添加甘蔗糖蜜對湖泊紅球藻及其蝦青素合成的影響

韓玉瑩，林港華，代容春，楊賜珠，薛婷，陳由強(qiáng)，何文錦

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福州 350117）

0 引言

海洋微藻已被作為各類生物反應(yīng)器廣泛研究，用于合成高價(jià)值的天然活性化合物，包括天然色素、天然多不飽和脂肪酸和活性蛋白質(zhì)等[1-3]。湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris,H.lacustris）是綠藻門紅球藻屬的淡水單細(xì)胞微藻，生活史可分為營養(yǎng)生長期、包囊期、成熟期和萌發(fā)期。光照40μmol/(m2·s)、pH=8.8、生長溫度(20±1)℃是湖泊紅球藻最佳生長條件[4]；它還是一種光敏性微藻，在強(qiáng)光照射及其他脅迫條件下易積累蝦青素，提高自身抗逆能力，并可作為天然蝦青素的來源，具有很好的發(fā)展前景。

蝦青素是廣泛存在于自然界中的類胡蘿卜素含氧衍生物，分子式C40H52O4，分子結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵及不飽和酮基、羥基，因此極易與自由基反應(yīng)進(jìn)而清除自由基，具有很強(qiáng)的抗氧化性。除此之外，天然蝦青素還具有抗炎、抗癌和抗增殖作用，可提高常規(guī)化療藥物在皮下腫瘤細(xì)胞中的效率。蝦青素純品為暗紅棕色粉末，易溶于二氯甲烷、丙酮等多種有機(jī)溶劑[5-7]。當(dāng)今市場中蝦青素主要來源于天然產(chǎn)物的提取和人工化學(xué)合成兩種途徑，其中化學(xué)合成為主要生產(chǎn)方式，但化學(xué)合成的蝦青素在抗氧化活性與穩(wěn)定性較差且生物安全性低[8]。所以人工合成的蝦青素尚未被批準(zhǔn)作為食品添加劑直接用于人類使用[9]。綠藻門的湖泊紅球藻被認(rèn)為是自然界中生產(chǎn)天然蝦青素最好的生物之一，其蝦青素含量高，且以左旋結(jié)構(gòu)為主，可很好地發(fā)揮其生物功效[10]。海洋微藻合成的天然蝦青素安全性高，應(yīng)用范圍廣，需求量大，可被用于化妝品、保健品等領(lǐng)域。

BG11培養(yǎng)基是一種應(yīng)用比較廣泛的淡水藻培養(yǎng)基，通常用來培養(yǎng)淡水藍(lán)藻、綠藻和原生動(dòng)物，適用范圍廣泛。通常情況下，培養(yǎng)基未添加碳源，可根據(jù)不同海藻的習(xí)性特點(diǎn)，添加適合的碳源以促進(jìn)其生長。

甘蔗糖蜜是制糖工業(yè)將壓榨出的甘蔗汁液，經(jīng)加熱、中和、沉淀、過濾、濃縮、結(jié)晶等制糖工序后剩下的黑褐色濃稠液體，是制糖業(yè)的副產(chǎn)品之一。甘蔗糖蜜組分多樣，營養(yǎng)豐富，含有大量的發(fā)酵糖（蔗糖），還含有豐富的生物素、有機(jī)酸及各種礦質(zhì)元素，可制作飼料添加劑、充當(dāng)發(fā)酵輔料，也可作為微生物培養(yǎng)基的復(fù)合碳源等[11-15]。利用糖蜜進(jìn)行微藻的培養(yǎng)，相較于葡萄糖等來說，可以大幅度降低成本；同時(shí)廢物利用，不但綠色環(huán)保，更具有良好的生態(tài)環(huán)境效益[16-18]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

湖泊紅球藻藻種H5 購于武漢水生所，經(jīng)純化鑒定，保種于本實(shí)驗(yàn)室。糖蜜購自廣西柳州市金黔灣糖蜜有限公司。高效液相色譜儀HPLC 2695，Sun Fire C18250×4.6/5μm（18600 2560）色譜柱以及配套保護(hù)柱，購自美國Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糖蜜預(yù)處理

