長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)抑制特異因子5調(diào)控微小RNA-137對(duì)Aβ誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

趙美英史文倩汪桂青

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院老年科，鄭州 450007)

阿爾茲海默癥(alzheimer’s disease，AD)日益成為全球性疾病，影響患者個(gè)人健康，淀粉樣蛋白假說(shuō)是目前主流的AD發(fā)病理論，淀粉樣β蛋白(amyloid-βprotein，Aβ)聚集影響神經(jīng)元功能，是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和癡呆的誘因，且臨床上尚無(wú)根治藥物[1]。靶向分子治療成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)參與神經(jīng)元發(fā)育、增殖、凋亡、神經(jīng)可塑性、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)等多種功能[2]；生長(zhǎng)抑制特異因子5(growth arrestspecific 5，GAS5)作為一種LncRNA，最早在增殖抑制的細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，且可促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)升高可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，但其在AD中發(fā)揮何種作用，尚未發(fā)現(xiàn)研究[3]。研究報(bào)道，GAS5可以靶向微小RNA(microRNA，miRNA)影響疾病[4－5]。miR-137可抑制細(xì)胞外Aβ沉積，從而調(diào)控下游靶基因，抑制神經(jīng)元死亡、緩解凋亡過(guò)程，從而緩解AD[6]。且研究發(fā)現(xiàn)，GAS5可靶向miR-137影響缺血再灌注損傷，但在神經(jīng)元損傷中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究[7]。因此，本研究采用Aβ誘導(dǎo)大鼠構(gòu)建AD模型，探討GAS5調(diào)控miR-137對(duì)大鼠神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只6周齡SPF級(jí)雄性健康SD大鼠購(gòu)自中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2017-0005]，體重(160±10)g。大鼠在溫度(24±1)℃、濕度(50±5)%、12 h晝夜節(jié)律。黑暗條件下自由攝食飲水，正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)(藥物研究院)[SYXK(豫)2018-0004]，1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院倫理協(xié)會(huì)審核并通過(guò)(IACUC-20190106)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則。

1.1.2 細(xì)胞

大鼠海馬神經(jīng)元購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

Aβ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；si-NC、si-GAS5、anti-miR-NC、anti-miR-137、GAS5 MUT、GAS5 WT、miR-137 mimic、miR-137 mimic NC均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、Bcl2相關(guān)X蛋白(Bcl2 associated X protein，BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cystein-asparate protease 3，caspase3)均購(gòu)自英國(guó)abcam公司，貨號(hào)ab194583、ab32503、ab184787。7500實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Tanon 4100全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照(control)組、Aβ組、Aβ＋si-NC組、Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組，每組10只。對(duì)照組和Aβ組海馬CAI區(qū)(具體位置:Bregma后3 mm、中線(xiàn)旁開(kāi)2.2 mm、深度2.5 mm)注射10μL PBS液，Aβ＋si-NC組注射10μL si-NC，Aβ＋si-GAS5組注射10μL si-GAS5，Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組注射si-GAS5、anti-miR-NC各10μL，Aβ＋si-GAS5＋antimiR-137組注射si-GAS5、anti-miR-137各10μL，15 min后除對(duì)照組外將10 nmol/μL Aβ31－35注入海馬CAI區(qū)[8]，對(duì)照組注射等量生理鹽水。14 d后進(jìn)行研究。

1.3.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠行為

14 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，Y型迷宮刺激器檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)能力。根據(jù)Martyn等[9]方法，對(duì)大鼠重復(fù)測(cè)試，大鼠連續(xù)10次測(cè)試中出現(xiàn)9次及以上做出正確反應(yīng)即作為學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄大鼠正確反應(yīng)次數(shù)；計(jì)算正確反應(yīng)次數(shù)比例(%)＝(正確反應(yīng)次數(shù))/總實(shí)驗(yàn)次數(shù)×100%，重復(fù)Y迷宮實(shí)驗(yàn)，20次實(shí)驗(yàn)中達(dá)到正確反應(yīng)次數(shù)作為記憶成績(jī)，學(xué)會(huì)次數(shù)比例(%)＝(達(dá)到正確反應(yīng)次數(shù)的次數(shù))/總實(shí)驗(yàn)次數(shù)×100%。

1.3.3 樣本收集

結(jié)束后立即收集海馬CAI區(qū)組織，部分置于4%多聚甲醛中固定，部分置于－80℃冰箱保存待檢。

1.3.4 RT-qPCR法檢測(cè)海馬CAI區(qū)GAS5、miR-137水平

部分海馬CAI區(qū)組織RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列見(jiàn)表1。20μL反應(yīng)體系:2×SYBR qPCR Mix 10μL，cDNA(50 ng/μL)1μL，F(xiàn)/R(10μmol/L)0.5μL/0.5μL，ddH2O 8μL；反應(yīng)條件:94℃、60 s；95℃、30 s(GAS5:61℃、40 s，miR-137:59℃、35 s)，40個(gè)循環(huán)。2－ΔΔCt法計(jì)算GAS5、miR-137相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.5 尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài)

