糖料作物抗氧化酶基因應(yīng)答非生物脅迫的研究進(jìn)展

李金娜，李海英

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

糖料作物主要有甘蔗、甜菜、甜高粱和甜葉菊等。在我國北方糖料作物以甜菜為主，南方以甘蔗為主[1-2]。甘蔗是重要的糖料作物，我國食糖總產(chǎn)量90%左右來自甘蔗，近幾年甜菜糖產(chǎn)量有增加趨勢，2019/2020 年榨季以來，甜菜糖產(chǎn)量占全國食糖產(chǎn)量的13%以上[3]。甜葉菊生產(chǎn)的甜菊糖苷，因甜度較高且具有一定的保健作用，作為糖料作物的補(bǔ)充，在我國的南北方均有種植[4]。甜高粱還原糖和淀粉含量較高，目前多用于能源作物的開發(fā)應(yīng)用，因其生長速度快、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)也被廣泛種植[5]。糖料作物是制糖工業(yè)的原料作物，也是生物能源的良好原料。糖料作物的一些次生代謝產(chǎn)物如甜菜素等可以作為食品添加劑和化妝品的著色劑，因此糖料作物是地方發(fā)展特色工業(yè)，拉動區(qū)域經(jīng)濟(jì)增長的優(yōu)勢作物。由于不同的地理位置和氣候條件，糖料作物和其他農(nóng)作物一樣經(jīng)常會遭受不同逆境脅迫（生物脅迫和非生物脅迫），非生物脅迫通常作為植物減產(chǎn)的主要因素而備受研究人員的廣泛關(guān)注，全球約5%的土地受到鹽漬化的影響[6]；每年非生物脅迫造成植物6%～20%的損失[7]。植物遭受非生物脅迫后，體內(nèi)的活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除處于不平衡狀態(tài)，加劇了植物體內(nèi)活性氧積累，從而對植物造成不同程度的傷害，嚴(yán)重的甚至?xí)鹬参镂杷劳?。為了穩(wěn)定這種平衡，植物體內(nèi)形成有效的活性氧（ROS）清除機(jī)制，包括酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)兩種[8-9]，其中酶促抗氧化系統(tǒng)是清除活性氧的主要途徑，酶促抗氧化系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等活性的高低是衡量植物是否抵抗非生物脅迫的重要指標(biāo)[10]。近年來，全球變暖、水資源短缺越發(fā)突顯，致使非生物脅迫加劇[7]，因此了解和掌握糖料作物抗氧化酶相關(guān)基因應(yīng)答非生物脅迫對我國糖料作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆品種的培育具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 非生物脅迫誘發(fā)植物活性氧的積累與清除途徑

1.1 非生物脅迫

非生物脅迫主要包括鹽堿、干旱、熱、冷等脅迫。非生物脅迫嚴(yán)重危害植物生長及生存。越來越多的研究表明非生物脅迫對植物造成傷害的重要原因之一是使植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)量增加，清除能力降低，使植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生與清除平衡遭到破壞，導(dǎo)致植物體代謝紊亂、衰老甚至死亡。非生物脅迫造成的初級脅迫主要為滲透脅迫和離子脅迫，滲透脅迫使質(zhì)膜通透性增加，致使細(xì)胞內(nèi)離子和有機(jī)質(zhì)外滲，離子脅迫減少植物對鉀離子的吸收，使植物容易缺乏PO43-和Ca2+。由初級脅迫引發(fā)的次級脅迫主要為氧化脅迫，氧化脅迫導(dǎo)致膜脂過氧化程度升高，膜的結(jié)構(gòu)與功能改變[10]。

1.2 植物在非生物脅迫下活性氧（ROS）的積累途徑

越來越多的研究表明，非生物脅迫對植物造成的損害最終都會產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）積累，非生物脅迫誘發(fā)活性氧（ROS）積累包括以下4 種途徑[10-13]：（1）葉綠體光電子傳遞鏈中活性氧（ROS）的積累；（2）線粒體呼吸鏈電子的漏出引發(fā)活性氧（ROS）的積累；（3）過氧化物酶體中光呼吸途徑乙醇酸氧化生成乙醛酸引發(fā)活性氧（ROS）的積累；（4）細(xì)胞其他部位代謝過程活性氧（ROS）的積累，例如質(zhì)膜中NADPH 氧化酶可產(chǎn)生活性氧（ROS），因此植物在不同非生物脅迫下活性氧（ROS）積累途徑也不盡相同。