糖蜜為深褐色粘稠半流動(dòng)液體，需要對糖蜜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方法參照陳建楠甘蔗糖蜜預(yù)處理方法[19]。預(yù)處理后糖蜜溶液為淺褐色液體，對吸光值測定有影響，測定前將其稀釋至10-4接近無色。通過紫外分光光度計(jì)測定470 nm波長時(shí)的吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出糖蜜溶液的總糖含量。

1.2.2 苯酚硫酸定糖法測定糖蜜總糖含量

采用苯酚-硫酸法制備葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置20、40、60、80、100μg/mL 五個(gè)濃度梯度，通過紫外分光光度計(jì)，分別檢測每個(gè)濃度的3組樣品，在波長為470 nm時(shí)的吸光值，得到線性方程：

1.2.3 藻種培養(yǎng)

第一階段：正常光照下湖泊紅球藻的生長擴(kuò)繁培養(yǎng)階段。對照組為BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天搖瓶2 次。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度40μmol/(m2·s)，溫度（20±1）℃，光照周期12 h∶12 h，每組6個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組為在BG11培養(yǎng)基中分別添加總糖含量為0.5、1、1.5 g/L 的糖蜜（TM）或葡萄糖（G）進(jìn)行培養(yǎng)，每天搖瓶2 次。培養(yǎng)條件同對照組一致。每組6 個(gè)重復(fù)。第二階段：高光條件湖泊紅球藻積累蝦青素培養(yǎng)階段。當(dāng)湖泊紅球藻進(jìn)入快速生長時(shí)期，將對照組與試驗(yàn)組的每一濃度3 個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)移至高光下，培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度150μmol/(m2·s)，溫度（20±1）℃，光照周期12 h∶12 h，每天搖瓶2次。

1.2.4 湖泊紅球藻細(xì)胞密度與干重測定

利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算湖泊紅球藻細(xì)胞密度。先稱量10 mL 離心管的管重，在超凈臺中準(zhǔn)確吸取10 mL均勻的湖泊紅球藻培養(yǎng)液至稱量好管重的離心管中，4 ℃、8 000 r/min，離心10 min，用蒸餾水洗滌2 次，離心后棄上清，先置于-80 ℃12 h，再冷凍干燥48 h，稱量此時(shí)離心管重量，得出湖泊紅球藻干重。

1.2.5 蝦青素的提取與檢測

利用HPLC對1、2、5、10、20 μg/mL五個(gè)濃度梯度的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測，得到線性方程：

湖泊紅球藻蝦青素的提取方法參考國標(biāo)GB/T 31520-2015[20]。檢測蝦青素的高效液相色譜條件參數(shù)為：檢測器PDA；流動(dòng)相甲醇∶去離子水＝95∶5（V∶V），超聲波脫氣；流速1 mL/min;檢測波長474 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃。

目前,我國老年腦梗塞患者比較普遍,其作為腦血管病癥中常見一種,導(dǎo)致其發(fā)病因素為腦組織缺血缺氧、腦部血流供應(yīng)障礙而引發(fā)的有關(guān)腦部供血區(qū)域出現(xiàn)壞死、軟化,進(jìn)而致使神經(jīng)功能損傷,該疾病的發(fā)病率和死亡率較高,一旦未及時(shí)進(jìn)行治療,則會導(dǎo)致患者留下后遺癥,影響其身體健康和生活質(zhì)量[1]。本文研究選取本社區(qū)的60例老年腦梗塞患者,對其分別采取單一舒血寧和依達(dá)拉奉并用方式,探究其治療成效?，F(xiàn)將詳細(xì)探究內(nèi)容進(jìn)行如下報(bào)告。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻細(xì)胞生長的影響

