一過(guò)性食管下括約肌松弛動(dòng)物模型的建立及其機(jī)制探討

朱海燕 張咩慶

[摘要] 目的 建立一過(guò)性食管下括約肌松弛（TLESR）的大鼠模型并探討其發(fā)生機(jī)制。 方法 SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、模型組、藥物（saclofen）注射組、空白注射組，每組12只。通過(guò)逐次向胃內(nèi)注水的方法建立胃擴(kuò)張誘發(fā)TLESR的動(dòng)物模型。藥物注射組和空白注射組在進(jìn)行胃擴(kuò)張30 min前，用微量注射法往孤束核區(qū)注射GABAB受體阻斷劑saclofen或改良Riger液。采用消化道動(dòng)力檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)、分析TLESR頻率，采用免疫組織化學(xué)法觀察孤束核區(qū)GABAB受體表達(dá)。 結(jié)果 模型組大鼠TLESR頻率提高，GABAB受體表達(dá)減少，向孤束核區(qū)微量注射GABAB受體阻斷劑可大幅提高TLESR頻率。 結(jié)論 提示胃擴(kuò)張?jiān)炷３晒?，TLESR的發(fā)生與孤束核中GABAB受體調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 一過(guò)性下食管括約肌松弛;造模;胃擴(kuò)張;GABAB受體

[中圖分類(lèi)號(hào)] R571? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）04-0035-04

[Abstract] Objective To establish a rat model of transient lower esophageal sphincter relaxation（TLESR） and explore its mechanism. Methods SD male rats were randomly divided into 4 groups： Blank control group， model group， drug（saclofen）injection group and blank injection group， with 12 rats in each group. An animal model of gastric expansion induced TLESR was established by successively injecting water into the stomach. The drug injection group and the blank injection group were injected with the GABAB receptor blocker saclofen or modified Riger solution into the solitary nucleus region by microinjection before the gastric dilation was performed for 30 min. The frequency of TLESR was detected and analyzed by digestive tract dynamic detection system， and the expression of GABAB receptor in the solitary nucleus was observed by immunohistochemistry. Results In the model group， the frequency of TLESR increased and the expression of GABAB receptor decreased. Microinjection of GABAB receptor blocker into the solitary tract nucleus region could significantly increase the frequency of TLESR. Conclusion It is suggested that the gastric dilatation model is successful， and the occurrence of TLESR is closely related to the regulation of GABAB receptor in the solitary tract nucleus.

[Key words] Transient lower esophageal sphincter relaxation; Modeling; Gastric dilatation; GABAB receptor

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是臨床常見(jiàn)疾病，我國(guó)近年來(lái)本病患病率在逐年升高[1]。一過(guò)性食管下括約肌松弛（transient lower esophageal sphincter relaxation，TLESR）被認(rèn)為是其發(fā)病根本病因[2]。TLESR是指與吞咽無(wú)關(guān)的食管下括約肌自發(fā)性松弛[3]，伴隨食管下括約肌壓力（low esophageal sphincter pressure，LESP）突然降低，其松弛時(shí)間可持續(xù)10～45 s，明顯長(zhǎng)于吞咽時(shí)食管下括約肌松弛時(shí)間（6～8 s），且降低≥5 mmHg。查慧等[4]研究發(fā)現(xiàn)健康人中有35%的TLESR伴隨胃食管反流，而GERD患者中有65%的TLESR伴隨胃食管反流，發(fā)生率明顯高于健康人。所以對(duì)于GERD的研究，不管在臨床還是在基礎(chǔ)研究中，如何抑制TLESR逐漸成為很多學(xué)者的關(guān)注點(diǎn)。既往有研究表明TLESR在進(jìn)食、胃擴(kuò)張時(shí)易發(fā)生，其發(fā)生機(jī)制可能與迷走神經(jīng)興奮有關(guān)，有研究顯示將犬頸部迷走神經(jīng)冷凍可完全阻斷TLESR[3]。腦干孤束核作為迷走神經(jīng)中樞接受胃擴(kuò)張等引發(fā)的神經(jīng)沖動(dòng)，作用于食管下括約肌，在引發(fā)TLESR的過(guò)程中可能起重要作用[4]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutiric acid，GABA）作為廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，孤束核中也存在大量GABA能神經(jīng)元及GABAB 受體。對(duì)孤束核內(nèi)GABA能神經(jīng)末梢的超微結(jié)構(gòu)研究顯示GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯(lián)系[5]。雖然研究表明，調(diào)節(jié)孤束核中GABAB受體可影響迷走神經(jīng)機(jī)械感受器，改變迷走神經(jīng)傳出沖動(dòng)[6]，但其在引發(fā)TLESR中作用尚不明確，本研究旨在探討腦干孤束核中GABAB受體在胃擴(kuò)張模型大鼠發(fā)生TLESR中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體重350～400 g，平均2.5月齡，均由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（滬）2013-0016]提供，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、模型組、藥物注射（saclofen）組、空白注射組，每組12只。該實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心完成[SYXK（浙）2013-0184]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃擴(kuò)張誘發(fā)TLESR模型? 大鼠予10%水合氯醛（0.35 mL/100 g 體重）腹腔注射麻醉（禁食10 h）后，予輕柔地插一端套有薄膜囊的聚乙烯軟管入胃，深度為下食管括約肌下4 cm，向氣囊內(nèi)注水，給予胃內(nèi)壓≥5.32 kPa（40 mm Hg）壓力的時(shí)相性胃擴(kuò)張（注水2 min，間歇4 min，交替進(jìn)行，6 min為1輪，共10輪）[7，8]。

