雙酚A和鄰苯二甲酸二丁酯暴露對雌性幼鼠青春期發(fā)育的影響*

羅小娟，曹 科△，葉炳均，陶明俊，陳小文，張 琴，陳運生

廣東省深圳市兒童醫(yī)院:1.檢驗科;2.兒科研究所;3.內(nèi)分泌科,廣東深圳 518038

近年來，女童性早熟發(fā)病率呈明顯上升趨勢，從人體血液、尿液等標(biāo)本中檢出的雙酚A(BPA)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDCs)對女童青春期發(fā)育和內(nèi)分泌的干擾作用，以及對生殖系統(tǒng)的毒性機(jī)制，引起公眾和學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。目前，研究認(rèn)為EEDCs可通過受體和非受體介導(dǎo)途徑模擬或拮抗內(nèi)源性激素，并可干擾內(nèi)源性激素的生物合成、分泌、轉(zhuǎn)運、結(jié)合、反應(yīng)和代謝等過程，從而對生物個體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等的功能產(chǎn)生影響，引起可逆或不可逆的生物學(xué)效應(yīng)。BPA和DBP在人類生活環(huán)境中廣泛存在，是具有一定代表性的EEDCs。本研究以處于青春期啟動前關(guān)鍵時期的雌性幼鼠(生后第21天) 作為研究對象，通過灌胃的給藥方式制備動物研究模型，探討B(tài)PA和DBP是否可導(dǎo)致雌性幼鼠青春期啟動提前，其機(jī)制是否與下丘腦-垂體-性腺軸和Kisspeptin-KISS-1/G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)-促性腺激素釋放激素(GnRH)信號系統(tǒng)相關(guān)，以明確BPA和DBP對雌性幼鼠青春期發(fā)育的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料來源 經(jīng)檢疫合格的1日齡清潔級SD雌性幼鼠14窩(共153只)，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(實驗動物質(zhì)量合格證明編號：440072000 25061)，在無特定病原體(SPF)級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度、濕度等條件保持穩(wěn)定，自由進(jìn)食飲水，整個實驗過程均用不含大豆異黃酮等植物雌激素的飼料喂養(yǎng)，飼料配方為玉米淀粉32.0%，蔗糖30.0%，酪蛋白23.0%，纖維素5.0%，玉米油5.0%，93G混合礦物質(zhì)3.5%，93G混合維生素1.0%，蛋氨酸0.3%，氯化膽堿0.2%，飼料質(zhì)量合格證編號：No.44200300007449。幼鼠于21日齡稱取體質(zhì)量，留取64只，用隨機(jī)數(shù)字表法分成8組，分別為BPA干預(yù)組、DBP干預(yù)組、BPA+DBP干預(yù)組、雌二醇(E2)組、BPA空白對照組、DBP空白對照組、正常對照組、溶劑組，每組8只，各組采用不同的處理方法。

1.2儀器與試劑 BPA、DBP(分析純99%)購于美國Sigma公司；玉米油(溶劑)購于益海嘉里投資有限公司；血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、E2和Kisspeptin酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于上海心語生物科技有限公司；酶標(biāo)分析儀購于深圳市匯松科技發(fā)展有限公司；總RNA提取試劑盒購于廣州洪祥生物醫(yī)藥科技有限公司；合成cDNA和PCR反應(yīng)試劑盒購于日本Takara公司；ABI 7900HT 熒光定量PCR儀購于美國賽默飛世爾公司；KISS-1、GPR54、雌激素受體(ER)α、ERβ引物由美國Invitrogen公司合成；其他生化試劑及耗材等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3方法

