基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討苦參治療骨癌痛的分子機(jī)制

龍慎豪 張 煒 劉亞麗 胡 衛(wèi)

(1. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌 443002； 2. 宜昌市中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤科， 湖北 宜昌 443002)

骨癌痛是一種嚴(yán)重的癌癥并發(fā)癥，常出現(xiàn)在原發(fā)性骨腫瘤，或源于乳腺癌和前列腺癌等的繼發(fā)骨轉(zhuǎn)移。研究表明，約有1/3的骨轉(zhuǎn)移患者存在過(guò)骨癌痛，骨癌痛也被認(rèn)為是最難治療的疼痛癥狀之一，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1,2]。到目前為止，骨癌痛的治療效果仍不理想，如何有效控制骨癌痛已然成為亟需解決的臨床問(wèn)題。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)控制骨癌痛的方法主要集中在抗腫瘤方面，輔助以三階梯止痛療法。但這種方案對(duì)中晚期癌癥患者的疼痛癥狀改善不明顯，且存在著嚴(yán)重的副作用，比如惡心、便秘、頭昏、呼吸抑制、嗜睡以及阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥引起的耐藥性和成癮性等[3,4]。中醫(yī)藥在治療骨癌痛方面與西醫(yī)藥有著獨(dú)特區(qū)別，一方面中藥療效持久且副作用小，另一方面中藥還能改善患者精神狀態(tài)，提高患者生存質(zhì)量[5]。中藥苦參是豆科槐屬植物苦參(sophoraflavescens)的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國(guó)歷史悠久的傳統(tǒng)中藥之一?？鄥⒃谥兴幹邪垂πХ诸?lèi)屬于清熱藥中的清熱燥濕藥，功效清熱燥濕、殺蟲(chóng)、利尿等。常用于治療熱痢、黃疸、尿閉、濕疹、濕瘡、疼痛等疾病。對(duì)苦參的現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，苦參具有抗免疫抑制、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[6]。研究表明，復(fù)方苦參注射液對(duì)骨癌痛療效確切，并能明顯緩解疼痛，提高患者的生活及生存質(zhì)量[7]。然而，關(guān)于復(fù)方苦參注射液的主要組成成分——苦參治療骨癌痛研究仍較少。因此，在本研究中，我們將運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)苦參治療骨癌痛的潛在藥理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 苦參的活性成分收集與篩選

以“苦參”或“kushen”為關(guān)鍵詞，分別檢索中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP， http://tcmspw.com/tcmsp.php)和中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。剔除重復(fù)結(jié)果后，初步獲取苦參成分。研究證明，當(dāng)化合物分子的口服生物利用度 (oral bioavailability，OB) ≥30%，類(lèi)藥性 (drug likeness, DL) ≥0.18時(shí)能很好地被人體吸收，也具有更好的藥理特性[8,9]。因此，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的藥代動(dòng)力學(xué)工具，以O(shè)B≥30%同時(shí)DL≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到待研究的活性化合物。

1.2 活性成分的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以上述每個(gè)活性化合物的名稱(chēng)作為關(guān)鍵詞，逐一對(duì)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)檢索服務(wù)系統(tǒng)PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，將每一個(gè)活性成分分子的3D結(jié)構(gòu)以結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件 (Structure Data File, SDF)格式保存。然后，將所有活性分子的SDF文件上傳到Swiss (http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù)[10]，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，只保留可能性大于0的靶點(diǎn)，作為活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)集。

1.3 骨癌痛的已知治療靶點(diǎn)

骨癌痛的已知治療靶點(diǎn)，通過(guò)檢索關(guān)鍵詞“cancer induced bone pain”、“bone cancer pain”和“cancer pain”，從治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database，TTD， http://db.idrblab.net/ttd/)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中獲得[11]。同樣，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，并剔除重復(fù)項(xiàng)后作為疾病已知治療靶點(diǎn)集。最后，將上述預(yù)測(cè)靶點(diǎn)集合疾病已知治療靶點(diǎn)集導(dǎo)入唯一蛋白靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(unique protein, UniProt, https://www.uniprot.org/)中進(jìn)行命名標(biāo)準(zhǔn)化，再取這兩個(gè)靶點(diǎn)集的交集部分，作為候選靶點(diǎn)[12]。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述候選靶點(diǎn)上傳至到蛋白質(zhì)相互作用在線(xiàn)分析平臺(tái)STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，獲取核心靶標(biāo)之間的蛋白相互作用關(guān)系，并將篩選條件設(shè)置為最高可信度“highest confidence(≥0.7)”，其余參數(shù)默認(rèn)。剔除掉游離于網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)后，剩下的即為網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)。再采用Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) 軟件來(lái)構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化分析[13]。

