甜菜多胚種質(zhì)資源育性組成的分子標記分析

石好琪，吳則東，興旺，丁劉慧子，邳植

（黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）為藜科甜菜屬的二年生草本植物[1]，其產(chǎn)糖占據(jù)了世界蔗糖供應量的20%左右[2]，是除甘蔗以外的第二大糖料來源。因為甜菜是無限花序作物，所以人工去雄這種途徑不可取[3]。甜菜要想利用雜種優(yōu)勢，不育系和保持系的利用是必不可少的，這就使得對甜菜的雄性不育系和保持系快速鑒定和選育顯得尤為重要。選育甜菜優(yōu)良品種就必須有優(yōu)良不育系和授粉系，而選育甜菜不育系是甜菜育種中技術含量最高的環(huán)節(jié)之一。選育不育系的關鍵在于選育相應的保持系。選育甜菜保持系的方法目前主要為鑒定法。鑒定法是利用已有的不育系與待鑒定的個體進行成對雜交，而后觀察后代育性情況，若全為不育系則待測個體即為保持系。程大友等人[4]利用鑒定法用時15個月左右成功鑒定出了甜菜保持系。雖然鑒定法鑒定甜菜保持系耗時相對較短，而分子標記鑒定甜菜育性具有更加省時、方便快捷的優(yōu)點。如HAGIHARA 等[5]利用兩個RAPD標記很好地區(qū)分出來甜菜不育和完全可育株。孟祥雯[6]依據(jù)甜菜葉片DNA 及花蕾cDNA多態(tài)性，得到甜菜‘DY5’品系保持系和不育系基因組、轉(zhuǎn)錄組并分析其差異。劉一珺[7]根據(jù)設計出的29對引物進行篩選得出7對引物所在甜菜不育系和保持系之間具有差異，至于這7對引物在其它甜菜品系的不育系和保持系中是否同樣適用需要進一步驗證。趙麗梅等人[8]利用412 對SSR 引物對大豆RN 型不育系‘YA’和恢復系‘167’雜交的F2分離群體進行篩選，獲得了Satt414、Satt596 和Satt547 分子標記，通過這些分子標記可以提高大豆恢復系選育速度和效率，并且可為進一步精準定位恢復基因和克隆恢復基因打下基礎。李志寬等人[9]通過對小麥的196對SSR引物進行擴增篩選，得出7個SSR分子標記在‘矮抗58’和‘R113’的F2代分離群體中的極端可育株和極端不育株的恢復池與不育池中擴增出了穩(wěn)定的多態(tài)性差異條帶，這7 個SSR 標記可直接用于T型或者S 型雜交小麥分子標記輔助育種，能有效提高相應恢復系的選擇效率。趙麗梅等人[8]和李志寬等人[9]利用SSR分子標記對大豆、小麥的恢復系輔助選育研究，為我們應用SSR分子標記在甜菜不育系和保持系的鑒定提供了新思路。

大量可變數(shù)目的串聯(lián)重復序列（Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）存在于真核生物基因組中[10]，這些序列與多個基因座雜交并且本質(zhì)上是可變的，因此被證明對遺傳分析非常有用[11-12]。甜菜線粒體基因組中有4 個不相關聯(lián)的串聯(lián)重復位點（TR1、TR2、TR3 和TR4），而其中TR1 串聯(lián)重復序列的多態(tài)性最高，拷貝數(shù)從2～13 個不等。可以利用作用于甜菜線粒體VNTR 位點的細胞質(zhì)鑒定引物TR1 進行甜菜細胞質(zhì)類型鑒定[13]，再利用甜菜細胞核DNA 的bvORF17上游區(qū)的多態(tài)性鑒定細胞核育性恢復基因（Rf1）的基因型就可以快速了解甜菜的育性組成情況[14]。本研究通過分子標記的手段了解國家甜菜種質(zhì)資源庫中甜菜多胚種質(zhì)資源的細胞質(zhì)類型以及細胞核育性恢復基因組成情況，為將來應用多胚保持系同步改良單胚不育系和保持系以及應用多胚保持系做父本更好地進行品種保護打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試種質(zhì)：試驗材料為國家甜菜種質(zhì)資源庫中的627份甜菜多胚種質(zhì)資源，6份甜菜不育系和6份甜菜保持系種質(zhì)資源。（2）引物：引物包括鑒定細胞質(zhì)育性的TR1引物[15]和鑒定細胞核育性的T1、T2引物[14]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。（3）試驗試劑與儀器：異丙醇、液氮、CTAB緩沖液、異戊醇、無水乙醇、2×Rapid Taq Master Mix、熒光核酸染料、瓊脂糖、1×TAE 緩沖液。儀器：震蕩研磨機、高速離心機、PCR 儀、凝膠成像儀、紫外分光光度計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