1.3.1各組干預(yù)方法 (1)BPA干預(yù)組：BPA溶液每天灌胃1次,劑量為0.25 mg/kg，連續(xù)干預(yù)10 d，于幼鼠陰道開口當(dāng)天處死；(2)DBP干預(yù)組：DBP溶液每天灌胃1次，劑量為50 mg/kg，連續(xù)干預(yù)10 d，于幼鼠陰道開口當(dāng)天處死；(3)BPA+DBP干預(yù)組：0.20 mg/kg BPA溶液+40 mg/kg DBP溶液每天灌胃1次，連續(xù)干預(yù)10 d，于幼鼠陰道開口當(dāng)天處死；(4)E2組：E2溶液每天灌胃1次，劑量為0.1 mg/kg，連續(xù)干預(yù)10 d，以其作為陽性對照，于幼鼠陰道開口當(dāng)天處死；(5)BPA空白對照組：每天給予10 mL/kg的不含BPA的玉米油溶液灌胃1次，處死BPA干預(yù)組時等比例處死；(6)DBP空白對照組：每天給予10 mL/kg的不含DBP的玉米油溶液灌胃1次，處死DBP干預(yù)組時等比例處死；(7)正常對照組：只觀察不干預(yù)，于幼鼠陰道開口當(dāng)天處死；(8)溶劑組：因為除正常對照組外，其余各組均以玉米油為溶劑，為排除玉米油對雌性幼鼠發(fā)育的影響，本研究特設(shè)溶劑組，每天給予10 mL/kg玉米油溶液連續(xù)灌胃10 d，于幼鼠陰道開口當(dāng)天處死。采用被毛染色法，在幼鼠體表不同部位的被毛涂染斑點，根據(jù)染色情況和籠具雙重編號標(biāo)記識別。每天稱取幼鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥物劑量。觀察并記錄幼鼠陰道開口時間(VOD)，處死時采用心臟穿刺采血，離心留取血清，留取卵巢、下丘腦組織置于-70 ℃以下冰箱保存。同時取部分子宮和卵巢組織置于4%多聚甲醛溶液中保存，用于組織形態(tài)觀察。

1.3.2檢測方法 采用ELISA檢測FSH、LH、E2和Kisspeptin水平，按照試劑盒說明書步驟操作。取卵巢和子宮垂直橫斷面，常規(guī)石蠟包埋，切片，染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組幼鼠卵巢和子宮組織形態(tài)。提取下丘腦和卵巢組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBRGreen Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明書，檢測下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA，卵巢ERα、ERβ mRNA和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)情況。相關(guān)引物序列見表1。

2 結(jié) 果

2.1各組基本資料比較 與正常對照組和溶劑組相比，BPA干預(yù)組和E2組VOD提前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組第1次給藥前體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BPA干預(yù)組、BPA空白對照組和E2組處死時體質(zhì)量低于其余各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但BPA干預(yù)組和BPA空白對照組處死時體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。溶劑組與正常對照組VOD、處死時體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 引物序列

表2 各組基本資料比較

2.2各組血清性激素水平比較 BPA干預(yù)組血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平明顯高于BPA空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且BPA干預(yù)組LH/FSH>1，提示性發(fā)育已啟動。BPA干預(yù)組血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平與正常對照組和溶劑組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。E2組血清LH、FSH和Kisspeptin水平明顯低于正常對照組和溶劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。溶劑組與正常對照組血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清性激素水平比較

2.3子宮、卵巢組織病理學(xué)檢查結(jié)果 BPA空白對照組幼鼠卵巢皮質(zhì)可見各級卵泡，以原始卵泡及生長卵泡居多，未見黃體；子宮體積較小，黏膜上皮排列整齊，可見少量腺體，見圖1～2。BPA干預(yù)組幼鼠卵巢皮質(zhì)可見大量生長卵泡，少量閉鎖卵泡、成熟卵泡及黃體；子宮體積增大，子宮壁增厚，腺體增多，幼鼠性發(fā)育提前，見圖3～4。溶劑組和正常對照組幼鼠子宮內(nèi)膜及腺體、卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)量和形態(tài)大致正常，見圖5～6。與溶劑組和正常對照組相比，E2組幼鼠在出現(xiàn)陰道開口時，子宮內(nèi)膜厚度和腺體發(fā)育成熟度，以及卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量和黃體發(fā)育程度明顯降低，見圖7～8。BPA干預(yù)組、DBP干預(yù)組、BPA+DBP干預(yù)組幼鼠子宮內(nèi)膜及腺體、卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)量和形態(tài)均未見明顯病理學(xué)改變。