1.5 靶點(diǎn)的GO-BP(基因生物學(xué)功能)和KEGG信號(hào)通路富集

為了更好地說(shuō)明上述網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程(biological process)及其所涉及的信號(hào)通路富集情況，我們利用CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些核心靶點(diǎn)進(jìn)行了基因本體論-生物學(xué)過(guò)程 (Gene Ontology-Biological Process，GO-BP)與京都基因與基因組百科全書(shū) (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.01為篩選條件，并根據(jù)FDR值由小到大排序[14,15]。

2 結(jié)果

2.1 活性成分信息

通過(guò)對(duì)TCMSP和BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索共得到45個(gè)唯一化合物，其中符合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中藥代動(dòng)力學(xué)篩選條件OB≥30%、 DL≥0.18的，且能以其化合物3D分子結(jié)構(gòu)反向預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的活性成分共有34個(gè)?？鄥⒅谢钚猿煞衷敿?xì)信息見(jiàn)表1。

表1 苦參活性化合物相關(guān)信息

2.2 核心靶點(diǎn)鑒定

通過(guò)分子反向預(yù)測(cè)，共得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)3 400個(gè)，剔除重復(fù)項(xiàng)后共775個(gè)唯一值。檢索TTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共得到129個(gè)骨癌痛的已知治療靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)預(yù)測(cè)集與已知集取交集后導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶蛋白之間的交互作用圖(圖1)。按照上述標(biāo)準(zhǔn)篩選，最后保留了32個(gè)網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)作為后續(xù)研究對(duì)象。核心靶點(diǎn)的基本信息見(jiàn)表2。

表2 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)基本信息

圖1 核心靶點(diǎn)之間的蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)與分析

由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多重藥理作用的特性，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析探討中藥治療復(fù)雜疾病的潛在機(jī)制具有現(xiàn)實(shí)意義。為了說(shuō)明苦參、活性成分、靶標(biāo)和骨癌痛之間的關(guān)系，采用excel文件格式分別定義各節(jié)點(diǎn)及各連線(xiàn)的屬性和關(guān)系，通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建了“苦參-活性成分-靶標(biāo)-骨癌痛”的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)。其中，各節(jié)點(diǎn)的大小按照其在網(wǎng)絡(luò)中的度 (degree)值由小到大漸變，各節(jié)點(diǎn)的顏色則依據(jù)其在網(wǎng)絡(luò)中的臨近中心性 (neighborhood connectivity)，由淺色向深色漸變，如圖2所示。

圖2 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)基本信息

2.4 富集分析結(jié)果

通過(guò)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)24個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析(FDR≤0.01)，得到GO (biological process)條目895條，其中核心靶基因主要參與調(diào)節(jié)神經(jīng)再生、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)分化、化學(xué)突觸傳遞、疼痛感受、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，見(jiàn)圖3。

圖3 靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程富集分析

此外，根據(jù)通路注釋富集 (FDR≤0.01)結(jié)果，共得到信號(hào)通路196條。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點(diǎn)主要富集在破骨細(xì)胞分化、神經(jīng)生長(zhǎng)因子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、PI3K-Akt信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、癌癥中的膽堿代謝、與配體-受體接觸、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)綁定及轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物信號(hào)途徑，見(jiàn)圖4。

圖4 核心靶點(diǎn)的信號(hào)通路富集分析

3 討論

骨癌痛作為轉(zhuǎn)移性腫瘤的常見(jiàn)并發(fā)癥，不僅難以有效控制，而且還嚴(yán)重影響患者的生活及生存質(zhì)量[16]。本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來(lái)探究苦參治療骨癌痛的潛在作用機(jī)制。通過(guò)檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和應(yīng)用藥代動(dòng)力學(xué)篩選，共鑒定出苦參中的34種活性成分，包括薯蕷皂素、苦參堿、去甲苦參醇、毛地黃黃酮、多種氧化性苦參堿(如7,11-dehydromatrine、(+)-7,11-dehydromatrine、5α,9α-dihydroxymatrine)、苦參素、谷甾醇、槲皮素等。一項(xiàng)關(guān)于氧化苦參堿的研究表明，氧化苦參堿可能通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制背根神經(jīng)節(jié)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而抑制炎癥因子釋放，緩解乳腺癌轉(zhuǎn)移大鼠模型的骨癌痛[17]。另外一項(xiàng)關(guān)于谷甾醇的報(bào)道也證明苦參能減輕癌癥相關(guān)性疼痛[18,19]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體 (receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)/ 核因子-κB受體活化因子 (receptor activator of NF-κB，RANK)/ 骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)，抑制骨癌疼痛模型中的破骨細(xì)胞活化，減少骨破壞。還通過(guò)調(diào)節(jié)瞬時(shí)受體電位香草酸受體1 (transient receptor potential vanilloid subfamily member1, TRPV1)信號(hào)通路抑制骨癌疼痛的外周敏化和中樞敏化[20]。除了直接止痛作用外，還有一些成分，比如薯蕷皂素、大豆抗毒素、柚皮素等，均被報(bào)道具有直接的抗腫瘤或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[21-23]?；谏鲜鍪聦?shí)，我們推斷苦參可能通過(guò)其含有的多種活性成分協(xié)同作用治療骨癌痛，這也與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中的“多成分”共同作用機(jī)制的內(nèi)涵相吻合。