1.2.2 孤束核內(nèi)微量注射針的埋入? 大鼠腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀上，切開(kāi)大鼠頭部皮膚，暴露骨縫，參照 LJ.Pellegrine 鼠腦定向圖譜，顱骨鉆孔，埋植不銹鋼套管（外徑0.5 mm，內(nèi)置直經(jīng)0.3 mm的不銹鋼絲，其下端比套管長(zhǎng)0.5 mm），微量注射時(shí)，將不銹鋼絲內(nèi)芯拔出，微量注射針超出外套管1 mm，用于局部微量注射。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)流程? 將適度麻醉的大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，采用消化道動(dòng)力檢測(cè)系統(tǒng)（型號(hào)：GAP-08A），經(jīng)口插入測(cè)壓管，使遠(yuǎn)端3個(gè)通道均置于胃內(nèi)，開(kāi)始記錄測(cè)壓數(shù)據(jù)。采用定點(diǎn)牽拉法（每15秒向外牽拉測(cè)壓管10 mm）勻速牽拉測(cè)壓管直至第2（或含第3）通道顯示位于LES內(nèi)時(shí)，將測(cè)壓管固定于動(dòng)物口邊。此時(shí)，第1通道位于胃內(nèi)，第2（或含第3）通道位于LES，檢測(cè)并分析TLESR的發(fā)生頻率?？瞻讓?duì)照組：不給予任何處理。胃擴(kuò)張模型組在進(jìn)行胃擴(kuò)張的同時(shí)開(kāi)始測(cè)壓。藥物（saclofen）注射組和空白注射組在進(jìn)行胃擴(kuò)張30 min前，微量注射針連接微量注射泵，以1 μL/min 的速度向孤束核區(qū)注射1 μL的Saclofen（美國(guó)Sigma公司）或改良Riger液，注入時(shí)程為1 min，30 min后進(jìn)行胃擴(kuò)張的同時(shí)開(kāi)始測(cè)壓。

1.2.4 樣本制作? 用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉后開(kāi)胸，向左心室灌注生理鹽水沖洗至右心房流出的液體變清，再用4%多聚甲醛溶液快速灌注固定，之后繼續(xù)緩慢固定30 min，斷頭取延髓界溝的外側(cè)（孤束核），標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛溶液6 h，然后于4℃時(shí)用15%蔗糖溶液脫水24 h，再于4℃用30%蔗糖溶液脫水48 h，標(biāo)本全部沉至容器底部，取出標(biāo)本，用錫箔紙包裹密封，液氮迅速冷凍。于恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)連續(xù)冠狀位冰凍片，片厚20 μm。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

TLESR發(fā)生檢測(cè)系統(tǒng)：消化道動(dòng)力檢測(cè)系統(tǒng)（型號(hào)：GAP-08A）檢測(cè)。TLESR的判定標(biāo)準(zhǔn)：LES從開(kāi)始松弛到完全松弛的時(shí)間≤10 s;LES的最低壓力應(yīng)≤2 mmHg。此外，對(duì)于壓力≤2 mmHg，松弛時(shí)間≥10 s的LES 松弛，且可以除外是由于多次快速吞咽所致可以被認(rèn)為是TLESR。免疫組化法檢測(cè)孤束核區(qū)GABAB受體的表達(dá)：將上述制作好的樣本在電鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色切片。選擇3個(gè)200倍視野，通過(guò)顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的總面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，TLESR頻率、GABAB受體陽(yáng)性面積測(cè)定值用（x±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠TLESR頻率結(jié)果

2.2 各組大鼠孤束核區(qū)GABAB受體免疫組化染色結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，模型組GABAB受體陽(yáng)性面積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.53，P<0.01）;與空白注射組相比，藥物注射組GABAB受體陽(yáng)性面積較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.48，P=0.03），見(jiàn)表2、封三圖7。

