茶樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子CsWRKY17的克隆與表達(dá)分析

劉苗苗，臧連生，孫曉玲，周忠實(shí)，葉萌*

茶樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆與表達(dá)分析

劉苗苗1,2，臧連生1，孫曉玲2，周忠實(shí)3*，葉萌2*

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所，吉林 長(zhǎng)春 130118；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100094

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在調(diào)節(jié)植物的抗蟲(chóng)防御反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，目前抗蟲(chóng)相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究還主要集中于草本植物中，木本植物中的研究還十分滯后，仍有大量WRKY未被發(fā)掘與鑒定。以茶樹(shù)龍井43為試驗(yàn)材料，克隆了1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為。研究發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)序列為1?141?bp，包含1個(gè)987?bp的開(kāi)放閱讀框，編碼328個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域分析表明，基因具有1個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ亞家族。同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CsWRKY17與擬南芥的AtWKRY11和AtWRKY17同源關(guān)系最近。此外，具有明顯的組織表達(dá)特異性，并可被機(jī)械損傷、茶尺蠖取食或模擬取食、茉莉酸（JA）等外用激素處理誘導(dǎo)表達(dá)。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證實(shí)定位在細(xì)胞核中。綜上結(jié)果表明，在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，并很可能通過(guò)調(diào)節(jié)JA、脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BR）和赤霉素（GA）等信號(hào)通路來(lái)調(diào)控茶樹(shù)對(duì)植食性昆蟲(chóng)的誘導(dǎo)防御反應(yīng)。研究結(jié)果為深入解析WRKY轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)蟲(chóng)害相關(guān)信號(hào)通路中的作用打下基礎(chǔ)，同時(shí)為茶樹(shù)抗蟲(chóng)基因挖掘和抗蟲(chóng)品種選育提供了理論依據(jù)和參考。

茶樹(shù)；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；；表達(dá)分析；抗蟲(chóng)防御

植物在遭受植食性昆蟲(chóng)為害時(shí)，會(huì)迅速啟動(dòng)防御相關(guān)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而合成與防御相關(guān)的化合物以抵御蟲(chóng)害[1-4]。其中，轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）在植物的抗蟲(chóng)防御信號(hào)調(diào)控中起著十分關(guān)鍵的作用[2,5-8]。轉(zhuǎn)錄因子又稱為反式作用因子，是一類能夠通過(guò)與靶基因（如抗蟲(chóng)化合物合成酶基因）啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件相結(jié)合，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白[9-10]。植物中含有很多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，其中一些超家族擁有上百個(gè)成員基因，如MYB、WRKY、AP2/ERF、bHLH、bZIP、C2H2和NAC家族等[6,11-14]。WRKY TFs是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，目前已在擬南芥（）中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)70個(gè)WRKY成員，水稻（）中也發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)WRKY成員[15-17]。

研究表明，WRKY TFs家族成員均含有一段約60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，N末端含有WRKYGQK核心序列，具有高度保守性，其家族命名即來(lái)源于此；C端通常為C2H2或C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)，主要介導(dǎo)WRKY TFs與目的DNA序列的特異性結(jié)合[16,18]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY家族又被分為3個(gè)亞家族：第Ⅰ亞家族包含2個(gè)保守WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2（Cx4-5Cx22-23HxH）型鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅱ亞家族包含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅲ亞家族則包含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2HC（Cx7Cx23HxC）型鋅指結(jié)構(gòu)[17-18]。有報(bào)道表明，WRKY不僅可以結(jié)合目的基因啟動(dòng)子中的W-box（TTGACC/T）直接激活或者抑制防御信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，還可以與其他WRKY相互作用來(lái)間接調(diào)節(jié)植物的免疫和防御[19-20]。

