從腸道菌群改變探討青磚茶對非酒精性脂肪肝的預(yù)防作用

周婷婷，陳桂婷，曹楠，何建剛，何功威，肖長義,，李世剛,*

從腸道菌群改變探討青磚茶對非酒精性脂肪肝的預(yù)防作用

周婷婷1，陳桂婷1，曹楠1，何建剛2，何功威2，肖長義1,2，李世剛1,2*

1. 三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002；2. 湖北長盛川青磚茶研究所，湖北 宜昌 443000

通過腸道菌群改變研究青磚茶（GBT）對小鼠非酒精性脂肪肝（NAFLD）的預(yù)防作用。C57BL/6小鼠隨機分為5組，即正常對照組（NC），模型對照組（MC），陽性藥物對照組（PC）以及青磚茶低劑量組（LD）、高劑量組（HD），高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立NAFLD模型，同時預(yù)防性給予低、高劑量青磚茶水提取物和陽性藥物血脂康，分別測定小鼠的體重、食物利用率、肝重、肝指數(shù)、TC、LDL-C/HDL-C及ALT含量，HE染色和油紅O染色觀察肝組織病理切片，ELISA檢測肝組織IL-1、IL-18含量變化，16?S rDNA V3-V4區(qū)高通量測序分析腸道菌群變化，Spearman相關(guān)性分析方法分析菌群與NAFLD表型的相關(guān)性。與模型組比較，青磚茶組小鼠體重、食物利用率、肝重、肝指數(shù)、血清TC、LDL-C/HDL-C、ALT、肝組織TC、IL-1、IL-18含量均有顯著性降低，肝臟病變程度有所改善；腸道菌群分析及相關(guān)性分析顯示物種豐度降低，且與NAFLD表型呈正相關(guān)，、、物種豐度增加，且與NAFLD表型呈負相關(guān)，與NAFLD表型相關(guān)性最強的菌群為和。青磚茶對NAFLD具有一定的預(yù)防作用，其作用可能與影響腸道菌群的改變有關(guān)。

腸道菌群；非酒精性脂肪肝；青磚茶；高通量測序；相關(guān)性分析

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精或病毒等明確的肝損傷因素引起的，以肝臟脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)為主要特征的營養(yǎng)代謝性疾病，包括單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌[1]。目前，NAFLD全球患病率約為25%[2]，隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，特別是高脂食物的大量攝入，NAFLD發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅人類健康，已成為全球主要公共衛(wèi)生問題之一。

目前，NAFLD的確切發(fā)病機制尚不清楚，除了經(jīng)典的“二次打擊”[3]、“多重打擊”學說[4]外，近年來隨著深入研究，“腸-肝軸”理論得到廣泛的關(guān)注，腸道和肝臟通過門靜脈直接關(guān)聯(lián)，腸道菌群失調(diào)會導致腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加，腸道菌群及代謝物會轉(zhuǎn)移到肝臟并引發(fā)相應(yīng)的炎癥免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)會導致NAFLD的發(fā)生和進展[5-6]。腸道菌群與NAFLD具有一定的相關(guān)性，但與NAFLD有關(guān)的腸道菌群具體種類及其明確的相關(guān)關(guān)系仍需進一步探究。

青磚茶（Green brick tea，GBT）是中國特種黑茶，屬于后發(fā)酵茶，主產(chǎn)于湖北省鄂南地區(qū)，是中國西北高寒地帶以及高脂飲食地區(qū)少數(shù)民族人民的生活必需品[7]，近年來，隨著其獨特的品質(zhì)特征及保健功效被人們所認知，越來越多的內(nèi)陸消費者開始關(guān)注、品飲青磚茶，其不僅具有生津解渴的效果，還具有抑菌、減肥、降脂、抗氧化、改善胃腸道功能等功效[8-9]。動物試驗研究表明，青磚茶能有效降低大鼠血脂，改善脂質(zhì)代謝，增強機體抗氧化能力，減輕高脂對肝細胞的損傷[10]；臨床研究顯示，青磚茶可以改善2型糖尿病患者的胰島素抵抗和血脂代謝紊亂[11]，但其具體作用機理尚不清楚。本研究以高脂飲食建立小鼠NAFLD模型，研究青磚茶對NAFLD的預(yù)防作用，探討其作用是否與腸道菌群有關(guān)，以期為青磚茶的降脂保肝作用提供一定的理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠，6～7周齡，雄性，購于三峽大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（鄂）2017-0012。

