離子色譜法測定母乳和牛乳中的N-乙酰神經(jīng)氨酸

劉 爽，陳 磊，Philip Haselberger，田 芳，蔡小堃，毛穎異，王 津，趙艷榮*，王 碩*

（1 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室 天津300350 2 雅培營養(yǎng)中國研發(fā)中心 上海200233 3 雅培營養(yǎng)品 美國哥倫布OH43219）

唾液酸（sialic acid，SA）是一類九碳糖的?；苌?，骨架由一分子丙酮酸和一分子甘露糖胺組成，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)60 多種唾液酸結(jié)構(gòu)[1]。唾液酸大量存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是大腦中神經(jīng)節(jié)苷脂和多聚唾液酸鏈的重要成分，參與修飾神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，在細(xì)胞間交流、神經(jīng)元分支、修飾突觸連接和記憶形成方面發(fā)揮重要作用[2]。動物試驗表明，膳食中添加唾液酸，可增加大腦額葉皮質(zhì)中唾液酸的含量，提高與學(xué)習(xí)相關(guān)的兩個基因的表達(dá)，此外，唾液酸還參與抑制病原體在腸道上皮細(xì)胞上的黏附，其機制是作為腸道中的誘餌受體與細(xì)菌和病毒結(jié)合，阻止病原體在腸道中的附著[3-4]。

N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acids，Neu5Ac）是唾液酸家族中最主要的物質(zhì)之一，在母乳中也僅檢測到Neu5Ac 結(jié)構(gòu)的唾液酸[5-6]。Neu5Ac 廣泛存在于母乳及動物乳汁中，主要以結(jié)合態(tài)存在。母乳中的大部分Neu5Ac 結(jié)合到低聚糖（73%）和糖蛋白上（24%），少部分與糖脂結(jié)合或以游離態(tài)存在（3%）。牛乳中Neu5Ac 的分布鮮有研究報道。而以牛乳為基質(zhì)的嬰幼兒配方粉中，低聚糖和糖蛋白結(jié)合態(tài)的比例分別為28%和70%，僅2%與糖脂結(jié)合或以游離態(tài)存在[7]。準(zhǔn)確測定不同泌乳階段的母乳中Neu5Ac 含量，有助于進(jìn)一步研究其在嬰幼兒體內(nèi)發(fā)揮的生理作用以及嬰幼兒Neu5Ac 適宜攝入量的標(biāo)準(zhǔn)。通過對比兩種乳汁中Neu5Ac 含量差距，為其在嬰幼兒配方粉中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

目前，測定乳汁中Neu5Ac 的方法主要有：分光光度法（spectrophotometric method）[8-9]、液相色譜法（liquid chromatography,LC）[6，10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[11-12]和離子色譜法（ion chromatography,IC）[13-14]。傳統(tǒng)的分光光度法靈敏度較低，無法區(qū)分不同結(jié)構(gòu)的唾液酸，近年來應(yīng)用很少。采用液相色譜法測定Neu5Ac 時，因Neu5Ac自身不存在發(fā)光基團(tuán)，故需對其衍生處理。衍生增加了檢測的特異性和信號強度，也增加了樣品處理的復(fù)雜性和潛在的干擾因素。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法較液相色譜法的效果好，樣品無需衍生，然而操作更為繁瑣，對檢測儀器及檢測人員的專業(yè)性要求高。以上方法均不適用于母乳中高含量Neu5Ac 的測定。離子色譜法常用于碳水化合物的分離，樣品無需衍生且檢測靈敏度高，是檢測母乳及牛乳樣品中Neu5Ac 含量的較好選擇。然而，目前應(yīng)用離子色譜法檢測Neu5Ac 的研究主要集中在乳粉基質(zhì)中Neu5Ac 含量的測定[13]，尚未建立測定母乳基質(zhì)中Neu5Ac 含量的方法，而且因母乳與乳粉中Neu5Ac 含量的差異，測定乳粉基質(zhì)中Neu5Ac 方法的洗脫條件和分析范圍并不完全適用于母乳。

