瑤藥多穗柯提取物對(duì)糖尿病大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶8、9的影響作用研究

鄧聿胤，王麗，呂紀(jì)華，劉瑛，覃良，葉銀斯，洪芷琴

(1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院/廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530022；2.柳州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣西壯族自治區(qū) 柳州 545000；3.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 桂林 541004)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由遺傳、環(huán)境等因素聯(lián)合引起的以糖代謝紊亂為重要表現(xiàn)的一種代謝綜合征，其主要表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、體重減少及疲乏無(wú)力等，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)糖尿病酮癥酸中毒，影響患者生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球約有3.47億糖尿病患者，到2030年可能增加到4.39億，我國(guó)2型糖尿病患病率上升至11.2%[1-3]，持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)使糖尿病成為全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，尋找安全有效的降糖藥物是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。多穗柯為殼斗科植物木姜葉柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun.]的干燥葉[4]，主要分布于廣西百色、凌云、河池等地，是廣西傳統(tǒng)壯瑤藥。民間用于治療糖尿病、肺熱咳嗽、咽炎、心腦血管等疾病，具有清熱利尿、滋潤(rùn)肝腎之功效。本文以降血糖功效為切入點(diǎn)，觀察多穗柯水提物對(duì)糖尿病大鼠胰島素(INS)、糖化血紅蛋白(GHbA1c)、基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-8)的影響作用，為多穗柯降糖藥物的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，體重(200±20)g ，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度60%±10%，自由飲食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2016-0006。

1.2 藥物 多穗柯葉，采自廣西巴馬市，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院制劑中心饒偉源主任藥師鑒定為殼斗科植物木姜葉柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun.]后使用。四氧嘧啶(Sigma公司，批號(hào)：BCBR9198V)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批號(hào)：WXBC8740V)；鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團(tuán)，批號(hào)：180617)。

1.3 主要試劑 枸櫞酸鹽緩沖液(博士德生物工程有限公司，批號(hào)：12D10B24)；大鼠胰島素(INS)、糖化血紅蛋白(GHbA1c)、基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為358190226、603190226、420180424、425180424；美迪信血糖試紙(天津億朋醫(yī)療器械股份有限公司，批號(hào)：SSL20Z2D1)。

1.4 主要儀器 TDL-5-A低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Multiskan Go全波長(zhǎng)全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯)；美迪信血糖儀(天津億朋醫(yī)療器械股份有限公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 糖尿病大鼠模型制備[5]選取健康成年SD大鼠80只，雌雄各半，體重(200±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組10只和模型組70只，正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料60.4%+豬油10%+蛋黃粉8%+膽固醇1.5%+蔗糖20%+膽酸鈉0.1%)喂養(yǎng)，共4周。4周后所有大鼠禁食不禁水 12 h，模型組給予腹腔注射STZ 40 mg·kg-1(枸櫞酸鈉緩沖液配制)，正常組給予等體積枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后剪尾采血測(cè)隨機(jī)血糖，如果造模前血糖<8.9 mmol·L-1，造模后血糖≥16.7 mmol·L-1，體重明顯下降者即為造模成功。成模大鼠以正常飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1周，測(cè)定血糖穩(wěn)定后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 多穗柯提取物制備 取多穗柯葉5 kg，切碎加10倍水煎煮2次，第一次1.5 h，第二次1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25(60 ℃)的清膏，得到多穗柯水提物，每克清膏含2.7 g生藥。灌胃時(shí)按照相應(yīng)劑量配制成相應(yīng)藥液使用。

1.5.3 分組給藥 選取糖尿病造模成功血糖穩(wěn)定大鼠50只，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組(Met)、多穗柯水提物(DSK)高、中、低劑量組，每組10只。各組大鼠于分組次日開(kāi)始灌胃給藥，DSK高、中、低劑量組給藥劑量分別為7、3.5、1.75 g生藥/kg，Met組給藥劑量為0.233 g·kg-1，給藥體積10 mL·kg-1，正常組及模型組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)4周。

1.5.4 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后禁食不禁水12 h，各組大鼠測(cè)定體重，水合氯醛腹腔注射麻醉，剪尾采血測(cè)定空腹血糖，腹主動(dòng)脈采血，離心取血清(3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑15 cm)后，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清INS、GHbA1c、MMP-8及MMP-9水平。大鼠取血后處死，取胰腺組織，10%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 多穗柯對(duì)糖尿病大鼠體重和空腹血糖的影響 與正常組比較，模型組大鼠體重顯著降低，空腹血糖顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯中劑量組和二甲雙胍組給藥4周后大鼠體重明顯增加，多穗柯高、中劑量組及二甲雙胍組給藥4周后大鼠空腹血糖明顯降低(P<0.05)，提示多穗柯水提物可以顯著增加糖尿病大鼠的體重，降低糖尿病大鼠的空腹血糖(見(jiàn)圖1～2)。

圖1 各組大鼠體重水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.2 多穗柯對(duì)糖尿病大鼠血清INS、GHbA1c的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清INS水平顯著降低，血清GHbA1c水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯高、中劑量組和二甲雙胍組大鼠血清INS水平顯著升高，血清GHbA1c水平顯著降低(P<0.05)，提示多穗柯水提物可以提高糖尿病大鼠胰島素分泌，調(diào)控糖化血紅蛋白水平(見(jiàn)圖3～4)。

