葉面噴施脂肪酸對(duì)甜菜幼苗抗低溫脅迫的影響

何碩，范國(guó)凱，張廣華，於麗華，耿貴

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

低溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量、品質(zhì)形成的主要環(huán)境因子[1]。對(duì)植物的傷害表現(xiàn)為膜相改變以及膜的損害而引起的代謝紊亂[2-3]。植物生長(zhǎng)的各個(gè)階段都會(huì)受到溫度的影響。為緩解其傷害，植物體內(nèi)會(huì)積累一些可溶物質(zhì)，如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等，這些物質(zhì)可在細(xì)胞受到低溫脅迫時(shí)起到滲透調(diào)節(jié)作用[4]。細(xì)胞膜作為細(xì)胞與外界環(huán)境聯(lián)系的界面，最先感知低溫傷害。脂肪酸作為細(xì)胞膜的必要組分之一，對(duì)于植物適應(yīng)低溫環(huán)境最為關(guān)鍵，因此對(duì)脂肪酸進(jìn)行調(diào)整是植物適應(yīng)低溫脅迫的重要方式之一[1]。

甜菜（Beta vulgarisL.）屬藜科二年生草本植物，是全球最重要的糖料作物之一，為全球提供接近20%的糖產(chǎn)量[5]。甜菜具有喜冷涼濕潤(rùn)，耐低溫、耐鹽堿等特點(diǎn)，是我國(guó)的主要糖料作物之一[6]。內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江是我國(guó)甜菜的主要產(chǎn)區(qū)，近年來這些地區(qū)無法控制的極端低溫天氣是制約甜菜高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。因此，探究甜菜幼苗耐寒性，對(duì)選育甜菜耐寒品種，提升甜菜幼苗抗低溫脅迫能力，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期以及擴(kuò)大種植面積具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜在低溫條件下，會(huì)通過一系列生理生化反應(yīng)誘導(dǎo)合成新蛋白質(zhì)、提高脯氨酸和可溶性糖含量、提高抗氧化酶活性等，來減輕或消除逆境傷害下產(chǎn)生的不利因素[7]。噴施外源物質(zhì)能夠提高低溫條件下植物的抗寒性，如氨基酸水溶肥、蔗糖、蕓苔素內(nèi)酯[8]和脫落酸[9]等。盡管國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于甜菜抗低溫脅迫及植物抗逆物質(zhì)調(diào)控的研究，但利用脂肪酸調(diào)控、預(yù)防甜菜低溫凍害的相關(guān)研究仍然較少。本研究以甜菜品種‘KWS1176’為試驗(yàn)材料，在室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，研究葉面噴施脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響,了解脂肪酸對(duì)甜菜幼苗低溫脅迫的調(diào)控效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜菜品種為‘KWS1176’。盆栽試驗(yàn)采用室內(nèi)培養(yǎng)，光照常溫培養(yǎng)條件為L(zhǎng)ED 燈光照，HPG-280HX人工氣候箱，低溫處理使用LRH-250CL低溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置4 種處理，分別為T0：蒸餾水對(duì)照；T1：葉面噴施2.5%脂肪酸溶液；T2：葉面噴施5%脂肪酸溶液；T3：葉面噴施7.5%脂肪酸溶液。每組7 次重復(fù)。播種方式：每盆先放400 g 土壤，再均勻擺入20 粒種子，100 g 土覆蓋。每盆加入100 mL 改良的1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液[3.5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、1 mmol/L Mg-SO4·7H2O、0.5 mmol/L NH4H2PO4、3.5 mmol/L KCl和3 mmol/L NaCl]、EDTA-Fe（0.06 mmol/L FeSO4-EDTA）、阿農(nóng)微量元素。放入LED燈下培養(yǎng)，光照14 h/d，黑暗10 h/d，開燈溫度25 ℃、關(guān)燈溫度20 ℃。培養(yǎng)5 d至發(fā)芽出苗后，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置見表1。光照14 h/d，黑暗10 h/d，溫度為8～20 ℃（從20 ℃開始，以2 ℃/h為標(biāo)準(zhǔn)先降低至8 ℃后，再升高到20 ℃），培養(yǎng)5 d后葉面噴施脂肪酸溶液處理，2 d一次，共兩次。培養(yǎng)期間定時(shí)澆水，保持土壤相對(duì)含水量在70%左右，定時(shí)倒盆換位，保證每盆所受光照一致。