DNA 提取采用CTAB 法對甜菜種質(zhì)資源嫩葉進行提取[16]，每份種質(zhì)資源隨機選取5 株進行混合取樣。提取完DNA后放于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴增

對甜菜細胞質(zhì)類型和細胞核Rf1位點基因型鑒定用引物1、引物2及PCR擴增體系如表1，PCR擴增條件如表2。

表1 甜菜細胞質(zhì)類型和細胞核Rf1 位點基因型鑒定的PCR 擴增體系Table 1 PCR amplification system for genotype of cytoplasmic type and nucleus Rf1 locus in sugar beet

表2 甜菜細胞質(zhì)類型和細胞核Rf1 位點基因型檢驗的PCR 擴增條件Table 2 PCR amplification conditions for genotype of cytoplasmic type and nucleus Rf1 locus in sugar beet

1.2.3 電泳

PCR 擴增結(jié)束后，吸取5μL 產(chǎn)物點入1%瓊脂糖膠孔中，而后在130 V 電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后利用凝膠成像儀進行條帶觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜細胞質(zhì)類型鑒定

NISHIZAWA 等人[15]在甜菜的線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)了4 個不相關聯(lián)的串聯(lián)重復位點TR1、TR2、TR3 和TR4，其中TR1 位點的多態(tài)性最高，串聯(lián)重復序列的數(shù)量從2～13 個不等。王有昭[17]用TR1 引物對甜菜主要品系進行擴增，而后測序發(fā)現(xiàn)，不育系擴增條帶大小在500 bp左右，保持系擴增條帶大小在750 bp左右。鑒于此，我們可以通過對比條帶大小判斷甜菜細胞質(zhì)類型。

通過對627 份甜菜多胚種質(zhì)資源進行育性組成情況分析，TR1 引物擴增出來的條帶類型有500 bp、750/500 bp（既有500 bp 條帶也有750 bp 條帶）、750 bp 和X 型（未知帶型）4 種，即S 型細胞質(zhì)（不可育細胞質(zhì)類型）、N/S型細胞質(zhì)類型（既有可育細胞質(zhì)類型也有不可育細胞質(zhì)類型）、N型細胞質(zhì)（可育細胞質(zhì)類型）和X型細胞質(zhì)（未知細胞質(zhì)類型）。其中N 型有234 份，占37%左右；N/S 型53 份，占8%左右；S 型289 份，占46%左右；X 型51 份，占8%左右，如表3。部分擴增結(jié)果如圖1。X 這種帶型在李士龍[18]、王良[19]的試驗中均有出現(xiàn)?？梢钥隙ǖ氖沁@種帶型在TR1位點拷貝數(shù)上有別于N 型和S型細胞質(zhì)。為了進一步說明不育系的細胞質(zhì)類型為S，選取6 株不育系和保持系進行驗證，結(jié)果如圖2。圖2A 中出現(xiàn)的500 bp 左右的條帶即為不育系所擴增出來的帶型，圖2B中出現(xiàn)的750 bp左右的條帶即為保持系所擴增出來的帶型。

表3 甜菜種質(zhì)資源細胞質(zhì)類型鑒定Table 3 Identification of cytoplasmic types of sugar beet germplasm resources

圖1 甜菜多胚種質(zhì)資源細胞質(zhì)類型鑒定Fig.1 Identification of cytoplasmic types of sugar beet polyembryonic germplasm resources

圖2 6份不育系（A）和6份保持系（B）細胞質(zhì)類型鑒定Fig.2 Identification of cytoplasmic types of six sterile lines(A)and six maintainer lines(B)

2.2 甜菜細胞核Rf1位點基因型鑒定

利用T1、T2 引物對DNA 模板進行擴增，共擴增出來同時具有1 300 bp 和1 800 bp 以及僅具1 800 bp 兩種帶型，甜菜種質(zhì)資源基因型鑒定結(jié)果如圖3。劉一珺[7]在用T1、T2引物進行擴增時擴增出來3種帶型，而本次試驗中沒有單一1 300 bp 這種帶型。試驗中，用TR1 引物擴增出來的627 份DNA 模板進行細胞核基因型驗證，其中同時具有1 800 bp 和1 300 bp 兩種條帶有78份，僅具1 800 bp條帶有159 份，有390 份沒有擴增出條帶。根據(jù)劉一珺[7]對甜菜用T1、T2 引物擴增，得出T1、T2 引物共擴增出來1 800 bp、1 300 bp 和1800/1300 bp 三種條帶帶型。本試驗有部分種質(zhì)資源盡管用TR1 引物能擴增出來N 或者S 型條帶，但T1、T2 引物卻擴增不出來相應的條帶（表4）。

圖3 甜菜多胚種質(zhì)資源細胞核Rf1位點基因型鑒定Fig.3 Genotype identification of nucleus Rf1 locus in sugar beet polyembryonic germplasm resources