在正常光照強(qiáng)度40μmol/(m2·s)，培養(yǎng)至45 d時(shí)，對照組藻細(xì)胞生長量達(dá)到最大，為8.44×106個(gè)/mL，而添加0.5 g/L糖蜜或葡萄糖試驗(yàn)組的藻細(xì)胞在培養(yǎng)至45 d時(shí)，藻細(xì)胞生長量達(dá)到最大，分別為8.90×106個(gè)/mL和9.44×106個(gè)/mL。從圖1A 可見，與對照組相比，糖蜜或葡萄糖試驗(yàn)組都對湖泊紅球藻的生長有顯著的促進(jìn)作用，不但可獲得更高的藻細(xì)胞生長量，也有更長的藻細(xì)胞增殖期。不同總糖濃度的糖蜜或葡萄糖試驗(yàn)組中，低糖濃度培養(yǎng)基也都比高糖濃度培養(yǎng)基更有利于湖泊紅球藻的生長，能獲得更高的藻細(xì)胞密度。相同總糖濃度的葡萄糖培養(yǎng)基比糖蜜培養(yǎng)基更有利于促進(jìn)藻細(xì)胞的增殖。

圖1 正常光照強(qiáng)度（A）和高光照強(qiáng)度（B）下不同濃度糖蜜或葡萄糖對湖泊紅球藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effects of different concentrations of molasses or glucose on the cell density of H.lacustris under normal light intensity(A)and high light stress(B)

2.2 高光脅迫下不同濃度糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻細(xì)胞密度的影響

在150μmol/(m2·s)高光照強(qiáng)度培養(yǎng)下，對照組和試驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)基本穩(wěn)定不再快速增長狀態(tài)，并逐漸衰亡。圖1B 顯示高光培養(yǎng)條件不適合湖泊紅球藻生物量的增長，而且會抑制藻細(xì)胞的生長。從圖1B可見，與對照組相比，添加糖蜜或葡萄糖培養(yǎng)基，都比對照組更有利于維持藻細(xì)胞的活性。不同總糖濃度的糖蜜或葡萄糖培養(yǎng)基，低糖濃度培養(yǎng)基也都比同組的高糖濃度培養(yǎng)基更有利于維持藻細(xì)胞活性。由此可知，高光培養(yǎng)條件不利于藻細(xì)胞增殖生長，藻細(xì)胞比正常培養(yǎng)條件更早進(jìn)入衰亡期。

2.3 不同濃度糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻合成蝦青素的影響

在高光照150μmol/(m2·s)培養(yǎng)的第20 d、25 d 和30 d，總糖0.5 g/L 的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)下湖泊紅球藻細(xì)胞的蝦青素含量分別為10.04 mg/L、12.62 mg/L 和11.88 mg/L，顯著高于對照組和相同總糖濃度的葡萄糖試驗(yàn)組（如圖2A），分別是對照組的1.38 倍、1.82 倍和1.86 倍，分別是相同濃度葡萄糖培養(yǎng)基的1.66 倍、2.06 倍和1.33 倍。由此可見，添加低濃度糖蜜作為碳源有利于湖泊紅球藻蝦青素的積累，結(jié)合藻細(xì)胞生長情況分析，低濃度糖蜜培養(yǎng)基既有利于維持藻細(xì)胞活性，又有利于藻細(xì)胞中蝦青素的積累。為獲得較高含量的蝦青素，可在糖蜜濃度0.5 g/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)第25 d進(jìn)行提取。

2.4 添加不同濃度糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻干重的影響

在光照150μmol/(m2·s)培養(yǎng)的第20 d、25 d 和30 d，總糖0.5 g/L的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)下的湖泊紅球藻細(xì)胞干重為16.8 mg/L、28.3 mg/L和30.8 mg/L（如圖2B），分別是對照組的1.14 倍、1.31 倍和1.81倍。就總體趨勢而言，總糖0.5 g/L 的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)下的細(xì)胞干重顯著高于對照組和相同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基，分別是相同濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)下藻細(xì)胞干重的0.99 倍、1.39 倍和1.80 倍?？梢娞砑拥蜐舛忍敲蹫樘荚从欣谠黾雍醇t球藻的細(xì)胞干重。

圖2 不同濃度糖蜜或葡萄糖對湖泊紅球藻蝦青素含量（A）及湖泊紅球藻干重（B）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of molasses or glucose on astaxanthin content(A)and dry eight(B)of H.lacustris