圖1 BPA空白對照組幼鼠卵巢組織HE染色圖片(×40)

圖2 BPA空白對照組幼鼠子宮組織HE染色圖片(×100)

圖3 BPA干預(yù)組幼鼠卵巢組織HE染色圖片(×40)

圖4 BPA干預(yù)組幼鼠子宮組織HE染色圖片(×100)

圖5 溶劑組幼鼠卵巢組織HE染色圖片(×40)

圖6 溶劑組幼鼠子宮組織HE染色圖片(×100)

圖7 E2組幼鼠卵巢組織HE染色圖片(×40)

圖8 E2組幼鼠子宮組織HE染色圖片(×100)

2.4各組下丘腦KISS-1、GPR54和卵巢ERα和 ERβ mRNA表達(dá)水平比較 BPA干預(yù)組下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達(dá)水平明顯高于BPA空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BPA干預(yù)組下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達(dá)水平與正常對照組和溶劑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。E2組下丘腦KISS-1和卵巢ERβ mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對照組和溶劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組下丘腦KISS-1、GPR54和卵巢ERα、ERβ mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

個體青春期發(fā)育和性啟動過程受遺傳基因、營養(yǎng)代謝和生活環(huán)境等多因素調(diào)控[1-2]，近年來，生存環(huán)境中廣泛存在的痕量持久性有機(jī)物和EEDCs備受關(guān)注[3-4]，其中，BPA和DBP是世界上產(chǎn)量位于前列的有機(jī)化工原料，廣泛存在于人類生活環(huán)境和日常用品中，具有類雌激素樣干擾作用和內(nèi)分泌生殖毒性，且存在低劑量效應(yīng)和聯(lián)合作用[5-8]。以文獻(xiàn)[9-11]為主要參考依據(jù)，本研究分別選擇BPA 0.25 mg/kg，DBP 50 mg/kg，BPA 0.20 mg/kg+DBP 40 mg/kg為干預(yù)劑量，上述劑量為在人群日常暴露范圍內(nèi)，生殖毒性實驗研究中較低的劑量。美國以每日接觸量≤0.05 mg/kg作為人類BPA暴露的“安全劑量”，按照等效藥物劑量換算，實驗鼠藥物劑量約為人類的5倍，即0.25 mg/kg[12]。本研究結(jié)果顯示，0.25 mg/kg BPA可致處于青春期啟動前關(guān)鍵時期的雌性幼鼠VOD提前，導(dǎo)致雌性幼鼠性早熟，與WANG等[13]的研究結(jié)果一致，值得引起重視。但是目前BPA引起性早熟的有效劑量范圍和劑量效應(yīng)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。DBP 50 mg/kg、聯(lián)合干預(yù)(BPA 0.20 mg/kg+DBP 40 mg/kg)均未引起VOD提前，可能與其劑量有關(guān)，且二者聯(lián)合在生物體內(nèi)存在相互拮抗而非協(xié)同作用。研究報道，EEDCs存在“U”效應(yīng)現(xiàn)象，即在一定的劑量范圍內(nèi)，劑量-效應(yīng)曲線的斜率發(fā)生正負(fù)轉(zhuǎn)換[14-15]。不同組合的EEDCs，其聯(lián)合效應(yīng)也可隨劑量改變發(fā)生協(xié)同或拮抗雙向改變。