WRKY TFs在植物應(yīng)對(duì)蟲(chóng)害脅迫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如Skibbe等[21]在野生煙草（）中鑒定到2個(gè)蟲(chóng)害響應(yīng)基因和，單獨(dú)或同時(shí)沉默和均提高了煙草對(duì)煙草天蛾（）的敏感性。Yao等[22]也在煙草中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)受煙粉虱（）取食誘導(dǎo)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子、和，沉默這3個(gè)基因會(huì)顯著地增加煙粉虱的存活時(shí)間和產(chǎn)卵量。此外，水稻中的和均能正調(diào)控水稻體內(nèi)胰蛋白酶抑制劑的含量，從而增強(qiáng)水稻對(duì)二化螟（）的抗性[23-24]。有意思的是，擬南芥中的受蚜蟲(chóng)取食為害誘導(dǎo)表達(dá)后，能有效降低桃蚜（）的取食難度，縮短其口針刺入維管束的時(shí)間，因而負(fù)調(diào)控植物的防御反應(yīng)，使植物變得更易感蚜蟲(chóng)[25]。盡管WRKY在植物抗蟲(chóng)防御中的重要性已經(jīng)被逐步證實(shí)，然而目前有關(guān)WRKY對(duì)植物抗蟲(chóng)防御調(diào)控作用的研究還主要集中在水稻、擬南芥、煙草等草本植物中，木本植物中抗蟲(chóng)相關(guān)的WRKY還鮮有報(bào)道。因此，挖掘和鑒定木本植物中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)深入解析WRKY的抗蟲(chóng)調(diào)控機(jī)理、拓寬人們對(duì)植物-昆蟲(chóng)互作機(jī)制的理解具有重要意義。

茶樹(shù)（）是一種重要的多年生木本經(jīng)濟(jì)作物，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常常受到多種害蟲(chóng)的為害，對(duì)茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成巨大影響。因此，明確茶樹(shù)蟲(chóng)害脅迫響應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)理、挖掘茶樹(shù)抗蟲(chóng)相關(guān)基因，對(duì)今后選育茶樹(shù)抗蟲(chóng)品種具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。然而，茶樹(shù)中有關(guān)WRKY TFs的研究還主要集中于其對(duì)低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫的抗性調(diào)控方面[26-30]，目前僅通過(guò)克隆鑒定發(fā)現(xiàn)了基因可能參與了茶樹(shù)抗蟲(chóng)防御反應(yīng)[31]，還有大量蟲(chóng)害脅迫響應(yīng)相關(guān)的WRKY TFs未被發(fā)掘和報(bào)道?；诖耍狙芯恳札埦?3為試驗(yàn)材料，克隆獲得了1個(gè)新的茶樹(shù)WRKY基因，并利用生物信息學(xué)分析了該基因的結(jié)構(gòu)、理化特征以及進(jìn)化關(guān)系等。此外，還進(jìn)一步明確了該基因在細(xì)胞中發(fā)揮功能的位置，以及不同處理下的表達(dá)特征。本研究為深入解析WRKY在茶樹(shù)蟲(chóng)害相關(guān)信號(hào)通路中的作用打下基礎(chǔ)，同時(shí)為茶樹(shù)抗蟲(chóng)基因的挖掘和抗蟲(chóng)品種的選育提供了理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以2年生龍井43盆栽苗為供試茶苗，預(yù)培養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所玻璃溫室大棚內(nèi)。試驗(yàn)前挑選生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的茶苗轉(zhuǎn)移至人工氣候室[溫度(26±2)℃，光周期L∶D=12∶12，相對(duì)濕度70%～80%]，恢復(fù)培養(yǎng)3～4?d后用于后續(xù)試驗(yàn)。

茶尺蠖（）幼蟲(chóng)采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園，于人工氣候室內(nèi)[溫度(26±2)℃，光周期L∶D=14∶10，相對(duì)濕度65%～75%]用幼嫩的龍井43茶樹(shù)葉片進(jìn)行飼喂和種群繁殖。室內(nèi)穩(wěn)定馴養(yǎng)兩代后，選取大小相近且健康活躍的二齡幼蟲(chóng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 基因克隆

基于茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出基因的轉(zhuǎn)錄本序列，經(jīng)NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）確認(rèn)其具有完整的開(kāi)放閱讀框。運(yùn)用Primer Blast設(shè)計(jì)該基因全長(zhǎng)特異性引物-F和-R（表1）。以茶尺蠖為害6?h后的茶樹(shù)葉片cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶KOD FX（TOYOBO）擴(kuò)增全長(zhǎng)片段，PCR反應(yīng)總體系為20?μL，反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 3?min；98℃ 10?s，60℃ 30?s，68℃ 90?s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5?min。擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后在紫外燈下切割，并使用膠回收試劑盒（Thermo GeneJET Gel Extraction Kit）對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，然后將其連入-Blunt Zero 載體（TRANSGEN BIOTECH）并轉(zhuǎn)化至-T1感受態(tài)細(xì)胞中，用通用引物M13-F/R（表1）對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定、保存，并送浙江尚亞生物科技有限公司測(cè)序。