表1 光照培養(yǎng)箱溫度設(shè)置情況Table 1 Temperature setting of the light incubator

播種3 d后開始記錄各處理的出苗數(shù)，葉面噴施脂肪酸后，待幼苗第一對(duì)真葉顯現(xiàn)時(shí)，保留每盆中長(zhǎng)勢(shì)一致的甜菜幼苗進(jìn)行3 h的-2 ℃低溫鍛煉處理，24 h后進(jìn)行3 h的-4 ℃冷凍處理。冷凍結(jié)束取樣測(cè)定指標(biāo)。訓(xùn)練和冷凍處理培養(yǎng)箱設(shè)置情況見表2。低溫處理后統(tǒng)計(jì)甜菜幼苗低溫凍害死亡率且進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 低溫培養(yǎng)箱溫度設(shè)置情況Table 2 Temperature setting of the low temperature incubator

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 凍害死亡率、地上部干重和鮮重的測(cè)定

凍害死亡率為植株死亡數(shù)與總株數(shù)的比值。從各處理每盆中取5 株葉片完整的幼苗，測(cè)定其地上部鮮重。將已知鮮重的甜菜幼苗放入105 ℃烘箱中殺青30 min，再以75 ℃烘至恒重，用萬分之一分析天平稱量幼苗干重。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

參考李合生等[10]的方法進(jìn)行以下生理指標(biāo)的測(cè)定。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA。抗氧化酶活性測(cè)定：采用抑制NBT 光還原比色法測(cè)定SOD 活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD 活性；采用紫外線吸收法測(cè)定APX 活性；采用過氧化氫紫外線法測(cè)定CAT 活性。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定可溶性蛋白含量；采用蒽酮乙酸乙酯法測(cè)定可溶性糖含量[11]。

葉片的相對(duì)電導(dǎo)率（REC）參考LI等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。將處理后的甜菜幼苗用去離子水沖洗干凈，剪成小份，混合均勻，稱取2 g 放入20 mL 刻度試管中，加入20 mL 去離子水，真空抽氣30 min，搖勻后用DDS-307 電導(dǎo)率儀測(cè)定初始電導(dǎo)率R1。再將試管封口，沸水浴加熱1 h，冷卻后搖勻，測(cè)定最終電導(dǎo)率R2。相對(duì)電導(dǎo)率=R1/R2×100%。根系活力采用α-萘胺法測(cè)定[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Office 2019 和DPS 7.05 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法（LSD法），對(duì)不同處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)（顯著性水平為0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度脂肪酸對(duì)甜菜幼苗冷凍死亡率的影響

由圖1可知，甜菜幼苗噴施不同濃度脂肪酸使甜菜幼苗冷凍死亡率明顯降低。T0 蒸餾水處理的幼苗死亡率達(dá)到79.50%，比T1、T2、T3 組分別高出8.22、45.22、5.56 個(gè)百分點(diǎn)。T1、T2 與T0 之間幼苗死亡率差異顯著（P＜0.05），T2組幼苗死亡率最低，凍害緩解效果最好。

圖1 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗死亡率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of fatty acids on seedling mortality of sugar beet under low temperature stress

2.2 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗地上部干重、鮮重和根系活力的影響

由表3可知，葉面噴施不同濃度脂肪酸處理在低溫脅迫下，甜菜幼苗地上部干重、鮮重與T0 相比有所增加，其中，T2 增加最為明顯，鮮重比T1、T3 及T0 組分別增加31.51%、48.69%、68.42%；干重分別比T1、T3 及T0 組分別增加14.29%、52.38%、68.42%，T3 與T0 之間差異不顯著，其他處理與T0 差異顯著。隨著脂肪酸濃度的加大，幼苗根系活力出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，T1、T2 與T0 之間差異顯著，根系活力表現(xiàn)最好的為T2[75.238μg/(g·h)]，較T0處理根系活力增加71.74%。

表3 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗地上部鮮重、干重和根系活力的影響Table 3 Effects of different concentrations of fatty acids on fresh weight,dry weight of above ground part and root activity of sugar beet seedlings under low temperature stress

2.3 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響

甜菜幼苗葉面噴施不同濃度脂肪酸經(jīng)低溫脅迫后，葉片相對(duì)電導(dǎo)率均呈降低趨勢(shì)（圖2A）。T0 的甜菜葉片相對(duì)電導(dǎo)率較高（87.87%）。T1、T2、T3 處理電導(dǎo)率較T0分別降低37.01、62.90、13.78 個(gè)百分點(diǎn)，除T3與T0 差異不顯著外，其他處理之間差異顯著（P<0.05），T2（5%脂肪酸）處理噴施效果最佳，因此推測(cè)，葉面噴施脂肪酸可以保護(hù)甜菜葉片細(xì)胞膜，減緩低溫脅迫下電導(dǎo)率的上升幅度。