鹽脅迫產(chǎn)生細(xì)胞活性氧（ROS）途徑比較廣泛，如光合電子傳遞、光呼吸過氧化氫（H2O2）釋放、呼吸電子傳遞和酶活性。酶類包括葡萄糖氧化酶、黃嘌呤氧化酶，特別是植物過氧化物酶（POD）和NADPH 氧化酶。最重要的是質(zhì)膜結(jié)合NADPH氧化酶（RBOH），它決定性地控制鹽脅迫下細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[14]。

干旱脅迫產(chǎn)生細(xì)胞活性氧（ROS）途徑主要包括線粒體呼吸鏈電子的漏出引發(fā)活性氧（ROS）的積累，葉綠體光電子傳遞鏈中活性氧（ROS）的積累和過氧化物酶體中光呼吸途徑乙醇酸氧化生成乙醛酸引發(fā)活性氧（ROS）的積累。在大田環(huán)境中，干旱脅迫經(jīng)常與高溫脅迫協(xié)同發(fā)生，也是實(shí)際生產(chǎn)中最常見的一種雙重脅迫，當(dāng)植物遭受干旱脅迫時，植物體內(nèi)電子供需不平衡，在線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和細(xì)胞壁中會產(chǎn)生大量活性氧（ROS），引起氧化脅迫[15]。氧化脅迫會破壞許多膜蛋白和酶的空間構(gòu)型，使膜透性增加和離子泄漏，影響植物正常的生理生化功能，嚴(yán)重時會引起植物死亡[16-17]。高溫脅迫造成活性氧（ROS）積累的途徑主要是膜損傷和脂膜透性增加[18]。

低溫脅迫產(chǎn)生細(xì)胞活性氧（ROS）途徑主要包括質(zhì)膜中NADPH 氧化酶可產(chǎn)生ROS和葉綠體光電子傳遞鏈中ROS 的積累，低溫脅迫下植物脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）大量積累，會使膜系統(tǒng)嚴(yán)重受損；同時ROS的產(chǎn)生與PSⅠ的光抑制密切相關(guān)，低溫脅迫引起PSⅠ產(chǎn)生過氧化物和單線態(tài)氧，從而引起PSⅠ的光抑制傷害，因此活性氧（ROS）的產(chǎn)生與PSⅠ的光抑制密切相關(guān)[18-21]。

1.3 植物在非生物脅迫下活性氧（ROS）的清除途徑

為了應(yīng)對非生物脅迫所引發(fā)的氧化脅迫，植物在長期進(jìn)化過程中形成了完善的抗氧化系統(tǒng)（圖1）[17]，抗氧化系統(tǒng)可以通過酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ROS水平，從而防止ROS引起的脂膜過氧化及其他傷害。酶促抗氧化系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）等13 種酶；非酶促抗氧化系統(tǒng)主要包括抗壞血酸（AsA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素（Car）和生育酚（VE）等物質(zhì)（圖1A）[22]。酶促抗氧化系統(tǒng)為植物提供高效而專一的ROS清除體系（圖1B）[23-25]，因此對抗氧化酶基因應(yīng)答非生物脅迫的研究具有重要意義。

圖1 植物抗氧化系統(tǒng)（A）、酶促抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)途徑（B）Fig.1 The antioxidant system(A)and the pathways of enzymatic antioxidant enzyme system,and non-enzymatic antioxidant system(B)in plant

2 非生物脅迫下糖料作物抗氧化酶相關(guān)基因的研究進(jìn)展

截止到目前，國內(nèi)外研究人員對糖料作物如甘蔗、甜菜、甜高粱和甜葉菊的抗氧化酶相關(guān)基因應(yīng)答非生物脅迫下的研究主要集中抗氧化酶活性分析及表達(dá)模式分析等方面，而對其功能驗(yàn)證研究較少。