1.1.2 藥品與試劑

高脂飼料購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，許可證號：蘇飼證（2014）01008；青磚茶水提物由湖北長盛川青磚茶研究所提供，提取率為(10±5)%；血脂康購于北京北大維信生物科技有限公司；總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；白介素-1（Interleukin-1，IL-1）、白介素-18（Interleukin-18，IL-18）試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit購于OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒購于Life公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 劑量設(shè)計

成人茶葉推薦劑量為9.0?g·d-1，成人身體質(zhì)量按60?kg計，即單位體質(zhì)量的茶葉推薦劑量為0.15?g·kg-1，選擇人體推薦量的5、20倍為小鼠的低、高劑量[12]，青磚茶的水提物提取率按10%計算，則低、高劑量分別為75、300?mg·kg-1。陽性藥物血脂康劑量為成人（60?kg）每日用藥10?mg·kg-1，換算為小鼠的劑量，即為90?mg·kg-1[13]。

1.2.2 分組與給藥方案

60只雄性C57BL/6小鼠在試驗環(huán)境下（溫度20～25℃，相對濕度45%～65%及12?h/12?h光暗循環(huán)）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。按照體重隨機分為5組，即正常對照組（NC）、模型對照組（MC）、陽性藥物對照組（PC）、青磚茶低劑量組（LD）、青磚茶高劑量組（HD），其中NC飼喂普通飼料，其他4組均喂高脂飼料，各組小鼠均自由飲用純凈水。采用預(yù)防模型，同時給藥與飼喂高脂飼料，LD組和HD組分別灌胃75?mg·kg-1和300?mg·kg-1的青磚茶水提物（均用純凈水新鮮配制）；PC組灌胃90?mg·kg-1的血脂康；NC組和MC組均灌胃等量純凈水，每只小鼠按0.01?mL·g-1灌胃，每周灌胃4次，連續(xù)14周。試驗期間觀察每組動物飲水、糞便、毛發(fā)、活動等情況，每周記錄攝食量和體重。

1.2.3 常規(guī)指標檢測

每周記錄攝食量（g）和體質(zhì)量（g），試驗結(jié)束時稱量肝臟質(zhì)量（g），計算肝指數(shù)。攝食量=給食量－剩食量；食物利用率=體質(zhì)量增量/總食物攝入量×100%；肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.4 組織形態(tài)學觀察

分別取小鼠肝右葉同一位置少量組織，置于4%多聚甲醛固定液中固定48?h，常規(guī)石蠟包埋，切片，用于HE染色；分別取少量小鼠肝組織，蔗糖溶液脫水，OCT包埋，冰凍切片，用于油紅O染色，顯微鏡下觀察肝組織的脂肪堆積和炎癥反應(yīng)情況。

1.2.5 生化指標檢測

血樣經(jīng)4℃下3?000?r·min-1離心15?min，分離出血清樣本，分裝凍存于–80℃用于后續(xù)試驗。稱取100?mg肝組織，加入1?mL裂解液，用生物樣品均質(zhì)器勻漿，離心，取上清液即為肝組織勻漿上清液。血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transferase，ALT）和肝組織上清TC按試劑盒說明書要求進行測定。

1.2.6 肝組織IL-1、IL-18含量變化

稱取一定量肝組織，按質(zhì)量體積比1︰12加入預(yù)冷的PBS，再加入少量蛋白酶抑制劑，勻漿，離心，取上清液，按ELISA試劑盒說明書要求測定，IL-1、IL-18含量。

1.2.7 腸道菌群變化

每組隨機選取3只小鼠，用酒精棉簽刺激小鼠肛門促其排便，分別用高壓滅菌后的離心管儲存每只小鼠的糞便，全程保證無菌，用于16?S rDNA基因高通量測序分析。按照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒步驟提取細菌DNA，采用16?S rDNA基因V3-V4區(qū)特異性引物[341F（正向引物）：CCTACGGGNGGCWGCAG，805R（反向引物）：GACTACHVGGGTATCTAATCC]進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，擴增完成后進行產(chǎn)物純化，利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，每個樣品DNA量取10?ng，采用Illumina Miseq 2×300?bp平臺進行高通量測序，最終上機測序濃度為20?pmol，測序數(shù)據(jù)平均為40?000條。對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，序列預(yù)處理之后得到靶區(qū)域序列，使用Usearch軟件（5.2.236版本），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，使用R語言根據(jù)各樣本OTU豐度計算多樣性距離矩陣作主成分分析（Principal component analysis，PCA）圖；采用RDP classifier和Blast對OTU序列進行分類學分析，比對RDP數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）和Silva數(shù)據(jù)庫（www.arb-silva.de），從而對每個OTU進行物種分類，再利用R語言對物種注釋結(jié)果進行可視化展示；利用LEfSe分析尋找組間差異菌群。