表1 引物信息

1.3 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用在線軟件ProtParam（http://web.expa sy.org/protparam）分析蛋白理化性質(zhì)；運(yùn)用Softberry（http://softberry.com）進(jìn)行氨基酸序列分析；使用TBtools軟件尋找目的基因在茶樹(shù)染色體上的位置；在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中下載其他同源蛋白序列，在MEGA 7.0軟件中采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（參數(shù)：poisson mode，complete delection，boostrap=1?000）；在DNAMAN中進(jìn)行多序列比對(duì)；采用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)蛋白三維結(jié)構(gòu)，并用Pymol軟件編輯輸出。

1.4 茶苗處理

1.4.1 茶尺蠖幼蟲(chóng)取食（Eo）處理

選取大小一致的頂芽下第二葉位葉片，處理組接入10頭二齡茶尺蠖幼蟲(chóng)，并用透明網(wǎng)袋罩住取食葉片防止幼蟲(chóng)逃逸；對(duì)照組用相同網(wǎng)袋罩住葉片。待害蟲(chóng)取食葉片有明顯缺刻時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在處理1.5、3、6、12、24、36、48?h后剪取為害葉片，迅速浸入液氮中。設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.2 機(jī)械損傷（W）和機(jī)械損傷疊加茶尺蠖唾液（W+OS）處理

選取大小基本一致的頂芽下第二葉位葉片，用鋸齒滾輪于主葉脈兩側(cè)各損傷2道（間距0.5?cm），并立即在損傷部位涂抹雙蒸水（每片葉20?μL），作為W處理；在損傷部位涂抹茶尺蠖唾液（每片葉20?μL），作為W+OS處理；不做任何處理的茶樹(shù)葉片作為對(duì)照。分別在處理1.5、3、6?h后剪取為害葉片，迅速浸入液氮中。設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.3 植物激素處理

茉莉酸（JA）處理：將適量JA溶解于少量無(wú)水乙醇中，然后用50?mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 8.0）配成濃度為150?μg·mL-1的溶液（含0.02%吐溫20），每株茶苗噴施JA稀釋液10?mL，以噴施10?mL磷酸緩沖液（含0.02%吐溫20）的茶苗為對(duì)照。分別在處理0.5、1.5、3、6、12、24、48?h后剪取頂芽下第二葉位葉片，迅速浸入液氮中。設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

油菜素內(nèi)酯（BR）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）處理方法如下：用蒸餾水分別配置100?nmol·L-1BR、100?μmol·L-1ABA、10?μmol·L-1GA、100?μmol·L-1SA、200?mg·L-1ET的溶液，每株茶苗噴施處理液10?mL，以噴施10?mL蒸餾水（含0.02%吐溫20）的茶苗為對(duì)照。處理24?h后剪取頂芽下第二葉位葉片，迅速浸入液氮中。設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.4 不同組織處理

選取生長(zhǎng)狀況相近的開(kāi)花期茶樹(shù)，分別取根、莖、葉、花等4個(gè)組織，剪取樣品后迅速浸入液氮中。設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

1.6 亞細(xì)胞定位

利用Exnase Ⅱ重組酶（Vazyme Biotech）將基因克隆至pBI121-GFP載體上，構(gòu)建pBI121--GFP融合表達(dá)載體，隨后轉(zhuǎn)入DH5感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定、保存，并送浙江尚亞生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，用含有卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）抗性的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定和保存。

取少量上述保存菌液接入5?mL含有Kan和Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200?r·min-1活化，隨后按1∶50稀釋到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含Kan和Rif，10?mmol·L-1MES，20?μmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.6）中28℃、200?r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌液并棄去上清液，用浸潤(rùn)液（pH 5.7）重懸，將OD600調(diào)至1.0左右。室溫靜置3?h后，選取4～5葉期的本氏煙（），每株注射約1?mL菌液，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。室溫正常條件下培養(yǎng)2?d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況。以pBI121-GFP空載體注射的本氏煙作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析原理，利用SPSS 18.0（Chicago Illinois State USA）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)或方差分析（LSMeans進(jìn)行多重比較）對(duì)的誘導(dǎo)表達(dá)水平進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsWRKY17的克隆與序列分析