為了準(zhǔn)確檢測不同泌乳階段母乳中總Neu5Ac 的含量，本研究建立高效陰離子交換色譜偶聯(lián)脈沖安培檢測器法（high-performance anionexchange chromatography -pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD），優(yōu)化洗脫條件和分析范圍，并對方法的檢出及定量限、回收率、精密度及應(yīng)用范圍進(jìn)行驗證。同時，應(yīng)用此法測定不同泌乳階段的母乳及常見市售牛乳中總Neu5Ac 含量。用本實驗室建立的方法[15]測定母乳及牛乳中游離態(tài)Neu5Ac 的含量。

1 材料與方法

1.1 樣品

脫脂乳粉（34%蛋白，52%乳糖），供應(yīng)商提供；母乳樣品：0～5 d 初乳、10～15 d 過渡乳、40～45 d 成熟乳、230～240 d 成熟乳和365～375 d 成熟乳各3例，所有母乳樣品均來自于單胎足月分娩的健康產(chǎn)婦，分娩于天津市南開醫(yī)院；5 種牛乳樣品均為市售產(chǎn)品，基本信息見表1。

表1 牛乳樣品營養(yǎng)成分表（100 mL）Table 1 Nutrition information of cow's milk production（100 mL）

1.2 試劑與儀器

氫氧化鈉溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%）、乙酸鈉和硫酸，分析純，購于美國Sigma-Aldrich 公司；N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，分子式C11H18NO9，分子質(zhì)量309.27，純度≥98%，購于加拿大Toronto Research Chemicals 公司。

Dionex ICS-5000 離子色譜儀（配有四元梯度泵、脈沖安培檢測器和Chromeleon 6.8 色譜工作站），美國Thermo Fisher 公司；Milli-Q Advantage A10 超純水儀，美國Millipore 公司；Thermo REL5004V 冰箱、CarboPacTMPA1 離子色譜柱（4 mm×250 mm）、CarboPacTMPA1 保護(hù)柱（4 mm×50 mm），美國Thermo Fisher 公司；移液器（1 mL），德國Eppendorf 公司；尼龍濾膜（0.2 μm），英國Whatman 公司；Microman CP250 毛細(xì)吸管和活塞，美國Gilson 公司；離子色譜進(jìn)樣小瓶和聚丙烯瓶蓋，美國Agilent 公司。

1.3 離子色譜測定條件

離子色譜柱CarboPacTMPA1（4 mm×250 mm），保護(hù)柱CarboPacTM PA1（4 mm×50 mm）；柱溫25 ℃；檢測器溫度25 ℃；流量1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；淋洗液為水、500 mmol/L 氫氧化鈉溶液和300 mmol/L 乙酸鈉溶液，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Program of gradient elution

1.4 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確量取100 μL 母乳/牛乳樣品于塑料離心管中，加入900 μL 100 mmol/L 硫酸，渦旋混勻后放入烘箱中，80 ℃酸解1 h。酸解后加入超純水定容至10 mL，待靜置至室溫后用0.2 μm 尼龍濾膜過濾后即可進(jìn)樣分析。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，不同泌乳階段的母乳中Neu5Ac 的含量使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation,SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

如表3所示，通過標(biāo)準(zhǔn)系列工作液做線性，Neu5Ac 在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，線性范圍以母乳樣品計算。

表3 Neu5Ac 的線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 The linear range and standard curve of Neu5Ac

2.2 檢出限及定量限

方法定量限的計算是根據(jù)在基質(zhì)溶液中加標(biāo)給定低質(zhì)量濃度，檢出限為加標(biāo)給定低質(zhì)量濃度時，Neu5Ac 色譜峰信噪比為3 時對應(yīng)的濃度，因母乳中含有高含量的Neu5Ac，不適用于檢出及定量限的評估，因此選用乳粉作為基質(zhì)（乳粉與超純水按比例為1.5∶10 沖配）驗證方法的檢出及定量限。在基質(zhì)中加標(biāo)Neu5Ac 20.7 mg/L 后，回收率在96.1%～99.8%之間，3 次測定的RSD 為1.9%（表5），因此，加標(biāo)量20.7 mg/L 可以作為方法的定量限，3 倍信噪比計算方法檢出限為4.3 mg/L（表4）。