結(jié)合Cytoscape軟件生成的關(guān)于“苦參-成分-靶點(diǎn)-骨癌痛”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2)的拓?fù)湫再|(zhì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的度雄激素受體 (androgen receptor, AR)(度值17)、雌激素受體1 (estrogen receptor 1, ESR1)(度值16)、基質(zhì)金屬蛋白酶2 (matrix metallopeptidase 2, MMP2)(度值13)、速激肽受體1 (tachykinin receptor 1, TACR1)(度值13)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 (mesenchymal-epithelial transition, MET)(度值12)，而網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的臨近中心性 (neighborhood connectivity) top5則分別是瞬時(shí)感受器電位辣椒素通道(transient receptor potential vanilloid channel type 1，TRPV1)(臨近中心性17)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β (platelet-derived growth factor receptor β, PDGFRB)(臨近中心性16.8)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α (platelet-derived growth factor receptor α, PDGFRA)(臨近中心性16)、酪氨酸激酶受體2 (receptor tyrosine kinase 2, ERBB2)(臨近中心性14.6)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR)(臨近中心性14.5)。這表明僅就該復(fù)合網(wǎng)絡(luò)本身的拓?fù)湫再|(zhì)而言，這些靶點(diǎn)處于樞紐地位，因此也將作為后續(xù)的重點(diǎn)討論對(duì)象。在這些靶點(diǎn)之中，TRPV1被眾多研究報(bào)道參與調(diào)控骨癌痛的發(fā)生與發(fā)展。有報(bào)道證實(shí)，腫瘤組織的內(nèi)源性甲醛能夠通過(guò)TRPV1激活并誘導(dǎo)骨癌痛[24]。此外，有研究報(bào)道通過(guò)下調(diào)Janus激酶/磷脂酰肌醇3-激酶 (Janus kinase/Phosphatidylinositol 3-kinase，JAK/PI3K)信號(hào)通路來(lái)抑制背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元TRPV1的功能，可降低骨癌大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的高興奮性和痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)[25]。還有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制骨癌痛大鼠模型體內(nèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (insulin-like growth factor 1，IGF-1)受體的表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)骨癌痛大鼠的機(jī)械觸痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)[26]。除了TRPV1之外，ERBB2分子也被報(bào)道能阻斷蛋白激酶α、絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨癌痛的抑制作用[27]。其他靶分子如ESR1、MMP2、TARC1、MET、mTOR等也被證明具有抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多方面作用[28-31]。

為了更好地理解核心靶點(diǎn)與骨癌痛之間的聯(lián)系，我們采用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能的生物學(xué)過(guò)程GOBP及信號(hào)通路富集情況分析。基因功能富集結(jié)果表明，這些靶基因主要參與調(diào)控神經(jīng)再生、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、感受疼痛刺激、外界物理(溫度、壓力等)刺激反應(yīng)等。此外，信號(hào)通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些核心靶點(diǎn)主要富集于PI3K-Akt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等，并協(xié)調(diào)參與了包括癌癥中膽堿代謝、細(xì)胞因子受體相互結(jié)合、炎癥介質(zhì)調(diào)控瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)通路、神經(jīng)受體-配體互作、破骨細(xì)胞分化等在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程。目前關(guān)于骨癌痛的發(fā)病機(jī)制研究中，多傾向于認(rèn)為骨癌痛的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)敏化、腫瘤微環(huán)境衍生物刺激、炎癥細(xì)胞分泌物刺激和成骨-破骨動(dòng)態(tài)平衡打破等相關(guān)[32-35]，這與我們的GOBP和KEGG富集結(jié)果一致。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，揭示了苦參通過(guò)其多種活性成分靶向多基因治療骨癌痛的潛在分子機(jī)制，為骨癌痛的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，由于數(shù)據(jù)庫(kù)的更新情況限制，本研究中所涉及的成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)均缺乏一定的完整性，相關(guān)機(jī)制也有待后續(xù)進(jìn)一步的驗(yàn)證。