以茶尺蠖為害6?h后的茶樹(shù)葉片cDNA為模板，擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約1?100?bp的特異性條帶。對(duì)該條帶進(jìn)行純化回收并連入-Blunt Zero載體后測(cè)序，得到的序列與轉(zhuǎn)錄組序列完全匹配。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blastn分析，發(fā)現(xiàn)其與茶樹(shù)基因組預(yù)測(cè)的（GeneBank: XM_028257290.1）序列相似度達(dá)99.91%?？寺～@得的序列全長(zhǎng)1?141?bp，包含987?bp開(kāi)放閱讀框，編碼328個(gè)氨基酸殘基，位于茶樹(shù)第14條染色體上。

2.2 CsWRKY17的生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析

利用ProtParam對(duì)CsWRKY17的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CsWRKY17相對(duì)分子質(zhì)量為35.7?kDa，理論等電點(diǎn)為9.66，共328個(gè)氨基酸，其中絲氨酸（Ser）含量最多，達(dá)到14.9%；包含26個(gè)負(fù)電荷殘基[天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）]，42個(gè)正電荷殘基[精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）]；不穩(wěn)定系數(shù)為50.27，脂溶指數(shù)為62.44，總平均親水性指數(shù)為–0.621，推測(cè)為不穩(wěn)定親水蛋白。

2.2.2結(jié)構(gòu)域及三維結(jié)構(gòu)分析

將CsWRKY17與擬南芥和水稻中WRKY蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，所有序列中均有一段高度保守的結(jié)構(gòu)域，其N端含有1個(gè)典型的WRKYGQK核心序列，C端含有1個(gè)C2-H2型（Cx4-5Cx22-23HXH）鋅指結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為WRKY第Ⅱ亞家族的特征，說(shuō)明CsWRKY17屬于WRKYⅡ家族成員之一（圖1）。進(jìn)一步在SWISS-MODEL上對(duì)CsWRKY17蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，結(jié)果顯示其WRKY結(jié)構(gòu)域由5個(gè)反向平行的折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成，與已報(bào)道的茶樹(shù)CsWRKY3、CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48等蛋白三維結(jié)構(gòu)極其相似[27,31]，說(shuō)明茶樹(shù)WRKY家族結(jié)構(gòu)域的高度保守性。

2.2.3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

為了分析茶樹(shù)CsWRKY17與其他植物同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系，并由此推測(cè)其在茶樹(shù)中可能發(fā)揮的功能，本研究在擬南芥（）、水稻（）小麥（）、棉花（）、大豆（）等代表物種中選取了15個(gè)同為WRKY第Ⅱ亞家族、與CsWRKY17同源性較高且已知生物學(xué)功能的蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）進(jìn)行進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。聚類結(jié)果顯示，茶樹(shù)CsWRKY17與擬南芥AtWRKY17和AtWRKY11聚到一起，親緣關(guān)系最近，而與OsWRKY11、GhWRKY48親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

圖1 茶樹(shù)CsWRKY17蛋白同源比對(duì)

注：擬南芥：AtWRKY7（AT4G24240.1）、AtWRKY11（AT4G31550.1）、AtWRKY17（AT2G24570.1）、AtWRKY15（AT2G23320.1）、AtWRKY74（AT5G28650.1）、AtWRKY39（AT3G04670.1）、AtWRKY6（AT1G62300.1）；水稻：OsWRKY51（LOC_Os04g21950.1）、OsWRKY68（LOC_Os04g51560.1）、OsWRKY25（LOC_Os08g13840.2）、OsWRKY11（LOC_Os01g43650.1）；小麥：TaWRKY53（ALC04270.1）；大豆：GmWRKY13（NP_001237376.2）；棉花：GhWRKY17（ADW82098.1）、GhWRKY39（AGX27510.1）、GhWRKY48（AFB35811.1）

