紅甜菜提取物及甜菜紅素的體外抗氧化活性分析

王錦霞，郭萌萌，劉亞昕，閆樺，孫思琦，王秋紅，興旺，劉大麗

（1.國家甜菜種質(zhì)中期庫/黑龍江大學，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院/黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080；3.黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080）

0 引言

紅甜菜為藜科甜菜屬甜菜種的一個變種，與廣泛種植的糖用甜菜相比，生物學特性比較相似，但所含營養(yǎng)物質(zhì)成分差異較大[1]。經(jīng)現(xiàn)代研究表明，紅甜菜含有極其豐富的營養(yǎng)價值，其營養(yǎng)成分為：可溶性蛋白、可溶性糖、游離不飽和脂肪酸、維生素C、煙酰胺、膳食纖維、甜菜堿、皂苷類和種類豐富的人體必需微量元素以及甜菜色素[2]。較多研究表明，紅甜菜具有抗癌、降血脂、降血壓、降血糖、抗氧化、降低細胞毒性等功能[3-5]。故紅甜菜在工業(yè)、商業(yè)及食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和市場。

紅甜菜中的色素作為一種天然色素，不僅有極高的營養(yǎng)價值而且安全性高，還可以替代人工合成染料，作為食品色素或添加劑被廣泛應(yīng)用在各個行業(yè)中[6]。甜菜紅素是紅甜菜中所有有色物質(zhì)的總稱，分為甜菜花青素和甜菜黃素兩種，是水溶性雜環(huán)酪氨酸衍生物，其主要成分為甜菜紅苷，占甜菜紅素的75%～90%[7-8]。甜菜紅素在其他植物或者真菌中也有分布，但在紅甜菜中的含量顯著高于其他物種[9]。甜菜紅苷是甜菜紅素清除自由基的主要基團，甜菜紅苷的功能性基團既是電子供體又是電子受體，作為氧化還原的中間體[10]。紅甜菜塊根中的甜菜紅素能夠顯著提高細胞中SOD、CAT、MDA等具有抗氧化功能活性物質(zhì)的含量，在生理狀態(tài)下具有較強的抗氧化和抗癌能力，可有效地緩解高血脂癥、冠心病、糖尿病等[11-12]。其所含豐富的維生素C、煙酸、皂角苷類以及礦物質(zhì)等也具有一定的保健功能和營養(yǎng)價值。同時，紅甜菜葉片也具有較強的抗氧化能力，并且其抗氧化性能與多酚、花青素、類胡蘿卜素、葉綠素等色素呈顯著正相關(guān)[13]。

雖然通過高效液相色譜法可測定紅甜菜中甜菜紅素的含量，但是至今對紅甜菜塊根以及其中甜菜紅素的抗氧化性能研究報道較少。本研究探討紅甜菜塊根中活性成分和甜菜紅素的含量與其抗氧化性能之間的關(guān)系，為今后深入研究紅甜菜的體外抗氧化活性以及深度開發(fā)和利用紅甜菜提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑

供試紅甜菜塊根：2020 年11 月購自京東商城，產(chǎn)地江蘇。放入4 ℃冰箱備用。甜菜紅素標準品購自孟成科技（上海）有限公司，TPTZ、DPPH、ABTS購自卡邁舒（上海）生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 紅甜菜凍干粉的制備

取紅甜菜根去皮，切成1 cm×0.5 cm 細絲，放入-20 ℃冰箱預凍24 h 后，用真空冷凍干燥機干燥48 h，轉(zhuǎn)移至搗碎機搗碎，得到紅甜菜凍干粉，共制備3批，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 甜菜紅素含量的測定

1.3.1 紅甜菜中紅色素物質(zhì)的鑒定

準確稱取上述制備的紅甜菜凍干粉1 g，用醋酸—醋酸鈉緩沖液（pH 5.4）提取體內(nèi)甜菜紅色素，低速離心30 s，取上清液在400～700 nm的可見光區(qū)進行波長掃描，確定其最大吸收光譜。

1.3.2 甜菜紅素標準曲線的繪制

稱取甜菜紅素標準品0.1 g，用pH 5.4 提取液配制濃度為1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL標準品溶液。在酶標儀535 nm處測定吸光度。以甜菜紅素標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制甜菜紅素標準曲線。