3 討論

TLESR是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的胃食管反流病發(fā)病的主要機(jī)制之一，主要有以下特征：（1）與吞咽無(wú)關(guān)的LESP突然降低或接近胃內(nèi)壓的水平（≥5 mmHg）;（2）LES松弛前4 s和后2 s無(wú)咽部吞咽信號(hào);（3）其發(fā)生時(shí)間持續(xù)長(zhǎng)于吞咽誘發(fā)的LES松弛時(shí)限，持續(xù)約10～45 s，吞咽誘發(fā)的LES松弛時(shí)限多為6～8 s;（4）缺乏食管體部的蠕動(dòng)收縮。有研究表明，胃底膨脹、胃排空遲緩會(huì)增加TLESR的頻率，是胃食管反流發(fā)生因素之一[9]。根據(jù)這一系列理論，結(jié)合既往相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[10]，本研究組利用大鼠胃內(nèi)注氣進(jìn)行胃擴(kuò)張來(lái)誘發(fā)TLESR，同時(shí)采用低順應(yīng)性毛細(xì)管灌注測(cè)壓系統(tǒng)記錄、分析TLESR發(fā)生頻率。試驗(yàn)期間模型組大鼠的TLESR發(fā)生頻率明顯高于空白對(duì)照組，表明胃擴(kuò)張誘發(fā)TLESR模型大鼠造模成功。

既往研究表明，γ-氨基丁酸B受體（γ-aminobutyric acid B receptor，GABAB-R）在調(diào)控TLESR相關(guān)迷走神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)介導(dǎo)下游的GABAA和GABAC受體以及代謝型GABAB-R發(fā)揮生理功效。其中GABAB-R大量存在于迷走神經(jīng)中樞孤束核中，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種神經(jīng)活動(dòng)并發(fā)揮重要功能[11]。孤束核是腦干內(nèi)接受內(nèi)臟初級(jí)感覺(jué)傳入信息的重要核團(tuán)，接受由迷走神經(jīng)傳入的胃擴(kuò)張等引發(fā)的感覺(jué)信號(hào)，調(diào)控食管下括約肌，在引發(fā)TLESR的過(guò)程中起重要作用[12]。對(duì)孤束核內(nèi)GABA能神經(jīng)末梢的超微結(jié)構(gòu)研究顯示GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯(lián)系[13]，調(diào)節(jié)孤束核中GABAB受體可影響迷走神經(jīng)機(jī)械感受器，改變迷走神經(jīng)傳出沖動(dòng)[6]。既往在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)GABAB-R激動(dòng)劑Baclofen可以影響食管下括約肌壓力，減少酸與非酸反流[14]。臨床研究也得出類(lèi)似的結(jié)論，在健康志愿者和胃食管反流病患者中均發(fā)現(xiàn)Baclofen可以明顯減少可明顯減少24 h 的胃食管反流并增加食管pH[15，16]。因此本研究組推測(cè)孤束核中GABAB-R在孤束核對(duì)于食管下括約肌的調(diào)節(jié)中扮演了重要角色，參與迷走神經(jīng)-食管中樞調(diào)控機(jī)制，與TLESR的發(fā)生存在一定關(guān)系。為了證實(shí)該推測(cè)，本研究組應(yīng)用孤束核內(nèi)微注射GABAB受體拮抗劑saclofen對(duì)胃擴(kuò)張誘發(fā)TLESR模型大鼠進(jìn)行預(yù)處理以觀察GABAB受體對(duì)TLESR發(fā)生的控制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GABAB受體拮抗劑saclofen組較空白注射組的TLESR發(fā)生頻率大幅上升，說(shuō)明GABAB受體調(diào)節(jié)與TLESR的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步的免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組大鼠與空白對(duì)照組大鼠比較，孤束核中GABAB受體表達(dá)下調(diào)，兩組間差異存在顯著性意義，與此同時(shí)，模型組大鼠相較于空白對(duì)照組大鼠的TLESR發(fā)生頻率顯著增加。說(shuō)明孤束核中GABAB受體表達(dá)下調(diào)與TLESR的發(fā)生及其合并反流減少存在相關(guān)性。但GABAB受體表達(dá)在TLESR發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制仍不清楚，可能與孤束核中GABA神經(jīng)遞質(zhì)含量變化有關(guān)，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)與空白注射組相比，GABAB受體拮抗劑saclofen組的GABAB受體表達(dá)上調(diào)，這也許是由GABAB受體被拮抗引發(fā)的代償性變化。既往研究表明，通過(guò)一定手段干預(yù)孤束核可調(diào)節(jié)消化道運(yùn)動(dòng)[17-19]，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示孤束核中GABAB受體在胃擴(kuò)張誘發(fā)TLESR發(fā)生及其合并反流的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胃腸動(dòng)力學(xué)組.胃食管反流病治療共識(shí)意見(jiàn)（2007，西安）[J].中華消化雜志，2007， 27（10）：689-690.