2.3 CsWRKY17表達(dá)模式分析

2.3.1的組織表達(dá)特異性分析

為明確的表達(dá)模式，首先檢測(cè)了茶樹(shù)不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在茶樹(shù)的根、莖、葉、花等組織器官中均有表達(dá)，且具有明顯的組織特異性（圖3）。以茶樹(shù)葉中的表達(dá)量為參照進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)莖中的表達(dá)量?jī)H為葉中的43%，差異顯著；而花中的表達(dá)量與葉中相當(dāng)；在根部的表達(dá)量顯著高于其他組織部位，約為葉的4.75倍（圖3）。上述結(jié)果表明，在茶樹(shù)根部表達(dá)量最高，其次為葉和花，在莖中表達(dá)量最低。

2.3.2對(duì)蟲(chóng)害脅迫的響應(yīng)分析

為探究是否參與茶樹(shù)對(duì)蟲(chóng)害脅迫的響應(yīng)，對(duì)該基因在蟲(chóng)害脅迫下的表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，茶尺蠖幼蟲(chóng)取食顯著上調(diào)的表達(dá)量，且在取食1.5?h后即可誘導(dǎo)，并隨取食時(shí)間的增加，誘導(dǎo)倍數(shù)也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，到36?h和48?h時(shí)達(dá)到頂峰，誘導(dǎo)倍數(shù)為7.66～7.10倍（圖4-A）。由于茶尺蠖幼蟲(chóng)取食過(guò)程中伴隨著機(jī)械損傷和口腔分泌物的雙重作用，為厘清基因究竟受哪一種作用影響，利用機(jī)械損傷疊加茶尺蠖唾液的方式（W+OS）模擬害蟲(chóng)取食處理茶苗，同時(shí)設(shè)置機(jī)械損傷（W）處理和未處理茶苗（Control）兩個(gè)對(duì)照。結(jié)果顯示，在1.5?h時(shí)間點(diǎn)上單獨(dú)W處理即能顯著誘導(dǎo)的表達(dá)，而W+OS處理與W處理相比誘導(dǎo)更為強(qiáng)烈，且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，處理3?h后表達(dá)水平在W處理中已不再上調(diào)，而在W+OS處理中依然顯著上調(diào)（圖4-B）。上述結(jié)果表明，對(duì)蟲(chóng)害的誘導(dǎo)響應(yīng)是機(jī)械損傷和唾液的共同作用，且唾液起主導(dǎo)作用，推測(cè)可能參與了茶樹(shù)對(duì)茶尺蠖的抗性反應(yīng)。

注：圖中不同的小寫(xiě)字母表示各個(gè)處理之間方差分析存在顯著差異（P<0.05）

注：A為茶尺蠖幼蟲(chóng)取食處理；B為茶尺蠖模擬取食處理。*表示處理與對(duì)照相比存在顯著差異（*，P<0.05；**，P<0.01；Student's t-tests）。不同的小寫(xiě)字母表示各個(gè)處理之間方差分析存在顯著差異（P<0.05）。下同

2.3.3對(duì)多種激素的響應(yīng)分析

為進(jìn)一步探究可能介導(dǎo)的防御信號(hào)通路，利用qRT-PCR分析了對(duì)JA、SA、ET、BR、ABA、GA等防御相關(guān)信號(hào)分子的響應(yīng)情況。由于茶尺蠖幼蟲(chóng)取食能夠顯著激活，因此對(duì)與咀嚼式口器昆蟲(chóng)抗性相關(guān)的JA處理進(jìn)行了不同時(shí)間點(diǎn)的詳細(xì)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，JA、ABA、BR和GA處理均能顯著上調(diào)的表達(dá)（圖5-A和5-B），其中JA處理12?h后即可顯著上調(diào)該基因表達(dá)量，并持續(xù)至處理后48?h（圖5-A）；而對(duì)SA和ET處理則無(wú)明顯響應(yīng)（圖5-C），由此推測(cè)可能參與了JA、ABA、BR和GA相關(guān)信號(hào)的作用網(wǎng)絡(luò)。

2.4 CsWRKY17的亞細(xì)胞定位分析

為明確CsWRKY17在細(xì)胞中可能發(fā)揮功能的位置，通過(guò)構(gòu)建pBI121--GFP融合表達(dá)載體，運(yùn)用農(nóng)桿菌侵染法浸潤(rùn)核定位的轉(zhuǎn)基因本氏煙葉片，使目的基因在煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，以pBI121-GFP空載體作為陽(yáng)性對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，空載體在全細(xì)胞中均能觀察到綠色熒光，而融合了后僅在細(xì)胞核中觀察到綠色熒光信號(hào)，且與核定位的轉(zhuǎn)基因煙草中的紅色熒光信號(hào)重疊，呈現(xiàn)黃綠色熒光，說(shuō)明很可能在細(xì)胞核中行使其生物學(xué)功能。