1.2.8 腸道菌群與NAFLD相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)性分析方法分析腸道菌群與NAFLD表型間的相關(guān)性，其中差異菌群為LEfSe分析得到的差異菌群，NAFLD表型為血清TC、LDL-C/HDL-C、ALT、肝組織TC、IL-1、IL-18，利用R語言和Cytoscape軟件作相關(guān)分析可視化熱圖和網(wǎng)絡(luò)圖，相關(guān)分析熱圖展示了按至少有一個相關(guān)性<0.05和/或至少有一個相關(guān)系數(shù)||>0.5的標準篩選后所有符合標準的數(shù)據(jù)，相關(guān)分析網(wǎng)絡(luò)圖僅展示<0.05，且||>0.5的相關(guān)菌群。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠體重、食物利用率、肝指數(shù)變化

如圖1所示，各組小鼠給藥前體重差異不明顯，經(jīng)過14周喂養(yǎng)后，模型組體重最高，增重最多，較正常對照組差異顯著（<0.01），陽性對照組次之，青磚茶低、高劑量組增重較小，與模型組比較有顯著性差異（<0.01）。

各組小鼠平均進食量無明顯差異，食物利用率模型組最大，而青磚茶低、高劑量組相對較?。▓D2-A和圖2-B），說明青磚茶減輕小鼠體重不是由于減少攝食量引起的。與正常對照組比較，模型組肝重顯著增加（<0.01），肝指數(shù)最大，與模型組比較，青磚茶高劑量組肝重顯著降低，肝指數(shù)顯著減小（<0.01，圖2-C和圖2-D）。試驗結(jié)果說明青磚茶可以有效抑制小鼠體重和肝重的增加，以及肝指數(shù)增大。

注：NC：正常對照組，MC：模型對照組，PC：陽性藥物對照組（血脂康90?mg·kg-1），LD：青磚茶低劑量組（75?mg·kg-1），HD：青磚茶高劑量組（300?mg·kg-1）。n=8，±SD，與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。下同

2.2 各組小鼠肝組織病理切片

HE染色結(jié)果（圖3）顯示，正常對照組小鼠的肝細胞界限分明，細胞核清晰，胞漿均勻，肝索排列整齊，肝竇結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠的肝細胞大小不一，細胞界限不清，部分細胞出現(xiàn)腫脹，肝索排列出現(xiàn)紊亂，肝竇變小，肝細胞胞漿有圓形空泡，同時伴有炎癥浸潤；陽性藥物組小鼠及青磚茶干預(yù)組小鼠肝臟病理有不同程度改善。油紅O染色結(jié)果（圖4）顯示，模型組小鼠肝組織有大量脂滴存在，陽性藥物及青磚茶干預(yù)組有所改善。這些結(jié)果表明高脂飲食可以引起小鼠肝細胞脂肪變性和炎癥，青磚茶可有效預(yù)防高脂飲食誘導的脂肪肝的發(fā)生。

圖2 各組小鼠食物利用率和肝指數(shù)

2.3 各組小鼠生化指標變化

如圖5和圖6所示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC、LDL-C、ALT和肝組織TC含量均顯著增高（<0.01），HDL-C含量有所降低，但無統(tǒng)計學意義（>0.05），而LDL-C/HDL-C顯著性增高（<0.01）；與模型組比較，陽性藥物組小鼠血清TC顯著性降低（<0.05），LDL-C/HDL-C、肝組織TC水平極顯著性降低（<0.01），青磚茶干預(yù)組小鼠血清TC、LDL-C/HDL-C、ALT和肝組織TC含量均極顯著性降低（<0.01）。這些結(jié)果表明，青磚茶能有效調(diào)節(jié)小鼠的脂質(zhì)代謝平衡，降低血脂，改善高脂小鼠的肝功能，減輕肝組織受損的程度。

2.4 各組小鼠肝組織IL-1β、IL-18含量變化

由圖7可見，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織IL-1、IL-18含量均極顯著增高（<0.01）；與模型組比較，陽性藥物組及青磚茶干預(yù)組上述指標均極顯著降低（<0.01）。結(jié)果表明，14周高脂飲食可以引起小鼠肝臟產(chǎn)生炎癥，青磚茶可有效改善炎癥的發(fā)生。