葉面噴施不同濃度脂肪酸經(jīng)過低溫脅迫后，甜菜葉片細(xì)胞內(nèi)MDA 含量較T0 顯著降低（圖2B），各處理間均具有顯著性差異（P<0.05）。T1、T2、T3 處理MDA 含量較T0 分別降低13.86%、22.74%、10.52%，T2 下降幅度最大。甜菜葉片MDA 含量隨著噴施脂肪酸濃度增加呈先降低后升高的趨勢(shì)。其中，T2（5%脂肪酸）處理噴施效果最佳。

圖2 低溫脅迫下不同濃度脂肪酸對(duì)甜菜幼苗相對(duì)電導(dǎo)率(A)和MDA(B)含量影響Fig.2 Effects of different concentrations of fatty acids on relative electrical conductivity(A)and MDA content(B)of sugar beet seedlings under low temperature stress

2.4 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由表4 可知，與T0 處理相比，葉噴脂肪酸甜菜幼苗在低溫脅迫下葉片SOD 活性下降，T1、T2 與T0 之間SOD活性差異顯著（P<0.05）。T1、T2、T3處理SOD活性比T0分別降低12.57%、37.72%、0.57%。隨著脂肪酸噴施濃度的增大，SOD活性在T1、T2處理間呈下降趨勢(shì)，并顯著差異（P<0.05）。與T0處理相比，葉噴脂肪酸甜菜幼苗低溫脅迫下葉片POD 活性均顯著降低，T1、T2、T3 處理的POD 活性較T0 分別降低15.38%、33.35%、19.88%。T1、T2、T3處理的CAT活性與T0相比均差異顯著，較T0分別降低12.78%、25.28%、9.19%。T1、T2、T3處理的APX 活性與T0相比均有下降，T1、T2、T3 活性較T0分別降低25.12%、44.08%、13.74%，T1、T2 與T0 相比差異顯著（P<0.05）。低溫脅迫下甜菜幼苗葉片各抗氧化酶活性隨脂肪酸的噴施而活性降低，T2（葉面噴施5%脂肪酸）處理下，POD、SOD、CAT和APX酶的活性最低。

表4 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Table 4 Effects of different concentrations of fatty acids on antioxidant enzyme activities of sugar beet seedling leaves under low temperature stress

2.5 不同濃度脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性蛋白作為植物體內(nèi)必不可少的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與滲透調(diào)節(jié)過程，其含量的多少直接反映植物在低溫脅迫下的適應(yīng)能力。由圖3A可知，與對(duì)照T0處理相比，可溶性蛋白含量隨著脂肪酸濃度的提升而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，各處理之間差異顯著，T1、T2、T3 可溶性蛋白含量比T0 分別增加13.31%、31.12%、9.65%。葉面噴施脂肪酸溶液可提高甜菜幼苗葉片可溶性蛋白含量，T2（5%脂肪酸）處理效果最佳。

圖3 低溫脅迫下不同濃度脂肪酸對(duì)甜菜幼苗可溶性蛋白含量(A)和可溶性糖含量(B)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of fatty acids on soluble protein content(A)and soluble sugar content(B)of sugar beet seedlings under low temperature stress

可溶性糖是冷害和凍害條件下細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)物質(zhì)，是植物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。低溫脅迫下甜菜幼苗葉片內(nèi)可溶性糖含量T1、T2、T3 與T0 比均有下降（圖3B），T1、T2、T3 可溶性糖含量較T0 分別降低17.56%、24.05%、15.06%，T1、T2與T0差異顯著（P<0.05）。隨著噴施濃度的增加低溫脅迫下甜菜幼苗葉片內(nèi)可溶性糖含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，且對(duì)甜菜幼苗保護(hù)能力以T2（5%脂肪酸）處理效果最佳。