青春期性發(fā)育由下丘腦-垂體-性腺軸的啟動激活引起，由基因KISS-1編碼的神經(jīng)遞質(zhì)Kisspeptin是下丘腦GnRH最重要的調(diào)控因子，Kisspeptin與內(nèi)源性受體蛋白GPR54結(jié)合后能刺激GnRH的釋放，并且其促性腺激素效應(yīng)的基本位點是在下丘腦GnRH神經(jīng)元內(nèi)，且該效應(yīng)是唯一通過GPR54介導(dǎo)表達(dá)實現(xiàn)的[16]。下丘腦Kisspeptin-KISS-1/GPR54-GnRH信號系統(tǒng)的激活，ER表達(dá)增加并反饋調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元，性激素LH、FSH水平隨之升高，進(jìn)而作用于性腺靶器官，啟動青春期發(fā)育。陰道開口是雌性幼鼠性發(fā)育啟動的外在標(biāo)志，是判斷青春期發(fā)育啟動的重要標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，0.25 mg/kg BPA可引起雌性幼鼠VOD提前，BPA干預(yù)組血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平，下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達(dá)水平明顯高于BPA空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，BPA的毒性機(jī)制可能涉及下丘腦Kisspeptin-KISS-1/GPR54-GnRH信號傳導(dǎo)和下丘腦-垂體-性腺軸提前激活，中樞性關(guān)鍵基因KISS-1和蛋白Kisspeptin提前表達(dá)，導(dǎo)致青春期發(fā)育啟動和性發(fā)育提前(性早熟)。但BPA干預(yù)組下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達(dá)水平，血清Kisspeptin、性激素水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示BPA干預(yù)并未破壞雌性幼鼠青春期發(fā)育啟動的中樞性關(guān)鍵環(huán)節(jié)Kisspeptin-KISS-1/GPR54信號系統(tǒng)，其下丘腦-垂體-性腺軸啟動過程和效應(yīng)并未發(fā)生明顯改變，推測BPA暴露引起VOD提前并不是直接通過改變KISS-1基因表達(dá)來實現(xiàn)[17]，可能與其上游調(diào)控因子或GnRH相關(guān)抑制因素破壞相關(guān)，提示青春期啟動涉及興奮和抑制雙向有序調(diào)節(jié)的多基因功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步實驗驗證。

本研究將E2暴露作為雌性幼鼠VOD提前和卵巢發(fā)育異常的陽性對照[17]。結(jié)果顯示，E2組VOD提前，但與BPA干預(yù)組不同的是，E2組雌性幼鼠在出現(xiàn)陰道開口時，其下丘腦KISS-1和卵巢ERβ mRNA表達(dá)水平，血清LH、FSH和Kisspeptin水平，子宮內(nèi)膜厚度和腺體發(fā)育成熟度，以及卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量和黃體發(fā)育程度均明顯低于正常對照組和溶劑組。以上結(jié)果表明高水平的E2暴露可對處于青春期啟動前關(guān)鍵時期的雌性幼鼠下丘腦、子宮、卵巢發(fā)育造成嚴(yán)重影響，推測其可能機(jī)制與E2暴露導(dǎo)致雌性幼鼠下丘腦KISS-1基因神經(jīng)元應(yīng)對性激素正反饋通路破壞有關(guān)；也可能是通過性腺、類固醇代謝、轉(zhuǎn)運蛋白或受體途徑干擾內(nèi)源性類固醇生成，高水平E2通過負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制抑制下丘腦GnRH分泌，甚至破壞GnRH脈沖發(fā)生器的正常功能，從而使LH和FSH的正常分泌受到影響，干擾和破壞下丘腦-垂體-性腺軸的正常功能。溶劑組VOD、第1次給藥前體質(zhì)量、處死時體質(zhì)量、性激素水平，下丘腦KISS-1、GPR54和卵巢ERα、 ERβ mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可基本排除溶劑本身對幼鼠青春期發(fā)育和性腺器官的影響。

綜上所述，BPA暴露可致雌性幼鼠性早熟，其致病機(jī)制可能與下丘腦Kisspeptin-KISS-1/GPR54-GnRH信號傳導(dǎo)和下丘腦-垂體-性腺軸提前激活有關(guān)，但尚需進(jìn)一步對劑量效應(yīng)關(guān)系，以及其確切的分子生物學(xué)和表觀遺傳學(xué)致病機(jī)制進(jìn)行深入探討，以避免EEDCs對女童性早熟等生長發(fā)育的干擾和生殖毒性危害。