表4 檢出限的驗證Table 4 Validation results of LOD

表5 定量限的驗證Table 5 Validation results of LOQ

2.3 精密度與回收率

精密度的評估通過測定成熟母乳中Neu5Ac的含量，6 次重復(fù)測定的質(zhì)量濃度分別為：415，439，409，405，400，412 mg/L，平均質(zhì)量濃度406 mg/L，RSD 為1.9%。方法回收率的計算是通過加標(biāo)母乳基質(zhì)中Neu5Ac 的濃度的50%和100%，每個濃度的加標(biāo)量重復(fù)測量3 次，RSD 低于6.5%，回收率在86.1%～99.3%之間，平均回收率為92.7%（表6）。

表6 回收率的驗證Table 6 Validation results of recovery

2.4 母乳及牛乳中的應(yīng)用

應(yīng)用此方法與已發(fā)表的方法[15]測定了母乳（表7）及牛乳（表8）中總Neu5Ac 及游離態(tài)的含量。產(chǎn)后1年內(nèi)，母乳中總Neu5Ac 的含量范圍在187.1～1 334.7 mg/L，游離態(tài)Neu5Ac 的含量范圍在4.6～12.7 mg/L，游離態(tài)及總Neu5Ac 的含量均沿哺乳期呈下降趨勢，游離態(tài)Neu5Ac 占總Neu5Ac的比例在1.05%～2.5%。5 種市售牛乳中總Neu5Ac的含量范圍在177.6～228.9 mg/L，游離態(tài)Neu5Ac的含量范圍在15.9～21.9 mg/L，游離態(tài)Neu5Ac 的比例在8.5%～11.2%。母乳及牛乳中總Neu5Ac 的含量均高于方法的定量限并處于方法的分析范圍內(nèi)。

表7 不同階段母乳中游離態(tài)及總Neu5Ac 的含量（mg/L）Table 7 The concentration of free and total Neu5Ac in human milk over 1 year（mg/L）

表8 市售牛乳中游離態(tài)及總Neu5Ac 的含量（mg/L）Table 8 The concentration of free and total Neu5Ac in commercially available cow milk（mg/L）

含量對比發(fā)現(xiàn)，泌乳前期的母乳中總Neu5Ac的含量遠(yuǎn)高于牛乳，母乳中總Neu5Ac 的水平沿哺乳期下降，365～376 d 母乳中總Neu5Ac 的含量與牛乳接近。牛乳中游離態(tài)Neu5Ac 的含量和比例均高于母乳，牛乳中游離態(tài)Neu5Ac 的比例在8.5%～11.2%，在母乳中僅為1.0%～2.5%。

3 討論

本研究建立并驗證了離子色譜法測定母乳及牛乳中總Neu5Ac，方法的樣品預(yù)處理操作簡單，使用酸解法釋放乳汁中的Neu5Ac，無需衍生及后續(xù)純化操作，稀釋過濾后進(jìn)樣。淋洗液選擇氫氧化鈉和洗脫能力較強的乙酸鈉，采用梯度洗脫方式分離Neu5Ac。方法具有較寬的分析范圍（20.7～4 000 mg/L），且線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。方法較靈敏，母乳樣品中的檢出及定量限分別為4.3 mg/L 和20.7 mg/L，可滿足不同泌乳階段的母乳及牛乳樣品中總Neu5Ac 含量的檢測。準(zhǔn)確性和精密度良好，母乳中Neu5Ac 在不同濃度水平的加標(biāo)回收率均在90%～110%之間，加標(biāo)回收含量的RSD 低于6.5%，重復(fù)測量含量的RSD 低于1.9%。通過測定不同階段的母乳及市售牛乳中總Neu5Ac 的含量，考察了方法的適用范圍，結(jié)果表明，方法的定量限及分析范圍可用于不同乳汁中總Neu5Ac 的檢測。