[2] Dent J，Holloway RH，Toouli J，et al. Mechanisms of low esophageal sphincter incompetencein patients with symptomatic gastroesophageal reflux[J].Gut，1988，29（12）：1020-1028.

[3] 林三仁，許國(guó)銘，胡品津，等.中國(guó)胃食管反流病共識(shí)意見(jiàn)[J].胃腸病學(xué)，2007，12（4）：233-239.

[4] 查慧，謝小平，侯曉華.胃食管反流病患者酸反流與食管運(yùn)動(dòng)功能障礙的關(guān)系[J].胃腸病學(xué)，2006，11（1）：41-44.

[5] 于霞，阿依古力·阿不力米提，蔣麗麗. 高分辨率食管測(cè)壓及24 h食管阻抗-pH值對(duì)功能性燒心和非糜爛性反流病患者的監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2017， 14（9）：92-95.

[6] Kuo P，Bravi I，Marreddy U，et al. Postprandial cardiac vagal tone and transient lower esophageal sphincter relaxation（TLESR）[J]. Neurogastroenterology & Motility the Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society，2013，25（10）：841-e639.

[7] Fawley JA，Peters JH，Andresen MC. GABA（B）-mediated inhibition of multiple modes of glutamate release in the nucleus of the solitary tract[J]. Journal of Neurophysiology，2011，106（4）：1833.

[8] Boeckxstaens GE，Beaumont H，Mertens V. Effects of lesogaberan，a novel GABA（B）-receptor agonist，on reflux and lower esophageal sphincter function in patients with gastroesophageal reflux disease[J]. Gastroenterology，2010，139：377-379.

[9] Chi Wang，De-Feng Zhou，xiao-Wei Shuai，et al. Effects and mechanisms of electroacupuncture at PC6 on frequency of transient lower esophageal sphincter relaxation in cats[J]. World Journal of Gastroenterology（English Edition），2007，13（36）：4873-4880.

[10] 彭艷，易受鄉(xiāng)，李振海，等.毫針不同刺激強(qiáng)度對(duì)胃擴(kuò)張?zhí)弁创笫蠹顾璞辰荖MDA受體和P物質(zhì)的影響[J].世界華人消化雜志，2009，17（13）：1339-1345.

[11] Mittal RK，Holloway RH，Penagini R，et al. Transient lower esophageal sphincter relaxation[J]. Gastroenterology，1995，109：601-610.

[12] 王馳，陳欣，謝鵬雁，等.他克林對(duì)食管運(yùn)動(dòng)的影響及電針刺治療[C].//2014中華醫(yī)學(xué)會(huì)北京分會(huì)消化系病學(xué)術(shù)年會(huì)論文集，2014：77.

[13] Pin JP，Kniazeff J，Binet V，et al. Activation mechanism of the heterodimeric GABA（B） receptor[J]. Biochemical Pharmacology，2004，68（8）：1565-1572.

[14] Fawley JA，Peters JH，Andresen MC. GABA（B）-Mediated inhibition of multiple modes of glutamate release in the nucleus of the solitary tract[J]. Journal of Neurophysiology，2011，106（4）：1833.

[15] Boeckxstaens GE，Beaumont H，Mertens V. Effects of? lesogaberan，a novel GABA（B）-receptor agonist，on reflux and lower esophageal sphincter function in patients with gastroesophageal reflux disease[J]. Gastroenterology，2010，139：377-379.

[16] Boeckxstaens GE，Denison H，Jensen JM，et al. Translational gastrointestinal pharmacology in the 21st century：The lesogaberan story'[J]. Current Opinion in Pharmacology，2011，11（6）：630.

[17] Cossentino MJ，Mann K，Armbruster SP，et al. Randomised clinical trial：The effect of baclofen in patients with gastro-oesophageal reflux-a randomised prospective study[J]. Alimentary Pharmacology & Therapeutics，2012， 35（9）：1036-1044.

[18] Tsoukali E，Sifrim D. The role of weakly acidic reflux in proton pump inhibitor failure，has dust settled[J]. Journal of Neurogastroenterology & Motility，2010，16（3）：258-264.

[19] 陳姝，雍春燕，陳恒，等.胃擴(kuò)張模型大鼠迷走神經(jīng)脊核胃相關(guān)神經(jīng)元對(duì)不同針刺穴位的反應(yīng)[J].中國(guó)組織工程研究，2014，（36）：5842-5846.

（收稿日期：2018-09-11）