4%多聚甲醛中固定的海馬CAI區(qū)組織經(jīng)石蠟包埋后切片，切片厚度6μm，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇浸潤(rùn)，切片進(jìn)入A液(Cresyl violet Stain)56℃染色60 min，PBS漂洗，置于B液(Nissl Differentiation)分色數(shù)秒至2 min直至背景色接近無(wú)色，顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)、尼氏小體情況。

1.3.6 Tunel染色觀察大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

切片脫蠟處理，加2%蛋白酶K室溫孵育20 min，PBS清洗后滴加50μL Tunel反應(yīng)混合溶液，濕盒孵育60 min，抗熒光猝滅液(含DAPI)封片后熒光顯微鏡下觀察，其中綠色熒光顯示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬CAI區(qū)Bcl2、BAX、caspase3蛋白水平

－80℃取部分海馬CAI區(qū)組織，蛋白裂解液冰上裂解，4℃10000 r/min離心20 min，上清為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白、NC轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉；對(duì)應(yīng)加入一抗Bcl2、BAX、caspase3、GAPDH，4℃孵育過(guò)夜；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.3.8 雙熒光素酶鑒定miR-137與GAS5的靶向位點(diǎn)

Starbase分析發(fā)現(xiàn)miR-137與GAS5存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)；將miR-137與GAS5結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的序列克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報(bào)告載體上構(gòu)建GAS5野生型(GAS5 WT)及突變型(GAS5 MUT)熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-137 mimic或miR-137 mimic NC共轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元中，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組熒光素酶相對(duì)活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步采用SNK-q法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮檢測(cè)大鼠行為

與對(duì)照組相比，Aβ組、Aβ＋si-NC組、Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)比例、學(xué)會(huì)次數(shù)比例降低(P<0.05)；分別與Aβ組、Aβ＋si-NC組相比，Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)比例、學(xué)會(huì)次數(shù)比例升高(P<0.05)；分別與Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組相比，Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)比例、學(xué)會(huì)次數(shù)比例降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Y迷宮檢測(cè)大鼠行為Figure 1 Y maze to detect rat behavior

2.2 RT-qPCR檢測(cè)海馬CAI區(qū)GAS5、miR-137水平

與對(duì)照組相比，Aβ組、Aβ＋si-NC組海馬CAI區(qū)GAS5 mRNA水平升高(P<0.05)、miR-137水平降低(P<0.05)；分別與Aβ組、Aβ＋si-NC組相比，Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組海馬CAI區(qū)GAS5 mRNA水平降低(P<0.05)、miR-137水平升高(P<0.05)；分別與Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組相比，Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組海馬CAI區(qū)GAS5 mRNA水平升高(P<0.05)、miR-137水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2A、B。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)海馬CAI區(qū)GAS5、miR-137表達(dá)水平Figure 2 Expression of GAS5 and miR-137 in hippocampal CA1 area by RT-qPCR

2.3 尼氏染色觀察海馬CAI區(qū)神經(jīng)元形態(tài)

與對(duì)照組相比，Aβ組、Aβ＋si-NC組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元死亡率升高(P<0.05)；分別與Aβ組、Aβ＋si-NC組相比，Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元死亡率降低(P<0.05)；分別與Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組相比，Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元死亡率升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3A、B。

圖3 海馬CAI區(qū)神經(jīng)元情況Figure 3 Neurons in the hippocampal CAI area

2.4 Tunel染色觀察海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡情況

與對(duì)照組相比，Aβ組、Aβ＋si-NC組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡率升高(P<0.05)；分別與Aβ組、Aβ＋si-NC組 相 比，Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡率降低(P<0.05)；分別與Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組相比，Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡率升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4A、B。

圖4 海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡情況Figure 4 Apoptosis of hippocampal CAI Neurons

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬CAI區(qū)Bcl2、BAX、caspase3蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，Aβ組、Aβ＋si-NC組海馬CAI區(qū)Bcl2蛋白水平降低(P<0.05)，BAX、caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；分別與Aβ組、Aβ＋si-NC組相比，Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組海馬CAI區(qū)Bcl2蛋白水平升高(P<0.05)，BAX、caspase3蛋白水平降低(P<0.05)；分別與Aβ＋si-GAS5組、Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-NC組相比，Aβ＋si-GAS5＋anti-miR-137組海馬CAI區(qū)Bcl2蛋白水平降低(P<0.05)、BAX、caspase3蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5A、B。

圖5 Western blot檢測(cè)海馬CAI區(qū)Bcl2、BAX、caspase3蛋白表達(dá)水平Figure 5 Expression of Bcl2，BAX，caspase3 protein in hippocampal CA1 area by Western blot

2.6 miR-137與GAS5的靶向關(guān)系

miR-137與GAS5之間存在靶位點(diǎn)。見(jiàn)圖6A。與miR-137 NC＋GAS5 WT相比，miR-137 mimic＋GAS5 WT熒光素酶相對(duì)活性下降(P<0.05)；與miR-137 NC＋GAS5 MUT相比miR-137 mimic＋GAS5 MUT熒光素酶相對(duì)活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖6B。