本研究測定的母乳中總Neu5Ac 的含量范圍在187.1～1 334.7 mg/L，其中0～5 d 母乳中含量最高（1 334.7 mg/L±171.2 mg/L），365～375 d 母乳中最低（187.1 mg/L±72.1 mg/L）。本研究測定的不同階段母乳中總Neu5Ac 的含量與文獻(xiàn)報道中初乳（1 240 mg/kg ± 229 mg/kg）、過渡乳（881 mg/kg ±273 mg/kg）及成熟乳（505 mg/kg ± 251 mg/kg）中的數(shù)據(jù)接近[16]。對比不同檢測方法，本研究使用離子色譜法測定的初乳中總Neu5Ac 含量與金宇婷等[9]通過分光光度法，Claumarchirant 等[17]使用高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）測定的范圍一致。本研究測定的牛乳中總Neu5Ac 的含量范圍在177.6～228.9 mg/L，平均含量為（195.7±19.7）mg/L，與使用HPLC-FLD 法測定的牛乳中總Neu5Ac 的含量（186～218 mg/kg）接近[18]，其略微的差異可能來源于牛的品種、牛乳的階段及加工工藝的不同。

Neu5Ac 作為重要的營養(yǎng)元素參與嬰幼兒大腦及認(rèn)知的發(fā)育，母乳中富含大量的Neu5Ac，可滿足嬰幼兒生命早期快速的生長發(fā)育，特別是大腦的發(fā)育，對營養(yǎng)及其前體物質(zhì)提出了極高的需求[2]。初步測定的結(jié)果表明，牛乳中總Neu5Ac 含量遠(yuǎn)低于早期母乳，接近365～375 d 母乳中Neu5Ac 的含量。嬰幼兒配方粉通常以牛乳為基質(zhì)，由于一些原因不能采用母乳喂養(yǎng)的乳母，通常選擇乳粉喂養(yǎng)嬰幼兒，但牛乳中總Neu5Ac 水平低于母乳，導(dǎo)致嬰幼兒配方粉中總Neu5Ac 的含量較低，為了進(jìn)一步貼近母乳喂養(yǎng)效果，需在嬰幼兒配方粉中添加Neu5Ac 以確保嬰幼兒生命早期大腦快速發(fā)育階段的適齡生長。Neu5Ac 在嬰幼兒配方粉中添加的前提是明確其在母乳中的含量，而近年來國內(nèi)還未開展大樣本量的母乳中總Neu5Ac 含量的研究，但本研究為大樣本量測定母乳中總Neu5Ac 提供了一種準(zhǔn)確快速的方法。

本研究建立的方法未來還可進(jìn)一步優(yōu)化以測定母乳中不同結(jié)合態(tài)（低聚糖、糖蛋白和糖脂結(jié)合態(tài)）的含量及比例，深入分析母乳中Neu5Ac 的分布。初步測定結(jié)果表明，母乳中游離態(tài)Neu5Ac 僅占總含量的1.0%～2.5%，97.5%～99.0%的Neu5Ac以結(jié)合態(tài)存在，不同結(jié)合態(tài)可能導(dǎo)致Neu5Ac 吸收及利用率的差異，進(jìn)而影響其在嬰幼兒體內(nèi)發(fā)揮的生理作用。當(dāng)前已有的母乳中不同結(jié)合態(tài)Neu5Ac 分布的研究多集中在2000—2010年期間，近年來及國內(nèi)母乳中Neu5Ac 的分布還未見報道，方法可進(jìn)一步優(yōu)化樣品前處理過程及分析范圍用于母乳中不同結(jié)合態(tài)Neu5Ac 含量的測定。

4 結(jié)論

首次建立了離子色譜法測定母乳基質(zhì)中總Neu5Ac，方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，較低的檢出及定量限，較寬的分析范圍，可用于準(zhǔn)確高效地測定不同泌乳階段母乳中總Neu5Ac 的含量。初步測定結(jié)果表明，母乳中總Neu5Ac 的含量沿泌乳期呈下降趨勢，泌乳早期母乳中總Neu5Ac含量遠(yuǎn)高于牛乳，產(chǎn)后1年母乳中總Neu5Ac 含量接近牛乳，母乳中游離態(tài)Neu5Ac 的比例僅占1.0%～2.5%，未來需要更多的研究探明母乳中總Neu5Ac 的含量及不同結(jié)合態(tài)Neu5Ac 的分布。