3 討論

WRKY TFs在調(diào)節(jié)蟲(chóng)害誘導(dǎo)的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，然而茶樹(shù)中參與抗蟲(chóng)脅迫的WRKY卻鮮有報(bào)道。本研究克隆獲得了1個(gè)WRKY基因。同源性比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析表明，含有1個(gè)典型WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2型（C-X4-C-X23-HX-H）鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ亞家族；聚類分析結(jié)果表明，CsWRKY17與AtWRKY11和AtWRKY17聚為同一個(gè)分支，關(guān)系最近。Journot-Catalino等[32]研究發(fā)現(xiàn)，AtWRKY11和AtWRKY17參與調(diào)節(jié)擬南芥中生物和非生物脅迫相關(guān)防御過(guò)程，單獨(dú)敲除或同時(shí)敲除和會(huì)顯著增強(qiáng)擬南芥對(duì)病原菌pv的基礎(chǔ)抗性。Ali等[33-34]研究表明，和不僅可以正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)胞囊線蟲(chóng)（）的抗性，還可以正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受力。據(jù)此，我們推測(cè)很可能也在茶樹(shù)應(yīng)對(duì)生物或非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。

注：A為茉莉酸處理；B為油菜素內(nèi)酯、脫落酸和赤霉素處理；C為水楊酸和乙烯處理。BUF表示緩沖液處理

注：將CsWRKY17克隆到pBI121-GFP載體中，空載體作為陽(yáng)性對(duì)照。GFP：綠色熒光蛋白；RFP：紅色熒光蛋白

本研究表明，茶尺蠖取食后，的表達(dá)量從蟲(chóng)害誘導(dǎo)的早期（1.5?h）被顯著誘導(dǎo)并持續(xù)到48?h。同樣地，在受到煙草天蛾幼蟲(chóng)取食時(shí)，煙草中的和會(huì)迅速上調(diào)（15?min左右）[21]；二化螟取食30?min后即會(huì)誘導(dǎo)水稻的表達(dá)[24]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，盡管機(jī)械損傷也能誘導(dǎo)的表達(dá)，但卻明顯低于茶尺蠖唾液處理。機(jī)械損傷和茶尺蠖取食亦能顯著誘導(dǎo)茶樹(shù)中蟲(chóng)害脅迫相關(guān)的[31]。因此，我們推測(cè)參與了茶樹(shù)抗蟲(chóng)反應(yīng)，并且是茶樹(shù)蟲(chóng)害誘導(dǎo)防御反應(yīng)早期的調(diào)節(jié)子。

本研究發(fā)現(xiàn)，JA處理12?h后以及BR、ABA、GA處理24?h后均誘導(dǎo)的表達(dá)。在水稻中，JA處理顯著誘導(dǎo)的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后的會(huì)抑制水稻體內(nèi)JA的含量，從而控制和平衡水稻對(duì)二化螟的防御反應(yīng)[23]。在棉花中，ABA能夠顯著誘導(dǎo)的表達(dá)水平，通過(guò)激活A(yù)BA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受性[35]。同樣地，擬南芥中的WRKY46、WRKY54和WRKY70為BR信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)子，BR處理強(qiáng)烈促進(jìn)這3個(gè)基因的表達(dá)[36]。當(dāng)、、同時(shí)突變后，BR對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)調(diào)控作用消失[36]。有意思的是，GA處理抑制了卷心菜（var.）中的表達(dá)，而能夠與GA合成相關(guān)基因以及啟動(dòng)子中的W-box相結(jié)合，從而抑制這2個(gè)基因的表達(dá)[37]。以上研究均暗示了很可能也是通過(guò)調(diào)節(jié)JA、BR、ABA或GA信號(hào)通路來(lái)調(diào)控茶樹(shù)對(duì)茶尺蠖的防御和抗性。

