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05)。見圖4。

圖3 5組大鼠的胃收縮波形

注：A.模型組；B.中脘組；C.胃俞組；D.非經(jīng)非穴組；E.中脘+胃俞組；與模型組比較，*P<0.05；與中脘組比較，#P<0.05；與胃俞組比較，△P<0.05

3.2 電針胃俞募配穴對胃擴(kuò)張大鼠胃電振幅的影響 5組大鼠胃電振幅有明顯差異，見圖5。與模型組比較，中脘組、胃俞組、中脘+胃俞組胃電幅值顯著升高(

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05)，非經(jīng)非穴組胃電振幅無明顯變化(

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05)；中脘+胃俞組較中脘組、胃俞組胃電振幅顯著升高。見圖6。

圖5 5組大鼠的體表胃電波形

注：A.模型組；B.中脘組；C.胃俞組；D.非經(jīng)非穴組；E.中脘+胃俞組；與模型組比較，*P<0.05；與中脘組比較，#P<0.05；與胃俞組比較，△P<0.05

3.3 電針胃俞募配穴對胃擴(kuò)張大鼠海馬CA1區(qū)c-fos蛋白表達(dá)水平的影響 熒光顯微鏡下，可見c-fos呈陽性表達(dá)，細(xì)胞核呈綠色染色，見圖7。與模型組比較，中脘組、胃俞組以及中脘+胃俞組大鼠海馬CA1區(qū)c-fos蛋白表達(dá)水平顯著增加(

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05)，非經(jīng)非穴組大鼠海馬CA1區(qū)c-fos蛋白表達(dá)水平無明顯變化(

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05)；中脘+胃俞組c-fos蛋白表達(dá)水平顯著高于中脘組和胃俞組(

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05)。見圖8。

注：紅色箭頭示c-fos陽性表達(dá)

注：A.模型組；B.中脘組；C.胃俞組；D.非經(jīng)非穴組；E.中脘+胃俞組；與模型組比較，*P<0.05；與中脘組比較，#P<0.05；與胃俞組比較，△P<0.05

3.4 電針胃俞募配穴對胃擴(kuò)張大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞放電頻率的影響 5組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞60 s內(nèi)放電的光柵圖見圖9。通過實時頻譜分析發(fā)現(xiàn)，中脘+胃俞組局部場電位頻譜能量較模型組顯著增強(qiáng)，中脘組、胃俞組局部場電位頻譜能量低于中脘+胃俞組，模型組和非經(jīng)非穴組頻譜能量變化無明顯差異，見圖10。與模型組比較，中脘組、胃俞組、中脘+胃俞組神經(jīng)細(xì)胞放電頻率顯著增加(

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<0

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05)，而非經(jīng)非穴組神經(jīng)細(xì)胞放電頻率無明顯變化(

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>0.05)；與中脘組、胃俞組比較，中脘+胃俞組神經(jīng)細(xì)胞放電頻率增多(

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<0

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05)。見圖11。

圖9 5組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞放電的光柵圖

圖10 5組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞放電實時頻譜圖

注：A.模型組；B.中脘組；C.胃俞組；D.非經(jīng)非穴組；E.中脘+胃俞組；與模型組比較，*P<0.05；與中脘組比較，#P<0.05；與胃俞組比較，△P<0.05

4 討論

胃擴(kuò)張屬于中醫(yī)學(xué)“痞滿”范疇，主要病因是由脾胃失調(diào)，正氣受損。脾虛不升，胃弱不降，氣機(jī)失和，致使胃脘脹滿疼痛。主要表現(xiàn)為持續(xù)性脹痛，可有陣發(fā)性加重。針刺可改善胃擴(kuò)張患者的脹痛等不適癥狀，且胃俞募穴相配使用效果優(yōu)于單穴，俞募配穴法是始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的一種取穴簡便、配伍精煉的經(jīng)典配穴方法，對臨床療效有顯著影響?！峨y經(jīng)·六十七難》：“五臟募皆在陰，而俞皆在陽者，何謂也？然陰病行陽，陽病行陰。故令募在陰，俞在陽?！庇崮枷嗯?，臟病取腰背之背俞穴，腑病取胸腹之腹募穴，一陰一陽、前后相應(yīng)，兩穴相配有補(bǔ)虛化滯、理氣健脾、強(qiáng)胃壯腑的功效。因此，當(dāng)胃腑有病時，所屬胃俞穴和中脘穴常配伍使用。研究發(fā)現(xiàn)，電針俞募配穴可以一定程度調(diào)節(jié)功能性消化不良大鼠胃排空率和胃泌素水平，改善胃運動。前期研究顯示，電針胃俞募穴可調(diào)節(jié)正常大鼠、功能性消化不良模型大鼠的胃運動。本研究結(jié)果顯示，電針胃俞募配穴可以加強(qiáng)胃擴(kuò)張模型大鼠胃運動，并且俞募穴相配具有協(xié)同作用，與前期研究結(jié)果一致。