2.1 非生物脅迫下甘蔗抗氧化酶相關(guān)基因響應(yīng)研究進(jìn)展

在甘蔗中，目前研究人員對干旱和低溫非生物脅迫下的抗氧化酶相關(guān)基因應(yīng)答進(jìn)行了研究（表1）。王盛[26]對甘蔗中銅/鋅超氧化物歧化酶基因（Cu/Zn-SOD）進(jìn)行克隆并進(jìn)行了低溫、鹽、干旱和H2O2四種非生物脅迫應(yīng)答模式分析，研究發(fā)現(xiàn)4 種非生物脅迫均誘導(dǎo)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)，同時將甘蔗Cu/Zn-SOD基因轉(zhuǎn)入煙草中，但遺憾的是沒有對Cu/Zn-SOD基因轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)答非生物脅迫進(jìn)行功能驗(yàn)證，不過為以后研究Cu/Zn-SOD基因與非生物脅迫的關(guān)系及甘蔗抗逆育種奠定了基礎(chǔ)。

表1 甘蔗抗氧化酶基因應(yīng)答非生物脅迫主要研究內(nèi)容Table 1 Main research data of antioxidant enzyme system’s genes responseto abiotic stress in sugarcane

SALES[27]等人研究了超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）可提高干旱和低溫條件下甘蔗植株光合作用的恢復(fù)能力，通過對抗旱基因型‘IACSP94-2094’和敏感基因型‘IACSP97-7065’甘蔗進(jìn)行光合及抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)測定，結(jié)果表明，抗旱基因型‘IACSP94-2094’含有較高的SOD 和APX 酶活力，‘IACSP94-2094’抗氧化能力較強(qiáng)。同時‘IACSP94-2094’在干旱和低溫條件下可以單獨(dú)或協(xié)同維持植物生長。研究結(jié)果顯示SOD 和APX 高活性與甘蔗植株在同時發(fā)生干旱和低溫的嚴(yán)重脅迫后光合作用的完全恢復(fù)有關(guān)。

張保青[28]等人對甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因ScAPX1進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，研究發(fā)現(xiàn)隨著低溫（0～4℃）脅迫時間的延長，2個甘蔗基因型ScAPX1的表達(dá)量均是先上升后下降，但表達(dá)量存在差異，在整個脅迫過程中，抗寒性強(qiáng)基因型‘GT28’的表達(dá)量始終比抗寒性弱基因型‘YL6’高。甘蔗ScAPX1積極響應(yīng)低溫逆境脅迫，該基因的誘導(dǎo)表達(dá)與甘蔗基因型本身的抗寒性密切相關(guān)。該研究為深入研究甘蔗APX1在低溫脅迫中的功能及甘蔗抗寒育種的分子機(jī)理提供依據(jù)。

2.2 非生物脅迫下甜菜抗氧化酶相關(guān)基因響應(yīng)研究進(jìn)展

很多研究人員對甜菜抗氧化酶相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，不同基因型甜菜應(yīng)答鹽、干旱、水分等非生物脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證以及對抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因之間潛在的聯(lián)系進(jìn)行驗(yàn)證及分析（表2），為甜菜抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因響應(yīng)非生物脅迫中的功能及甜菜抗非生物脅迫的分子機(jī)理提供依據(jù)。

表2 甜菜抗氧化酶基因應(yīng)答非生物脅迫主要研究內(nèi)容Table 2 Main research data of antioxidant enzyme system’s genes response to abiotic stress in sugar beet

溫麗[29]通過模擬水分脅迫條件，測定分析了不同抗旱基因型甜菜體內(nèi)活性氧（ROS）代謝系統(tǒng)的動態(tài)變化和重要保護(hù)酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，結(jié)果表明抗旱性強(qiáng)的甜菜基因型體內(nèi)SOD基因表達(dá)量大于抗旱性弱的基因型，但SOD基因的表達(dá)量與水分脅迫強(qiáng)度之間不存在相關(guān)關(guān)系；POD基因表達(dá)量多少與POD 酶活性變化呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。該研究從活性氧（ROS）代謝系統(tǒng)的動態(tài)變化及重要保護(hù)酶基因在轉(zhuǎn)錄水平方面闡明了甜菜抗旱生理生化機(jī)制，為甜菜抗旱生理基礎(chǔ)研究及選育抗旱新品種提供理論依據(jù)。