在茶樹(shù)根、莖、葉和花中均有表達(dá)。其中，根中的表達(dá)量最高，葉片和花中次之。前人研究顯示，WRKY基因的表達(dá)具有組織特異性，例如：抗性基因主要在番茄的根部表達(dá)[38]，主要表達(dá)于水稻的節(jié)間和花穗中[39]。在根中的組成型高表達(dá)以及在葉中受茶尺蠖取食后的誘導(dǎo)表達(dá)，暗示了其可能不僅參與調(diào)節(jié)茶樹(shù)葉片對(duì)蟲(chóng)害的抗性，還可能參與調(diào)節(jié)根對(duì)非生物或生物脅迫的響應(yīng)。

大量研究表明，WRKY TFs能在細(xì)胞核中與靶基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。如在細(xì)胞核中與SA相關(guān)基因、JA相關(guān)基因和的啟動(dòng)子相結(jié)合，調(diào)控水稻中JA和SA的相關(guān)信號(hào)通路以及植株體內(nèi)SA的含量[40]。也定位于細(xì)胞核中，它不僅可以直接結(jié)合GA信號(hào)通路關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子W1、W2和W3區(qū)域以增強(qiáng)的表達(dá)水平，還能夠與SLR1蛋白相互作用來(lái)增加它的穩(wěn)定性，從而抑制水稻體內(nèi)的GA信號(hào)通路[39]。本研究的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核中，并受到JA、BR、ABA、GA等外源激素處理的誘導(dǎo)表達(dá)。因此我們推測(cè)，也很可能在細(xì)胞核中與靶基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控JA、BR、ABA和GA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，但具體的互作靶標(biāo)和調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究從茶樹(shù)中克隆得到轉(zhuǎn)錄因子，并詳細(xì)分析了其物理和化學(xué)特征，探究了在機(jī)械損傷、茶尺蠖為害和不同激素處理下的表達(dá)模式，以及在不同組織器官中的表達(dá)差異性，同時(shí)明確了該基因在細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能的位置，推測(cè)CsWRKY17是蟲(chóng)害誘導(dǎo)防御反應(yīng)的一個(gè)早期調(diào)節(jié)子，并很可能通過(guò)參與調(diào)節(jié)JA、BR、ABA和GA等信號(hào)通路來(lái)調(diào)控茶樹(shù)對(duì)茶尺蠖的抗性反應(yīng)。本研究不僅為深入解析WRKY調(diào)節(jié)植物抗蟲(chóng)防御反應(yīng)的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)，還為茶樹(shù)抗蟲(chóng)新基因的挖掘和茶樹(shù)抗蟲(chóng)品種的遺傳改良提供重要參考和依據(jù)。

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Cloning and Expression Analysis ofTranscription Factor in Tea Plants

LIU Miaomiao1,2, ZANG Liansheng1, SUN Xiaoling2, ZHOU Zhongshi3*, YE Meng2*

1. Institute of Biological Control, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094, China

WRKY transcription factors, a super family of plant transcription factors, play an essential role in the regulation of plant defense responses to herbivores. While the roles of herbivore-related WRKY transcription factors are well established in grass plants, their roles in woody plants are still largely unknown. Here, we cloned a WRKY transcription factor, named.has a full length of 1?141?bp, contains a 987?bp open reading frame, and encodes 328 amino acids. Based on the conserved domain analysis,belongs to the WRKY Ⅱ subfamily, containing one conserved WRKY domain and a typical C2H2-type zinc finger motif. Homology alignment and phylogenetic tree analysis show that CsWRKY17 has the closest relationship with AtWKRY11 and AtWRKY17 in. Moreover,exhibited a tissue specific expression, and was also induced by mechanical wounding, tea geometrid () attack, simulated herbivory, and exogenous phytohormone treatments like JA. Transient expression experiments indicate that it might play a role in the nucleus. Taken together, we proposed thatis a potential regulator of herbivore-induced defense responses against herbivores in tea plants through JA, ABA, GA and BR signaling. Our study paved the way for molecular analysis of herbivore-relatedWRKY genes in tea plants, and provided a good genetic resource and theoretical basis for future studies of pest-resistant genes and breeding of tea plants.

, WRKY transcription factors,, expression analysis, herbivore resistance

S571.1；Q52

A

1000-369X(2021)05-631-12

2021-04-30

2021-06-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31901898）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（1610212019001）

劉苗苗，女，碩士研究生，主要從事植物與昆蟲(chóng)互作研究。*通信作者：zs.zh@126.com；mengye@tricaas.com

（責(zé)任編輯：黃晨）