解偶聯蛋白1敲除加劇異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌重構

鄭 媛付鶴玲侯道榮尹 媛鮑 丹

(南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心，南京 210000)

解偶聯蛋白(uncoupling proteins，UCPs)是陰離子載體蛋白超家族的成員之一，位于線粒體內膜，參與線粒體膜電位的調控[1]。UCPs的發(fā)現，提出了質子泄漏學說[2]，即在正常情況下線粒體內膜存在一定程度的質子泄漏，使線粒體內膜的跨膜質子梯度減低，以致刺激線粒體呼吸的質子驅動力降低，使線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯，導致ATP數量減少，能量以熱能的形式釋放。研究發(fā)現，UCPs可減少線粒體氧化磷酸化過程中ROS的產生[3]。

UCP1，又稱產熱素，是第一個被發(fā)現的UCPs，主要在哺乳動物棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)中表達[4]。UCP1和(或)BAT被激活后，棕色脂肪細胞會消耗葡萄糖和脂質，將能量從葡萄糖和游離脂肪酸氧化轉換成熱量[5]。這種獨特的代謝產熱方式，使UCP1和BAT成為肥胖和2型糖尿病治療的研究熱點[6]。

本實驗室的前期研究發(fā)現，UCP1在大鼠心臟組織中表達，并在異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導的心肌重構模型[7]大鼠心臟組織中表達顯著升高；Ucp1基因敲除導致心室壁和心收縮功能在ISO誘導的心肌重構急性期顯著增加，但Ucp1基因敲除對心肌重構的長期影響仍未知。因此，本文旨在通過已建立的Ucp1基因敲除大鼠(Ucp1－/－)分析Ucp1基因敲除后對ISO誘導的心肌重構的長期影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所用Ucp1－/－大鼠由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所制作，同時敲除大鼠培育過程中使用的SD大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2019-0011]，大鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心屏障設施的飼養(yǎng)間[SYXK(蘇)2020-0022]，飼養(yǎng)間溫度(23±2)℃，12 h/12 h明/暗燈照，動物自由飲水和攝食。實驗中所使用的實驗動物為野生型(雌雄各6只)和Ucp1－/－(雌雄各6只)清潔級SD大鼠，8周齡，體重約250 g。實驗中涉及動物操作程序均遵循3R原則并已取得南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查委員會的批準(IACUC-1704011)。

1.2 主要試劑與儀器

ISO(I6504)購自美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)生化檢測試劑(990-63193)購自日本和光純藥工業(yè)株式會社；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CKMB)生化檢測試劑(H007 T)購自中國美康生物科技股份有限公司；小動物超聲(Vevo 2100)購自加拿大VisualSonics公司；全自動血生化分析儀(7100)購自日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ISO誘導心肌重構大鼠模型

選用2月齡野生型(wild type，WT)大鼠和Ucp1－/－大鼠腹腔注射生理鹽水或ISO(30 mg/(kg·d)，連續(xù)3 d)建立大鼠心肌重構模型。大鼠隨機分成4組:WT生理鹽水組、Ucp1－/－生理鹽水組、WTISO組和Ucp1－/－-ISO組(n＝6)。

1.3.2 M型超聲心動圖檢測大鼠心臟的形態(tài)結構和功能

于生理鹽水或ISO注射后1個月，分別對4組大鼠進行M型超聲心動圖檢測。大鼠經1.5%異氟烷氣體麻醉，脫胸前區(qū)被毛，仰臥固定于加熱板上，以保持體溫，四肢固定，選用MS250的探頭，進行心臟超聲影像分析[8]。

1.3.3 大鼠血清中CK-MB和LDH水平的檢測

于生理鹽水或ISO注射后1個月，大鼠經4%異氟烷氣體麻醉，打開腹腔，鈍性分離暴露腹主動脈，從腹主動脈分別采集4組大鼠3 mL外周血，室溫放置1 h后，3000 r/min，4℃離心10 min，獲取血清。利用全自動血生化分析儀測定LDH和CK-MB水平。

1.3.4 病理組織學觀察大鼠的心肌細胞形態(tài)和間質纖維化

于生理鹽水或ISO注射后1個月，二氧化碳法處死大鼠，打開胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林24 h后進行修塊、脫水、包埋、切片、蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin，HE)染色和Masson染色，鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數據以平均數±標準差(±s)表示，數據運用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件處理分析。如果數據符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間比較，若組間差異有統(tǒng)計學意義，進一步采用Tukey’s post-hoc檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ucp1基因敲除加劇了ISO誘導的急性心肌缺血模型大鼠左心室的不利重構

于生理鹽水或ISO注射后1個月，分別對4組大鼠進行M型超聲心動圖檢測。結果顯示，生理鹽水組，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室收縮末期后壁厚度顯著減小了11.63%(P<0.01，圖1A)，左心室內徑呈增大且心收縮功能下降的趨勢。ISO組WT大鼠左心室收縮末期前壁厚度顯著增加了37.07%(P<0.001)，說明WT大鼠仍處于ISO誘導的室壁肥厚代償期；而Ucp1－/－大鼠左心室收縮末期前壁厚度未顯著增加，且與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室收縮末期前壁厚度顯著減小了14.10%(P<0.05，圖1B)，說明Ucp1－/－大鼠已由代償期向失代償期轉換。再者，ISO的誘導導致WT大鼠和Ucp1－/－大鼠左心室射血分數均顯著降低(P<0.01，P<0.001)，且Ucp1－/－大鼠的左心室射血分數顯著低于WT大鼠(P<0.05)，說明Ucp1基因敲除顯著加劇了ISO誘導的心收縮功能減退(圖1C~H)。