趙晨曦[30]對甜菜‘M14’品系硫氧還蛋白過氧化物酶（Tpx）應(yīng)答鹽脅迫及氧化脅迫基因功能進(jìn)行研究，通過構(gòu)建BvM14-Tpx基因的酵母菌表達(dá)體系，測定轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因的酵母菌體的生長曲線，驗(yàn)證BvM14-Tpx基因能夠緩解H2O2和NaCl對大腸桿菌生長的抑制。同時該研究將BvM14-Tpx基因通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)入到擬南芥突變株中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因的擬南芥突變株能夠使其具有與野生型擬南芥植株對鹽及氧化脅迫的抵御能力。

蔣德生[31-34]等人研究甜菜‘M14’品系葉片中參與脅迫和防御的活性氧（ROS）清除機(jī)制中抗氧化酶系統(tǒng)7 種主要酶乙醇酸氧化酶（GOX）、過氧還蛋白（PrxR）、硫氧還蛋白（Trx）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）及過氧化氫酶（CAT）。發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，BvM14-GOX、BvM14-PrxR、BvM14-Trx、BvM14-DHAR、BvM14-MDHAR、BvM14-APX及BvM14-CAT基因在甜菜‘M14’品系中應(yīng)答鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量更高，因此甜菜‘M14’品系具備更強(qiáng)的抗氧化酶活性。為進(jìn)一步探究抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因的調(diào)控作用，將抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)鍵基因進(jìn)行耐鹽功能的鑒定及評價，確定了甜菜耐鹽抗氧化酶的關(guān)鍵基因及其抗氧化協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終闡明了甜菜‘M14’品系高效應(yīng)答鹽脅迫的抗氧化酶調(diào)控機(jī)制。

HOSSAIN[35]等人研究了甜菜耐鹽馴化中的氧化還原活性氧途徑，在轉(zhuǎn)錄水平上研究了氧化還原和活性氧（ROS）網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。首先在甜菜基因組中鑒定了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物氧化蛋白（Prx）、交替氧化酶（AOX）、質(zhì)體末端氧化酶（PTOX）和NADPH 氧化酶（RBOH）的基因家族。鹽脅迫可以誘導(dǎo)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD3、所有AOX 亞型、2-Cys-PrxB、PrxQ和PrxIIF基因的積累。而Fe-SOD1、1-Cys-Prx、PrxIIB和PrxIIE基因表達(dá)量則隨著鹽度的增加而降低。為了深入了解抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的調(diào)控，研究人員分析了甜菜抗氧化酶相關(guān)基因的啟動子順式元件。該結(jié)果表明，甜菜抗氧化酶基因啟動子中特殊的順式元件參與調(diào)節(jié)氧化還原和活性氧（ROS）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是提高甜菜耐高鹽性的基礎(chǔ)。

2.3 非生物脅迫下甜高粱抗氧化酶相關(guān)基因響應(yīng)研究進(jìn)展

糖料作物甜高粱中目前只有一篇碩士論文對抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)性分析。李俊付[36]研究甜高粱在不同水分脅迫下及不同發(fā)育階段對水分虧缺所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，重點(diǎn)進(jìn)行了水分脅迫下甜高粱抗氧化酶的活性分析測定，同時對主要抗氧化酶基因進(jìn)行了定量表達(dá)模式分析，結(jié)果表明，不同生育時期超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）基因的表達(dá)量不同，不同水分脅迫處理下甜高粱POD基因表達(dá)量無顯著差異；SOD基因的表達(dá)差異比較明顯。說明抗氧化酶系統(tǒng)參與了甜高粱水分脅迫響應(yīng)，對甜高粱在干旱脅迫應(yīng)答具有潛在的調(diào)節(jié)保護(hù)作用。該研究旨在找出甜高粱在非生物脅迫下的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