2.5 腸道菌群變化分析

通過對各組小鼠糞便中的16?S rDNA基因V3-V4區(qū)進行高通量測序，主成分分析結(jié)果顯示青磚茶干預(yù)組小鼠腸道菌群的整體分布與模型組小鼠明顯不同（圖8）?；诜诸悓W分析結(jié)果，青磚茶干預(yù)組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐度與模型組小鼠有明顯區(qū)別（圖9和圖10）。LEfSe分析結(jié)果顯示，屬水平差異菌群有4種，即、、和（圖11），其中，與正常對照組比較，模型組小鼠物種豐度增加，、、物種豐度降低；與模型組比較，干預(yù)組小鼠物種豐度降低，、、物種豐度增加（圖12）。

圖4 油紅O染色結(jié)果（×400）

圖5 血清和肝組織中TC濃度變化

圖6 血清中LDL-C/HDL-C和ALT變化

圖7 肝組織中IL-1β和IL-18含量變化

圖8 主成分分析3D圖和2D圖

圖9 屬水平各組群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖10 屬水平物種豐度熱圖

圖11 LEfSe分析環(huán)形樹狀圖

注：n=3，±SD。與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。A：各組小鼠擬桿菌屬菌群豐度變化，B：各組小鼠乳桿菌屬菌群豐度變化，C：各組小鼠擬普雷沃菌屬菌群豐度變化，D：各組小鼠Saccharibacteria_genera_incertae_sedis菌群豐度變化

2.6 腸道菌群變化與NAFLD表型相關(guān)性分析

腸道菌群與NAFLD表型相關(guān)分析可視化結(jié)果見圖13和圖14，NAFLD表型與呈正相關(guān)，與、、呈負相關(guān)，其中，相關(guān)性最強的菌群為和。

3 討論

NAFLD為非酒精因素引起的肝臟代謝綜合征，常以高脂飲食誘導動物模型模擬人類NAFLD發(fā)病機制。本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)青磚茶對HepG2細胞脂肪變性具有改善作用[14]，在此基礎(chǔ)上，本研究以14周高脂飲食誘導小鼠NAFLD模型并予以青磚茶干預(yù)，試驗結(jié)果顯示，模型組小鼠體重、肝重均顯著性升高，食物利用率、肝指數(shù)最大，病理切片顯示脂肪堆積和炎癥浸潤，血清TC、LDL-C/HDL-C、ALT、肝組織TC、IL-1、IL-18含量均有顯著性升高，表明模型組造模成功，而青磚茶干預(yù)組小鼠體重、肝重均有顯著性降低，食物利用率、肝指數(shù)較小，肝臟脂質(zhì)沉積與炎癥反應(yīng)有所改善，血清TC、LDL-C/HDL-C、ALT、肝組織TC、IL-1、IL-18含量均有顯著性降低，說明青磚茶可有效預(yù)防NAFLD的發(fā)生及進展。

圖13 相關(guān)分析熱圖

圖14 相關(guān)分析網(wǎng)絡(luò)圖

目前，NAFLD確切發(fā)病機制尚不清楚。近年來腸道菌群成為研究熱點，作為與宿主存在共生關(guān)系包含1?000～1?500種約10～100萬億細菌的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，約為人體基因組的150倍，人類腸道菌群主要包括厚壁菌、擬桿菌、放線菌以及少量的變形桿菌[15-16]。正常情況下，菌群間、菌群與宿主間存在一個動態(tài)平衡，當平衡出現(xiàn)紊亂，就會引起多種疾病的發(fā)生，越來越多文獻報道腸道菌群與NAFLD有關(guān)[17-18]。解剖結(jié)構(gòu)上腸道和肝臟通過門靜脈直接關(guān)聯(lián)，腸道菌群紊亂會直接影響肝臟，即通過“腸-肝軸”促進NAFLD的發(fā)生和進展[19]。本研究探究與NAFLD相關(guān)的腸道菌群以及青磚茶對其的影響，結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度與正常對照組比較有明顯不同，而青磚茶可有效調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的變化，使之趨于正常對照組，分析找到4種屬水平差異菌群，其中，模型組物種豐度增加，、、物種豐度降低，而青磚茶干預(yù)組物種豐度降低，、、物種豐度增加。4種屬水平差異菌群與NAFLD表型作相關(guān)分析顯示，與NAFLD表型正相關(guān)，、、與NAFLD表型呈負相關(guān)，其中，相關(guān)性最強的菌群為和。有研究報道，與健康個體相比，NAFLD患者中擬桿菌數(shù)量增加，厚壁菌數(shù)量減少[20]，另有研究表明，攝取乳酸桿菌，如嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌，可以通過降低膽固醇來改善非酒精性脂肪變性的發(fā)展[21]，本試驗研究結(jié)果與這些相關(guān)研究報道一致。