3 討論與結(jié)論

湖泊紅球藻是一種光合自養(yǎng)，能合成天然強(qiáng)抗氧化活性物質(zhì)——蝦青素的淡水單細(xì)胞綠藻。本試驗(yàn)以BG11 培養(yǎng)基為對照組，以在BG11 培養(yǎng)基中添加糖蜜或葡萄糖為試驗(yàn)組培養(yǎng)湖泊紅球藻，研究不同培養(yǎng)條件對湖泊紅球藻細(xì)胞生長及代謝活性物質(zhì)——蝦青素積累的影響。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基添加糖蜜或葡萄糖低濃度碳源，有利于促進(jìn)湖泊紅球藻細(xì)胞的增殖，生長速率加快，生物量得到顯著提高。該結(jié)果與前人試驗(yàn)所得結(jié)論相似[21]，同樣具有參考價(jià)值。我們還發(fā)現(xiàn)，添加低濃度糖蜜或葡萄糖碳源更有利于保持藻細(xì)胞活力，而且低濃度的糖蜜有顯著促進(jìn)藻細(xì)胞積累蝦青素的作用。

本實(shí)驗(yàn)室也通過在f/2培養(yǎng)基中添加糖蜜或葡萄糖來培養(yǎng)三角褐指藻，結(jié)果顯示添加糖蜜的培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻，其生長量、巖藻黃素含量、總脂肪酸含量、EPA 含量均有所提高，并且同樣是低濃度的糖蜜具有促進(jìn)作用（待發(fā)表）。王紹杰等人在分批發(fā)酵試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了底物糖蜜流加補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果顯示，酵母菌的代謝產(chǎn)物麥角甾醇產(chǎn)量與生產(chǎn)效率均有顯著提高[22-25]。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.5 g/L的糖蜜或葡萄糖時(shí)，湖泊紅球藻的生長量、合成蝦青素含量都比BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)的湖泊紅球藻的含量有顯著提高。葡萄糖和糖蜜作為碳源相比，低濃度葡萄糖培養(yǎng)基對促進(jìn)藻細(xì)胞生長的作用略優(yōu)于糖蜜培養(yǎng)基，而低濃度糖蜜培養(yǎng)基比葡萄糖培養(yǎng)基能更顯著地促進(jìn)藻細(xì)胞在高光脅迫下合成蝦青素。為使湖泊紅球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大，可在培養(yǎng)基中分別添加0.5 g/L的糖蜜和葡萄糖，同時(shí)在培養(yǎng)的第45 d 進(jìn)行收獲。為獲得較高含量的蝦青素，可在糖蜜濃度0.5 g/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)第25 d進(jìn)行提取。

通過前人的研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素的合成受蝦青素合成酶系基因psy和crtZ的調(diào)控，在施加醋酸鈉、硫酸亞鐵和強(qiáng)光照射等有效的蝦青素誘導(dǎo)條件下，表達(dá)水平上升[26-29]。在GRUNEWALD 等[30]的試驗(yàn)中也觀察到，蝦青素合成酶基因pds和crtO的基因轉(zhuǎn)錄水平在脅迫誘導(dǎo)下均上調(diào)。本試驗(yàn)在高光照培養(yǎng)下，有可能誘導(dǎo)藻細(xì)胞蝦青素合成酶系基因的表達(dá)水平，試驗(yàn)結(jié)果顯示，同時(shí)添加低濃度糖蜜后，能顯著促進(jìn)湖泊紅球藻細(xì)胞活性和藻細(xì)胞蝦青素積累量。由此我們猜測，糖蜜中含有多種生物活性因子，與高光培養(yǎng)條件共同作用，有可能調(diào)控藻細(xì)胞蝦青素合成酶系基因的活性，最終達(dá)到蝦青素的大量積累。

雖然甘蔗糖蜜是蔗糖工業(yè)的廢棄物，但它是海藻養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)碳源。而且價(jià)格遠(yuǎn)低于葡萄糖。所以將生產(chǎn)廢棄物糖蜜作為海藻培養(yǎng)基碳源添加物，既可降低生產(chǎn)成本，又可獲得高附加值的天然生物活性物質(zhì)，變廢為寶，環(huán)保節(jié)能，是實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益和社會效益兼顧雙贏的利用方法。