圖2 各組大鼠空腹血糖水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

圖3 各組大鼠血清INS水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.3 多穗柯對(duì)糖尿病大鼠血清MMP-8、MMP-9的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-8、MMP-9水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯高、中、低劑量組和二甲雙胍組大鼠血清MMP-9水平均顯著降低，二甲雙胍組大鼠血清MMP-8水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯各劑量組大鼠血清MMP-8水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示多穗柯水提物可以調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血清MMP-9水平(見(jiàn)圖5～6)。

圖4 各組大鼠血清GHbA1c水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

圖5 各組大鼠血清MMP-8水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

圖6 各組大鼠血清MMP-9水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.4 多穗柯對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織的影響 鏡下顯示：正常組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)正常，胰島為圓形或橢圓形，細(xì)胞輪廓規(guī)則整齊；模型組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，胰島細(xì)胞萎縮，輪廓不規(guī)則，排列紊亂，有脂肪病變；與模型組比較，多穗柯高、中、低劑量組和二甲雙胍組大鼠胰腺組織病理病變明顯減輕(見(jiàn)圖7)。

A.正常組;B.模型組;C.Met(0.233 g·kg-1);D.DSK(7 g·kg-1);E.DSK(3.5 g·kg-1);F.DSK(3.5 g·kg-1)圖7 各組大鼠胰腺組織病理(HE×200)

3 討論

糖尿病是以慢性高血糖為主的內(nèi)分泌代謝疾病，其病理機(jī)制以胰島素抵抗為主，伴胰島素分泌明顯缺陷或胰島素相對(duì)不足從而產(chǎn)生胰島素抵抗障礙[6]。糖尿病的治療目前主要集中在兩個(gè)方向：一是通過(guò)肌注胰島素合成制劑來(lái)降低血糖；二是通過(guò)口服降糖藥物來(lái)降低血糖。臨床應(yīng)用廣泛的口服降糖藥主要是雙胍類和磺脲類，需結(jié)合年齡、病程、肝腎功能狀況等多方面因素指導(dǎo)使用，使用不當(dāng)或長(zhǎng)期服用均會(huì)產(chǎn)生低血糖、胃腸道反應(yīng)等副作用[7-9]。因此，尋找療效確切、副作用小、安全穩(wěn)定的口服降糖藥仍是糖尿病藥物研究的主要方向。

胰島素是由胰島β細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)分泌激素，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體血糖、加速葡萄糖的攝取和利用，是反映胰島素細(xì)胞貯備和分泌功能的重要指標(biāo)。在長(zhǎng)期高脂狀態(tài)下，胰島分泌胰島素代償性增加，使胰島功能逐漸衰竭，從而導(dǎo)致胰島素分泌降低，葡萄糖攝取和利用減少?gòu)亩箼C(jī)體血糖升高。糖化血紅蛋白在機(jī)體中通過(guò)持續(xù)、緩慢且不可逆的糖化反應(yīng)形成，是紅細(xì)胞中血紅蛋白與血清中糖類相結(jié)合的產(chǎn)物，血糖濃度及血糖與血紅蛋白接觸的時(shí)間均能夠影響糖化血紅蛋白的含量，《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)》將“糖化血紅蛋白”首次正式納入糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)中[10-11]。因此，胰島素與糖化血紅蛋白均可作為評(píng)價(jià)降糖藥物作用的重要指標(biāo)。本研究中多穗柯能夠顯著提高糖尿病大鼠胰島素分泌水平，降低血清糖化血紅蛋白含量，改善胰腺組織病變，提示多穗柯能夠提高機(jī)體對(duì)糖尿病的耐受性，改善胰島功能，促進(jìn)胰島素分泌，調(diào)控糖化血紅蛋白水平，具有降糖效應(yīng)。

糖尿病病因還與眾多細(xì)胞因子和酶活性改變有關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類具有類似結(jié)構(gòu)和共同生物化學(xué)性質(zhì)的金屬依賴性蛋白內(nèi)切酶家族。在2型糖尿病中，高血糖引起的糖基化終末產(chǎn)物積累，及高胰島素血癥導(dǎo)致的ROS和氧化應(yīng)激增加[19]，均會(huì)顯著促進(jìn)MMPs 的高表達(dá)和酶活性增強(qiáng)。MMP-9主要是由中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生的酶，MMP-8是一種多形核細(xì)胞的間質(zhì)膠原酶，研究顯示[12-13]，2型糖尿病患者血清中MMP-9、MMP-8水平均顯著升高，在一定程度上反映了糖尿病早期血管病變，對(duì)評(píng)估、發(fā)現(xiàn)早期糖尿病及糖尿病并發(fā)癥意義重大。本研究中糖尿病模型大鼠血清MMP-8、MMP-9水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。多穗柯能夠顯著降低糖尿病大鼠血清MMP-9水平，提示多穗柯也許能夠通過(guò)調(diào)控MMP-9水平干預(yù)糖尿病大鼠早期血管病變。

綜上所述，本研究對(duì)瑤藥多穗柯降糖作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，明確了瑤藥多穗柯具有降糖作用，其機(jī)制可能與改善胰島功能，促進(jìn)胰島素分泌，調(diào)控糖化血紅蛋白與MMP-9水平，提高機(jī)體對(duì)糖尿病的耐受性有關(guān)，為多穗柯的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但本文僅開(kāi)展了多穗柯降糖藥效作用研究，其化學(xué)成分及作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。