腸道菌群促進NAFLD發(fā)展的機制主要包括：（1）腸道菌群紊亂會導致機體對游離脂肪酸的吸收增加及產(chǎn)熱減少，最終引起儲存的脂肪量增加，引起肥胖；（2）腸道菌群紊亂會改變腸道黏膜通透性，有害菌尤其是革蘭氏陰性菌增多，引起脂多糖-內(nèi)毒素-TLRs介導炎癥反應(yīng)；（3）腸道菌群通過其代謝產(chǎn)物介導NAFLD：如增加短鏈脂肪酸；參與膽堿代謝；調(diào)節(jié)膽汁酸代謝；增加內(nèi)源性乙醇量等[22-24]。本課題后期試驗將研究腸道菌群代謝產(chǎn)物膽汁酸與NAFLD的關(guān)系，探究腸道菌群的改變引起的代謝產(chǎn)物膽汁酸產(chǎn)生的變化與NAFLD的內(nèi)在聯(lián)系。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與NAFLD表型呈正相關(guān)，與NAFLD表型呈負相關(guān)，青磚茶干預(yù)后物種豐度降低，物種豐度增加，青磚茶通過影響腸道菌群變化對NAFLD具有一定的預(yù)防作用，這為青磚茶的實際應(yīng)用提供了一定的試驗依據(jù)，然而這些差異菌群參與NAFLD的發(fā)病機制還需通過更多的動物及臨床糞便移植研究進一步驗證，以期腸道菌群作為代謝性疾病潛在的診斷工具和治療靶點成為現(xiàn)實。

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Preventive Effect of Green Brick Tea on Non-alcoholic Fatty Liver Disease via Gut Microbiota Changes

ZHOU Tingting1, CHEN Guiting1, CAO Nan1, HE Jiangang2,HE Gongwei2, XIAO Changyi1,2, LI Shigang1,2*

1. Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China; 2. Changshengchuan Green-brick Tea Research Institute of Hubei Province, Yichang 443000, China

The preventive effect of green brick tea (GBT) on the mouse non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) model was studied by affecting changes in gut microbiota.C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups, including normal control group (NC), model control group (MC), positive drug control group (PC), low-dose group (LD) and high-dose group (HD) of GBT. A NAFLD model was established by feeding mice with high-fat diet, and supplemented with low and high doses of GBT water extract and positive drug (Xuezhikang) respectively. The body weight, food utilization efficiency, liver weight, liver index, TC, LDL-C/HDL-C and ALT contents of mice were determined. Liver tissue pathological sections were observed by HE staining and Oil Red O staining. ELISA method was used to detect changes of IL-1and IL-18 in liver tissue. The changes of gut microbiota were analyzed by high-throughput sequencing in 16?S rDNA V3-V4 region, and Spearman's correlation analysis method was used to analyze the correlation between gut microbiota and NAFLD phenotype. Compared with the model control group, the body weight, food utilization efficiency, liver weight, liver index, serum TC, LDL-C/HDL-C, ALT, liver tissue TC, IL-1, and IL-18 contents of mice in the GBT group were significantly reduced, and the degree of liver disease was improved. Gut microbiota analysis and correlation analysis show that the species abundance ofdecreased, and it was positively correlated with the NAFLD phenotype. The species abundance of,, andincreased, and they were negatively correlated with the NAFLD phenotype.andhad the strongest correlation with NAFLD phenotype.Green brick tea has a certain preventive effect on NAFLD, and its effect may be related to the changes in gut microbiota.

gut microbiota, NAFLD, green brick tea, high-throughput sequencing, correlation analysis

S571.1；Q946.84+1

A

1000-369X(2021)05-669-12

2021-02-05

2021-04-23

湖北省區(qū)域創(chuàng)新發(fā)展科技專項（2020BGC015）、宜昌市科技研究與開發(fā)項目（A21-1-075）、三峽大學學位論文培優(yōu)基金資助項目（2020SSPY112）

周婷婷，女，碩士，主要從事中藥有效性與安全性評價方面的研究。*通信作者：fox201@163.com

（責任編輯：趙鋒）