圖6 miR-137與GAS5的靶向關(guān)系Figure 6 Targeting relationship between miR-137 and GAS5

3 討論

AD中Aβ沉積是作用機(jī)制之一，Aβ沉積造成神經(jīng)元損傷，可加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，對(duì)動(dòng)物行為和認(rèn)知功能產(chǎn)生影響[10]。神經(jīng)元病變與細(xì)胞凋亡關(guān)系異常密切，在AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Aβ的誘導(dǎo)可導(dǎo)致神經(jīng)凋亡，因此，抗神經(jīng)元凋亡已經(jīng)成為AD研究的重要方向[11－12]。在公認(rèn)的內(nèi)源性凋亡通路中，Aβ可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl2蛋白水平降低，促凋亡蛋白BAX、caspase3蛋白水平升高，從而激活內(nèi)源性凋亡途徑[13]。而在本研究中大鼠正確反應(yīng)次數(shù)比例、學(xué)會(huì)次數(shù)比例降低，相比正常大鼠，Aβ大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能出現(xiàn)明顯抑制，存在認(rèn)知障礙。尼氏染色檢測(cè)海馬CAI區(qū)神經(jīng)元形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Aβ導(dǎo)致神經(jīng)元死亡嚴(yán)重；Tunel染色發(fā)現(xiàn)，Aβ導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重，蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)海馬CAI區(qū)Bcl2蛋白水平降低，BAX、caspase3蛋白水平升高，提示在大鼠腦組織中注射Aβ導(dǎo)致Aβ沉積，從而促進(jìn)神經(jīng)元凋亡、死亡，影響認(rèn)知功能。

LncRNA廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在神經(jīng)元損傷中可觀察到LncRNA顯著變化，并參與轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程從而調(diào)控基因組印跡、染色體修飾、mRNA的翻譯等過(guò)程，從而影響神經(jīng)損傷及修復(fù)過(guò)程[14]。GAS5在缺血性腦卒中中呈高表達(dá)，具有神經(jīng)毒性作用，下調(diào)GAS5可以減輕神經(jīng)元損傷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血性卒中的保護(hù)作用[15]；敲除GAS5可以抑制創(chuàng)傷性腦損傷導(dǎo)致的Bax升高從而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)，因此有望成為治療神經(jīng)元損傷的治療靶點(diǎn)[16]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)添加Aβ后導(dǎo)致海馬CAI區(qū)GAS5 mRNA水平均升高，提示海馬CAI區(qū)GAS5轉(zhuǎn)錄和翻譯受Aβ沉積的影響均處于激活狀態(tài)，而高表達(dá)的GAS5具有神經(jīng)毒性作用，加重神經(jīng)元損傷。與Aβ組相比，Aβ＋si-GAS5組正確反應(yīng)次數(shù)比例、學(xué)會(huì)次數(shù)比例升高，神經(jīng)元死亡、神經(jīng)元凋亡率均降低，海馬CAI區(qū)Bcl2蛋白水平升高，Bax、caspase3蛋白水平降低，提示干擾GAS5后可通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡減少神經(jīng)死亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)，學(xué)習(xí)和記憶功能有所緩解。

miRNA作為非編碼小RNA，LncRNA上存在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，miRNA又可沉默靶基因，從而影響生物學(xué)功能[17－18]。腦神經(jīng)元中富含miR-137，特別是在皮層區(qū)和海馬區(qū)，Aβ經(jīng)過(guò)淀粉樣前體蛋白分解成蛋白質(zhì)，而miR-137可調(diào)控該類(lèi)蛋白質(zhì)從而降低Aβ水平，且miR-137與Aβ在腦神經(jīng)元中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。在Aβ積累和神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的AD中miR-137水平降低，可能是誘導(dǎo)蛋白1的水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性、凋亡，促進(jìn)caspase3活化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加Aβ可降低miR-137水平，而miR-137水平降低對(duì)Aβ的降解作用減弱，導(dǎo)致Aβ在神經(jīng)元處積累，誘發(fā)神經(jīng)元損傷。而GAS5與miR-137關(guān)系密切，且GAS5下調(diào)可明顯增加miR-137表達(dá)[21]，干擾GAS5后miR-137水平升高，而升高后的miR-137實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用加強(qiáng)，減緩神經(jīng)元凋亡降低。添加anti-miR-137后可逆轉(zhuǎn)干擾GAS5對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

綜上所述，干擾GAS5后可上調(diào)miR-137表達(dá)來(lái)降低Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，下調(diào)miR-137可逆轉(zhuǎn)上述過(guò)程。本研究首次驗(yàn)證了GAS5在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中起促進(jìn)作用，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)GAS5可下調(diào)miR-137促進(jìn)神經(jīng)元凋亡進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元損傷，但miR-137靶基因較多，通過(guò)哪些具體信號(hào)通路發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。