1.3.3 甜菜紅素含量的測定

稱取紅甜菜凍干粉各0.1 g，用pH 5.4 提取液定容，冷凍離心，取上清300μL 于酶標儀在535 nm 處測定吸光度，重復3次取平均值，計算甜菜紅素含量。

式中c1為甜菜紅素提取物的濃度；m1為樣品質(zhì)量；V1為提取液體積50 mL；C為樣品中甜菜紅素含量。

1.4 抗氧化活性分析

1.4.1 FRAP法

以FeSO4標準品摩爾濃度（μmol/mL，x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制FeSO4標準曲線，表明FeSO4標準品摩爾濃度在0.4～3 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其線性回歸方程為：

取100、500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000μg/mL紅甜菜水溶液樣品，于60 ℃、250 W 條件下超聲提取。取上清5 μL 加25 μL 蒸餾水與170 μL FRAP 工作液（0.3 mmol/mL CH3COONa 緩沖液∶10 mmol/mL TPTZ∶20 mmol/mL FeCl3按10∶1∶1混勻），混合液反應(yīng)時間為10、20、30 min，置于酶標儀在590 nm 處測吸光值。樣品最終的總抗氧化能力以FeSO4的當量濃度（FRAP值）表示，試驗重復3次。

1.4.2 DPPH法

以Trolox 標準品（天然水溶性VE）質(zhì)量濃度（μg/mL，x）為橫坐標，517 nm 吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，表明Trolox標準品質(zhì)量濃度在5～35 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其線性回歸方程為：

將不同濃度的紅甜菜水溶液樣品（同1.4.1），冰浴勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中。12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清150μL 加150μL DPPH 工作液（200 mmol/mL）混勻，以80%甲醇為對照，反應(yīng)時間為10、30、45 min，置于酶標儀在517 nm處測定吸光值，試驗重復3次。

式中A測定為樣品+工作液，A對照為樣品+80%甲醇，A空白為80%甲醇+工作液。

1.4.3 ABTS法

以Trolox 標準品質(zhì)量濃度（μg/mL，x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，表明Trolox 標準品質(zhì)量濃度在20～220 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其線性回歸方程為：

將不同濃度紅甜菜水溶液樣品（同1.4.1），置于60 ℃超聲提取30 min，12 000 r/min離心，取上清10μL與190 μL ABTS 工作液（7 mmol/mL ABTS∶2.45 mmol/mL K2S2O8溶液1∶1 混勻）混勻，以無水乙醇為對照，以Trolox 當量（TEAC）為標準，反應(yīng)時間為10、15、20 min，在酶標儀734 nm 測吸光值，試驗重復3 次。ABTS 自由基清除率計算同公式（2）。

式中A測定為樣品+工作液，A對照為樣品+無水乙醇，A空白為無水乙醇+工作液。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗重復測定3 次，采用IBM SPSS Statistics 25 軟件對所測數(shù)據(jù)進行方差分析和Pearson 相關(guān)性分析。Excel繪圖，結(jié)果以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜紅素含量

由圖1 可見，甜菜紅素提取液在可見光區(qū)535 nm 處有最大吸收峰，與甜菜紅素標準品的吸收峰值一致。通過甜菜紅素標準曲線分析表明，其線性回歸方程為y=0.1072x+0.0005（R2=0.9994，y為吸光值，x為甜菜紅素標準品質(zhì)量濃度mg/mL）。這說明在甜菜紅素質(zhì)量濃度1～8 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖2）。經(jīng)檢測，本試驗紅甜菜根中的甜菜紅素含量為2.53%。

圖1 甜菜紅素提取液吸收光譜掃描Fig.1 Absorption spectrum scanning of betacyanin extract in red beet

圖2 甜菜紅素標準曲線Fig.2 Standard curve of betacyanin

2.2 紅甜菜抗氧化能力分析

2.2.1 總抗氧化能力

如圖3A 所示，0～30 min 內(nèi)紅甜菜水提物隨著濃度100～10 000 μg/mL 的增加，F(xiàn)RAP 值隨之增大。即FRAP法測定紅甜菜提取物總抗氧化能力的精確反應(yīng)時間為30 min，其抗氧化活性也隨著水提物濃度增加而增強。

圖3 紅甜菜總抗氧化能力（A）、DPPH（B）和ABTS+（C）自由基清除能力分析Fig.3 Total antioxidant capacity（A）,DPPH（B）and ABTS+（C）radical scavenging activity analysis of red beet