3 討論與結(jié)論

3.1 脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗生物量、根系活力和凍害死亡率的影響

低溫作為自然環(huán)境脅迫之一，它影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其產(chǎn)量。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常因低溫傷害而導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失慘重[14]。低溫條件下，植物能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控自身的生理生化代謝途徑，合成有關(guān)物質(zhì)，以緩解低溫傷害[15]。在本試驗(yàn)中，葉面噴施不同濃度脂肪酸，甜菜幼苗的地上部干重、鮮重及根系活力均有增加，死亡率下降。葉面噴施蒸餾水的幼苗受凍害最為嚴(yán)重，死亡率達(dá)到79.50%，根系活力顯著下降。而隨著不同濃度脂肪酸的噴施，甜菜子葉期幼苗的干重、鮮重以及根系活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，而幼苗死亡率呈先下降后升高的趨勢(shì)。說明脂肪酸能夠減緩低溫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，保證幼苗正常生長(zhǎng)，使幼苗地上部干重、鮮重及根系活力維持在較高水平，從而降低幼苗死亡率。試驗(yàn)初步得出，當(dāng)噴施脂肪酸溶液濃度為5%時(shí)，抗凍效果最佳。

3.2 脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗抗氧化酶活性、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

抗氧化酶對(duì)植物的調(diào)節(jié)作用是抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分，能清除并穩(wěn)定因低溫導(dǎo)致的細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化所產(chǎn)生的活性氧（AOS），從而維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]，使細(xì)胞避免過氧化傷害。試驗(yàn)結(jié)果表明，葉面噴施脂肪酸溶液的甜菜幼苗經(jīng)-4 ℃低溫脅迫后，與對(duì)照組相比，SOD、POD、CAT、和APX 的活性均下降。說明甜菜葉片經(jīng)脂肪酸處理后將直接提高葉片耐低溫能力，減少細(xì)胞過氧化物質(zhì)產(chǎn)生，同時(shí)也說明低溫處理使甜菜幼苗細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭受傷害，細(xì)胞生物酶活性降低，使其調(diào)節(jié)能力降低。這與張淑英等[17]對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)研究結(jié)果相同。在低溫脅迫下葉面噴施脂肪酸的甜菜幼苗葉片MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照相比呈顯著下降趨勢(shì)，說明噴施脂肪酸能夠保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的外滲，對(duì)正常的生理代謝和維持細(xì)胞微環(huán)境起著重要的作用，這與茉莉酸對(duì)低溫脅迫水稻幼苗的生理效應(yīng)[18]研究結(jié)果相同。在正常情況下，當(dāng)植物受到低溫危害時(shí)，不僅會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外泄，細(xì)胞膜透性也會(huì)隨之提高，導(dǎo)致植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大[19]。與對(duì)照組相比，葉面噴施濃度為5%濃度脂肪酸溶液可以降低MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率。推測(cè)是因?yàn)橹舅崮軌蚍€(wěn)定細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和膜蛋白，使細(xì)胞膜的代謝系統(tǒng)趨于正常。

3.3 脂肪酸對(duì)低溫脅迫下甜菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用

可溶性蛋白和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要作用是降低滲透勢(shì)，增強(qiáng)細(xì)胞的吸水能力，從而適應(yīng)低溫脅迫的過程[20-21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照處理相比，葉面噴施脂肪酸處理經(jīng)-4 ℃的低溫脅迫后甜菜幼苗葉片中可溶性蛋白含量均顯著提高，而可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)。說明低溫對(duì)甜菜幼苗造成了傷害，觸發(fā)了甜菜幼苗的抗冷機(jī)制，促使甜菜主動(dòng)積累可溶性蛋白，降低細(xì)胞滲透勢(shì)，緩減甜菜幼苗因低溫而導(dǎo)致的細(xì)胞失水，從而減輕甜菜幼苗的低溫傷害[22-24]。本試驗(yàn)研究表明，與對(duì)照相比，葉面噴施一定濃度的脂肪酸溶液低溫脅迫下可提高甜菜幼苗葉片可溶性蛋白含量，在5%的濃度達(dá)到最佳，可以有效減輕甜菜幼苗在低溫條件下受到的傷害。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在5%的脂肪酸處理下，甜菜幼苗地上部干重、鮮重和根系活力較其他處理增高，死亡率降低，MDA 含量及電導(dǎo)率較其他處理降低明顯。脂肪酸濃度過低雖能提高甜菜幼苗的抗寒能力，但效果并不顯著；而當(dāng)噴施的脂肪酸濃度過高時(shí)，則會(huì)對(duì)幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。因此，初步得出葉面噴施5%濃度的脂肪酸能最大程度地緩解因低溫脅迫對(duì)甜菜生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用。在今后的生產(chǎn)實(shí)踐過程中，可以考慮合理施用脂肪酸來防止或降低低溫對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的損失。