針灸治療效果能夠產(chǎn)生的關(guān)鍵原因之一就是腧穴配伍，腧穴配伍能夠整合并部分增強(qiáng)單穴對胃腸激素的調(diào)節(jié)效應(yīng)。邊緣系統(tǒng)在腧穴配伍針刺調(diào)節(jié)胃運動中起著重要的作用，大腦-邊緣系統(tǒng)是協(xié)調(diào)內(nèi)臟-軀體行為的高級整合中樞，海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，能參與內(nèi)臟活動，協(xié)調(diào)機(jī)體行為的變化，適應(yīng)軀體活動和情緒反應(yīng)。海馬結(jié)構(gòu)主要包括海馬體、齒狀回、下托，由CA1、CA2、CA3和CA4組成。信息進(jìn)入海馬時由齒狀回流入CA3再經(jīng)過CA1整合輸出，邊緣系統(tǒng)海馬與下丘腦核團(tuán)聯(lián)系緊密，纖維投射復(fù)雜并廣泛參與胃功能的調(diào)節(jié)，纖維自海馬發(fā)出，經(jīng)穹窿周區(qū)到達(dá)下丘腦，再經(jīng)由中腦、腦橋、延髓和自主神經(jīng)系統(tǒng)等逐級下傳，參與調(diào)節(jié)胃運動。中醫(yī)講究辨證論治和整體觀念，認(rèn)為在機(jī)體中存在著腦與臟器的相互作用以及反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，腦功能與相關(guān)臟器功能間作用機(jī)制的研究將成為腦科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，并兼具生物醫(yī)學(xué)及臨床實踐意義。研究表明，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞激活可對胃運動有調(diào)節(jié)作用。電生理實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬中有胃擴(kuò)張敏感神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)胃腸蠕動。c-fos蛋白參與多種神經(jīng)細(xì)胞活動，c-fos的表達(dá)在腦內(nèi)與海馬、邊緣系統(tǒng)等密切相關(guān)?；A(chǔ)狀態(tài)下，c-fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)水平非常低甚至無表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞受到外界刺激后會迅速表達(dá)c-fos，c-fos蛋白的表達(dá)通常被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞活動的重要標(biāo)志。

胃運動實驗結(jié)果提示，電針組和模型組振幅差異明顯，胃俞募配穴的針刺信息參與了胃運動的調(diào)節(jié)；通過免疫熒光法在各組大鼠海馬CA1區(qū)發(fā)現(xiàn)c-fos陽性表達(dá)，中脘和胃俞針刺信號聚集在海馬CA1中。微陣列電極實驗發(fā)現(xiàn)，電針能夠刺激海馬神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生電活動且放電明顯。這說明胃擴(kuò)張時海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞放電頻率下降，而電針逆轉(zhuǎn)了此現(xiàn)象。實時頻譜顯示各組色彩的明暗和光譜的變化情況，清晰地展現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞放電活動在電針前后能量的高低變化。顏色越深說明局部場電位頻譜能量越強(qiáng)，這與頻率光柵圖的變化趨于一致。海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞電活動參與了電針調(diào)節(jié)胃擴(kuò)張模型大鼠胃運動的機(jī)制且具有隨時間變化的特點。電針中脘穴和胃俞穴可以激活海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，并且針刺信號可能在海馬CA1區(qū)匯聚。胃擴(kuò)張信號能夠傳入海馬，電針俞募配穴的針刺信號也在海馬CA1區(qū)匯聚，為海馬參與胃功能調(diào)節(jié)提供直接依據(jù)。這表明胃擴(kuò)張信號和針刺信號可在海馬內(nèi)發(fā)生作用，通過激活海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞活性參與調(diào)節(jié)胃運動。

綜上所述，電針可以調(diào)節(jié)胃運動，且俞募配穴具有協(xié)同作用，海馬CA1區(qū)可能是胃俞募配穴調(diào)節(jié)胃運動的具有代表性的中樞特異性靶點。因此，為深入研究針刺胃俞募配穴調(diào)節(jié)胃運動的中樞機(jī)制，下一步課題組擬聚焦海馬CA1區(qū)orexin-A，海馬是否通過orexin-A神經(jīng)通路參與電針胃俞募穴對胃運動的調(diào)節(jié)作用，有待于進(jìn)一步探討。