表4 甜菜種質(zhì)資源育性組成情況統(tǒng)計Table 4 Statistics of fertility composition of sugarbeet germplasm resources

然后采用6 個不育系進行細胞核的基因型驗證。擴增結(jié)果如圖4。結(jié)果均為1 800 bp 條帶。結(jié)合細胞質(zhì)類型的驗證，可以判斷不育株的細胞質(zhì)基因型為S 型，但細胞核Rf1位點的基因型還需進行酶切驗證進一步確認。

圖4 6份甜菜不育系細胞核Rf1位點基因型鑒定Fig.4 Genotype identification of nucleus Rf1 locus in six sugar beet sterile lines

3 討論與結(jié)論

利用分子標記對甜菜育性進行鑒定具有很大的實際意義[20]，以往鑒定甜菜不育系和保持系都耗時較長，而且一旦某個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題就前功盡棄。通過T1、T2引物擴增出來的條帶而后進行酶切驗證可以判斷細胞核Rf1位點基因型，若細胞質(zhì)類型為N或者S 型就可以判定其為保持系或者不育系。有部分種質(zhì)資源用T1、T2 引物沒有擴增出來結(jié)果，推測其產(chǎn)生的原因為：(1)模板發(fā)生降解，導致引物所擴增位點不存在；(2)T1、T2引物的擴增位點突變，導致引物無法與相應區(qū)域結(jié)合。在細胞質(zhì)育性鑒定時出現(xiàn)了N/S型細胞質(zhì)帶型，這是由于采樣時混樣造成的。因此，若是想進一步了解甜菜種質(zhì)資源整體育性情況，采取抽樣調(diào)查，單株鑒定是一個更為可行的方式。

1945 年，歐文提出X和Z基因座的互補作用控制甜菜的雄性不育或可育[21]，后來他又指出這種遺傳模型并不能解釋他所做的所有雜交結(jié)果。1950年，歐文又提出X 基因座上的育性恢復基因X（即Rf1基因）對于甜菜的育性恢復起到至關重要的作用，而Z基因座對甜菜育性恢復的影響較小[22]，因此鑒定Rf1基因型對于甜菜的育性鑒定至關重要。MORITANI 等人[23]在研究中建立了兩個分子標記，這兩個分子標記可以在甜菜群體中對保持系基因型進行簡單而快速的分析，盡管最終確認仍需進行試驗雜交，但這兩種DNA 標記的預選擇可以減少保持系選擇的規(guī)模。因為可以在苗期就進行篩選，所以使用這種新的標記系統(tǒng)將大大減少這一作物品種育種計劃所需的勞動力，但該分子標記方法的一個局限性是標記系統(tǒng)不能完全準確有效地識別每一個保持系。目前，甜菜細胞質(zhì)育性基因型已經(jīng)可以用分子標記很好地區(qū)分出來[15]，細胞核的Rf1位點基因型通過分子標記也能很輕易區(qū)分出來[14,24-25]。在對細胞核基因型進行鑒定時，劉一珺[7]利用TAGUCHI等人[14]所述的引物對甜菜基因組DNA進行擴增時產(chǎn)生了3種帶型，而其中的1 800 bp大小的帶型經(jīng)過酶切后的4/4模式帶型和保持系帶型吻合，而另外兩種帶型卻不確定具體的基因型，因此，這兩種帶型是否也對應相應的甜菜細胞核基因型需要結(jié)合分子標記和田間試驗進一步探究。未來，利用分子標記準確地確定每一株甜菜的育性情況對于以后的甜菜育種工作具有重要意義。

在用TR1 引物對甜菜DNA 模板進行擴增時，出現(xiàn)嚴重的彌散現(xiàn)象。起初進行退火溫度的調(diào)整，但去除效果不明顯。后把循環(huán)數(shù)調(diào)整為25，彌散現(xiàn)象才基本消除，但仍然有個別彌散現(xiàn)象，疑似人為加樣時導致DNA 模板未能加入。另外，在擴增結(jié)果中出現(xiàn)了N/S型（即有750 bp 的條帶，也有500 bp的條帶）的現(xiàn)象，這是由于混合取樣造成的，這種N/S雙帶型表明樣品中既有可育細胞質(zhì)類型也有不育細胞質(zhì)類型。

試驗通過對國家甜菜種質(zhì)資源庫中的部分甜菜種質(zhì)資源進行育性鑒定表明，627 份種質(zhì)資源中不育型細胞質(zhì)類型占46%左右，可育型細胞質(zhì)類型占37%左右。對于T1、T2 引物擴增條帶為1800/1300 bp 的種質(zhì)資源是否是1800/1300 bp型或者1 800 bp 和1 300 bp型的混合仍未可知。但從總體來看，國家甜菜種質(zhì)資源庫中的資源育性程度較復雜，在后續(xù)育種中需要對其進行單株篩選。