圖1 ISO誘導后1個月WT和Ucp1－/－大鼠心臟M型超聲心動圖分析Figure 1 M-mode echocardiography analysis of WT and Ucp1－/－rats at 1 month after ISO administration

2.2 Ucp1基因敲除升高了ISO誘導的急性心肌缺血模型大鼠血清中心肌損傷標志物水平

于生理鹽水或ISO注射后1個月，分別對4組大鼠進行血清LDH和CK-MB水平的檢測。結果顯示，生理鹽水組，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠血清LDH水平顯著升高(P<0.05，圖2A)。ISO組與生理鹽水組相比，WT和Ucp1－/－大鼠血清LDH水平均顯著升高(P<0.05，圖2A)；Ucp1－/－大鼠血清CKMB水平顯著升高(P<0.01，圖2B)。此外，ISO注射后1個月，Ucp1－/－大鼠血清LDH和CK-MB水平均顯著高于WT大鼠(P<0.01，P<0.05，圖2B)。

圖2 ISO誘導后1個月WT和Ucp1－/－大鼠血清中心肌損傷標志物水平檢測Figure 2 Serum marker of myocardial injury analysis of WT and Ucp1－/－rats after ISO administration 1 month

2.3 Ucp1基因敲除加劇了ISO誘導的急性心肌缺血模型大鼠的病理組織學表型

于生理鹽水或ISO注射后1個月，分別對4組大鼠進行心臟病理組織學表型分析。結果顯示，生理鹽水組，WT大鼠和Ucp1－/－大鼠心肌細胞排列和間質纖維化程度無顯著差別。ISO組與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠心肌細胞排列紊亂(圖3A、B)和間質纖維化(圖3C)程度更加嚴重。

圖3 ISO誘導后1個月WT和Ucp1－/－大鼠病理組織學表型分析Figure 3 Histopathological phenotyping analysis of WT and Ucp1－/－rats after ISO administration 1 month

3 討論

在對ISO誘導的大鼠心肌重構模型的長期觀察過程中，本研究發(fā)現，Ucp1基因敲除顯著加劇了ISO誘導的大鼠心臟的病理進程發(fā)展。具體表現為:ISO誘導后1個月，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室室壁厚度顯著變薄、射血分數顯著降低；血清中心肌損傷標志物LDH和CK-MB水平顯著增高；心肌細胞排列紊亂和間質纖維化程度更加嚴重。

UCP1主要在哺乳動物BAT中表達。心肌細胞損傷發(fā)生后，交感神經激活，去甲腎上腺素釋放[9]，合并利尿肽釋放[10]，這些分子均是BAT生長和激活的重要影響因子。ISO是β腎上腺素能受體的一種非選擇性的激動劑，被廣泛地運用于心肌肥厚和心力衰竭的動物模型的構建[11]。ISO誘導的動物模型心臟組織的病理學和形態(tài)改變被認為是最接近臨床上心臟病人的體征的。因此，本研究選用ISO構建大鼠心肌重構模型以及前期建立的Ucp1－/－大鼠來明確Ucp1基因敲除對缺血性心臟疾病的長期影響是具有理論支撐和科學可行性的。

本研究發(fā)現，Ucp1基因敲除后，生理鹽水組，與WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠血清LDH水平顯著升高，說明Ucp1基因敲除在生理狀況下可能對心肌就存在一定的損傷刺激；此外，Ucp1基因敲除后，ISO誘導的大鼠心肌重構長期病理表型亦顯著加劇，上述表型改變可能跟Ucp1基因敲除后BAT功能障礙相關。已有研究證實BAT的生物學功能受Ucp1的調控[12]，Ucp1－/－小鼠BAT激活能力受損[13]。此外，現有研究發(fā)現，BAT及其相關組織還具有調節(jié)多種心血管風險因子的功能。血管周周和心外膜脂肪組織(類似BAT[14])參與動脈粥樣硬化和血壓的調節(jié)[15]。體外穩(wěn)轉Ucp1的H9C2細胞可抵抗缺氧/再氧化的損傷，提高心肌細胞的存活率，保留線粒體正常的結構和功能，減少缺氧后ROS的產生[16]；轉基因過表達Ucp1的小鼠也可抵抗缺血/再灌注的損傷，顯著改善再灌注階段心功能的恢復[17]。現有研究結果和本研究結果從正反兩方面共同驗證了UCP1的心臟保護性作用，但其潛在的分子機制仍需大量的后續(xù)研究證實。

綜上所述，Ucp1基因敲除會加劇ISO誘導的心肌重構的長期病理表型，增加UCP1的表達對缺血性心臟病具有保護作用，這為臨床上防治藥物的研發(fā)提供了理論和實驗依據。