2.2.2 DPPH自由基清除能力

在Trolox 標準品質(zhì)量濃度5～35 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。紅甜菜水提物濃度為4 mg/mL，反應(yīng)30 min 時對DPPH 自由基清除能力達到峰值91.92%，紅甜菜提取物清除DPPH 自由基能力的最佳反應(yīng)時間為30 min，樣品濃度在100～10 000μg/mL內(nèi)，對DPPH 自由基的清除能力先增后減，在濃度為4 mg/mL 時清除能力最佳（圖3B）。

2.2.3 ABTS+自由基清除能力

如圖3C 所示，在Trolox 標準品質(zhì)量濃度20～220 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。紅甜菜水提物濃度為100～10 000 μg/mL，時間在0～20 min 內(nèi)隨著濃度的增加，對ABTS+自由基清除能力逐漸增強，最高達83.79%，即對ABTS+自由基最高清除能力最佳反應(yīng)時間為20 min。

2.3 紅甜菜抗氧化活性與甜菜紅素間相關(guān)性分析

以FRAP、DPPH和ABTS三個指標檢測紅甜菜中甜菜紅素含量與抗氧化活性的相關(guān)性。相關(guān)性分析（表1）表明，甜菜紅素含量與抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.965～0.995。

表1 紅甜菜抗氧化活性與甜菜紅素含量相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between antioxidant activity and betacyanin content in red beet

3 討論

本研究測定的目的材料中，甜菜紅素的含量為2.53%，相對含量較高。眾多研究表明，紅甜菜體內(nèi)具有抗氧化功能的活性物質(zhì)為：甜菜紅素、花青素、甜菜多糖等，其中甜菜紅素為主要功能活性成分[14]。甜菜紅素的主要成分為5-O-β-葡糖苷，經(jīng)誘導之后能產(chǎn)生泛醌還原酶，其中酚基和環(huán)胺基都能夠作為電子供體，參與生物體的氧化還原反應(yīng)和自由基的清除過程，甜菜紅素的這兩個功能基團是紅甜菜具有抗氧化能力的重要原因[15-16]。甜菜紅素由于具有較強的穩(wěn)定性和抗氧化性能，故作為安全性能較好的生物活性添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域。甜菜紅素的另一種具有抗氧化性能的色素是花青素?；ㄇ嗨厥屈S酮類色素，其中羰基、雙鍵和羥基不僅能夠清除自由基，還能夠捕獲自由基，阻斷自由基反應(yīng)，起到減少生物體內(nèi)自由基的作用。花青素對于自由基的清除能力也是紅甜菜抗氧化性能的重要來源之一[17]。

通過對DPPH、ABTS、FRAP 等自由基的清除測定出紅甜菜提取物的抗氧化能力強于水溶性VE。有研究用高純度的紅甜菜水溶提取物對·OH（羥自由基）和O2·-（超氧陰離子自由基）的清除能力和油脂過氧化的抑制能力，來衡量紅甜菜提取物的抗氧化性能。結(jié)果顯示，紅甜菜提取物的各種抗氧化性能均強于VC[18]。使用H2O2體系作為抗氧化評價指標，低濃度的紅甜菜提取物對H2O2有較好的清除能力，在一定范圍內(nèi)的清除能力強于抗壞血酸；并且隨著濃度的增加，清除能力顯著增加[19]。上述眾多試驗的研究結(jié)果與本研究一致：紅甜菜提取物具有較強抗氧化性，在一定范圍內(nèi)，紅甜菜的抗氧化能力隨著提取物濃度的增大而升高，即甜菜抗氧化能力與提取物濃度具呈劑量—效應(yīng)關(guān)系。

生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、積累與細胞衰老、癌癥以及心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，故自由基的清除和抗氧化功能產(chǎn)品的研發(fā)是當下研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)紅甜菜提取物在體外具有較強的活性氧清除能力，因此作為天然的抗氧化劑，紅甜菜在食用和藥用方面，具有廣闊的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

總的來說，紅甜菜樣品內(nèi)的甜菜紅素含量可以用于甜菜紅素的提取。隨著紅甜菜水提物濃度的增加，可以反映總抗氧化能力的FRAP 值也隨之增大；4 mg/mL的紅甜菜水提物，在30 min 內(nèi)清除DPPH 自由基效果高達91.92%；對ABTS+自由基的清除能力也隨著紅甜菜提取物濃度的增加而逐漸增強，最高達83.79%。因此，在一定范圍內(nèi)，甜菜紅素含量與抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)。可以推斷，紅甜菜的抗氧化能力隨著其活性成分含量的增加而升高，作為其主成分的甜菜紅素在體外有較好的抗氧化效果。