2.4 非生物脅迫下甜葉菊抗氧化酶相關(guān)基因響應(yīng)研究進(jìn)展

在糖料作物甜葉菊中，研究人員對抗氧化酶相關(guān)基因應(yīng)答鹽、干旱等非生物脅迫的表達(dá)模式和酶活性進(jìn)行分析。繩仁立[37]對5 個甜葉菊品種耐鹽堿進(jìn)行研究，通過結(jié)合膜系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性等對其耐鹽機(jī)理進(jìn)行測定分析。該研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶系統(tǒng)酶活性較高的基因型具有較強(qiáng)的耐鹽堿性，為甜葉菊在抗旱、抗寒、抗鹽等領(lǐng)域的育種研究奠定基礎(chǔ)。

CANTABELLA[38]等人從礦質(zhì)營養(yǎng)、抗氧化代謝和甜菊糖苷含量的影響對甜葉菊的耐鹽機(jī)制進(jìn)行探討，研究發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，在短期鹽脅迫條件下，甜葉菊可通過誘導(dǎo)不同的抗氧化機(jī)制來嚴(yán)格控制活性氧（ROS）的生成。例如，在第16 d 觀察到抗氧化酶（APX、POX、CAT、SOD）以及AsA-GSH 循環(huán)的其他酶顯著增加，表明甜葉菊植株在這個階段具有平衡的抗氧化能力；但是在長期鹽脅迫條件下，AsA-GSH 循環(huán)酶發(fā)生失衡，主要表現(xiàn)為APX、DHAR和GR 的酶活性下降，而MDHAR的酶活性顯著增加。該研究結(jié)果表明，甜葉菊能夠誘導(dǎo)短時間（16 d）鹽脅迫或維持長時間（25 d）鹽脅迫的抗氧化酶來應(yīng)對鹽脅迫帶來的損傷。

3 總結(jié)與展望

糖料作物應(yīng)答非生物脅迫條件下積累過量的活性氧（ROS），因此，植物體對活性氧（ROS）的清除是必不可少的。本文通過綜述國內(nèi)外近10 年對不同糖料作物抗氧化酶相關(guān)基因應(yīng)答在非生物脅迫酶活性和應(yīng)答非生物脅迫表達(dá)模式的研究，發(fā)現(xiàn)研究集中在超氧化物歧化酶（SOD）基因和抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因，因?yàn)镾OD 是活性氧（ROS）清除途徑中的第一個關(guān)鍵酶，APX 是該途徑的第二個重要酶[39]，因此近年來很多研究人員對編碼抗氧化酶SOD基因和APX基因提高糖料作物抗非生物脅迫做了大量研究。

在整個抗氧化系統(tǒng)中，關(guān)于抗氧化酶編碼基因SOD、APX、CAT、MDHAR、GR等應(yīng)答非生物脅迫表達(dá)模式及其對應(yīng)酶活性有較多研究，然而，對抗氧化酶編碼基因還有愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（GPX）基因、多酚氧化酶（PPO）等基因功能沒有深入研究。

其次，抗氧化酶基因之間相互作用是否能夠提高植物的抗非生物脅迫值得進(jìn)一步研究和探討。

最后，活性氧（ROS）清除系統(tǒng)不僅僅通過酶促抗氧化系統(tǒng)單一因素來緩解非生物脅迫帶來的損害，還需要與非酶促抗氧化系統(tǒng)如抗壞血酸（AsA）基因和還原型谷光甘肽（GSH）基因協(xié)同調(diào)節(jié)植物體內(nèi)活性氧（ROS）水平，從而防止活性氧（ROS）引起的脂膜過氧化及其他傷害。

因此，糖料作物未來的研究更應(yīng)該將酶促抗氧化系統(tǒng)基因和非酶促抗氧化系統(tǒng)基因在逆境脅迫下同步分析，為糖料作物抗逆生理基礎(chǔ)研究及選育抗逆新品種提供理論依據(jù)。