茯磚茶對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)UC小鼠炎癥及腸道微生物的影響

黃翔翔，譚婷，禹利君,2,3*，王坤波,2,3，黃建安,2,3，徐詩(shī)鈺，劉仲華,2,3*

茯磚茶對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)UC小鼠炎癥及腸道微生物的影響

黃翔翔1，譚婷1，禹利君1,2,3*，王坤波1,2,3，黃建安1,2,3，徐詩(shī)鈺1，劉仲華1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

為研究茯磚茶對(duì)葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）小鼠的抗炎作用及腸道微生物多樣性的影響，將60只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、10?mg·kg-1EGCG對(duì)照組、高劑量茯磚茶（300?mg·kg-1）對(duì)照組、DSS模型組、DSS＋10?mg·kg-1EGCG處理組、DSS＋低劑量茯磚茶（100?mg·kg-1）處理組、DSS＋中劑量茯磚茶（150?mg·kg-1）處理組、DSS＋高劑量茯磚茶（300?mg·kg-1）處理組，對(duì)照組n=5，處理組n=9。DSS造模1周后，灌喂處理4周，試驗(yàn)5周后處死小鼠，觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化，評(píng)估小鼠結(jié)腸炎疾病指數(shù)（Disease activity index，DAI），檢測(cè)小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子水平及小鼠結(jié)腸組織中、基因表達(dá)水平，利用PCR-DGGE、克隆測(cè)序等技術(shù)分析小鼠腸道微生物菌群多樣性。結(jié)果表明，與DSS模型組相比，灌喂EGCG和不同劑量茯磚茶后，小鼠生存質(zhì)量、結(jié)腸組織形態(tài)明顯改善，顯著降低了小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-水平（＜0.05）；顯著降低、基因表達(dá)（＜0.05），抑制了/炎性信號(hào)通路；腸道微生物多樣性增加、豐富度提高，不同處理組優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化。綜上所述，茯磚茶可通過(guò)抑制/炎性信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)小鼠腸道微生物多樣性來(lái)改善DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。

茯磚茶；潰瘍性結(jié)腸炎；炎性指標(biāo)；腸道微生物多樣性；變性梯度凝膠電泳

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）的一種，具有反復(fù)發(fā)作性、無(wú)確切病因、根治困難等特點(diǎn)，其發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，被世界衛(wèi)生組織列為難治病癥之一。當(dāng)前研究認(rèn)為，宿主異常免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腸道微生物菌群失調(diào)是導(dǎo)致UC發(fā)病的重要原因[1-2]。易感基因、環(huán)境因素與免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的交互作用，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性因子產(chǎn)生，使腸黏膜組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[3]。/信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，它的激活促進(jìn)了炎癥反應(yīng)產(chǎn)生，加重如UC等炎癥性疾病的發(fā)生[4]。UC患者體內(nèi)腸道菌群組成與正常人相比有較大改變，腸道菌群的物種豐富性、多樣性和穩(wěn)定性降低，腸道黏液層結(jié)構(gòu)被破壞，腸道菌群生態(tài)處于失衡、紊亂狀態(tài)[5-6]。腸道中細(xì)菌種類(lèi)變化與腸道疾病活動(dòng)密切相關(guān)、如IBD患者腸道中部分腸桿菌科（）細(xì)菌、瘤胃球菌（）和脫硫弧菌（）等致病菌數(shù)量增加，而柔嫩梭菌群（）、毛螺菌科（）菌群等益生菌減少[7-8]。UC患者糞便中微生物菌群組成可作為UC病情的生物標(biāo)志物，監(jiān)控疾病活動(dòng)程度和治療效果[9-10]。利用膳食、天然產(chǎn)物、益生菌等療法減輕炎癥反應(yīng)，修復(fù)IBD患者體內(nèi)腸道菌群，是治療和緩解UC病癥的新策略[11-13]。

茯磚茶是我國(guó)特有的黑茶，黑毛茶先汽蒸壓磚、再經(jīng)冠突散囊菌“發(fā)花”而來(lái)，不僅擁有茶多酚、茶色素和茶多糖等茶葉本身的有效活性物質(zhì)，還因冠突散囊菌參與茶葉的代謝轉(zhuǎn)化，具有抗炎[14]、降脂[15]、調(diào)節(jié)腸胃[16]等特殊功效。長(zhǎng)期以黑茶進(jìn)行膳食補(bǔ)充可以增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)人體腸道菌群[17]，茯磚茶提取物可提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，降低炎性因子表達(dá)水平，對(duì)葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC具有改善作用[18]。茶多酚可有效提高細(xì)胞抗氧化水平，改善結(jié)腸組織損傷，降低結(jié)腸炎病癥程度；影響宿主對(duì)糖類(lèi)的吸收與利用，調(diào)節(jié)宿主腸道細(xì)菌菌群[19-21]。但茯磚茶對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型/炎性代謝通路和腸道菌群的影響未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究以DSS建立UC小鼠模型，通過(guò)對(duì)小鼠血清炎性因子水平、結(jié)腸組織中炎性代謝通路、基因表達(dá)情況、不同處理時(shí)期小鼠糞便中腸道細(xì)菌菌群變化進(jìn)行分析，評(píng)估EGCG和不同劑量茯磚茶對(duì)UC小鼠的改善作用，以期從/炎性通路和腸道微生物組成角度探索茯磚茶對(duì)UC的預(yù)防及治療作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

茯磚茶由湖南省白沙溪茶廠股份有限公司提供；EGCG（純度≥98%）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；DSS購(gòu)于美國(guó)MP Biomedicals公司；小鼠腫瘤壞死因子（TNF-）、干擾素（IFN-）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、白細(xì)胞介素1（IL-1）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)于北京誠(chéng)林生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR premix EX TaqTM、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser購(gòu)于日本Takara公司；糞便基因組試劑盒、pGM-T連接試劑盒、大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；、、基因和16?S rDNA V3區(qū)通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀（Buchi，瑞士），冷凍干燥機(jī)（Buchi，瑞士），梯度PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roter-Gene Q，美國(guó)），DGGE變性凝膠電泳儀（Bio-Rad，DCodeTM，美國(guó)），Gel DocTM凝膠成像儀（Bio-Rad，美國(guó)）等。

1.3 茯磚茶提取物的制備

粉碎茯磚茶磚，收集12目篩底茶樣，稱取50?g茯磚茶粉于1?L錐形瓶中，重復(fù)取樣4次，按1∶15（∶）茶水比，于100℃沸水浴浸提30?min，抽濾合并濾液，旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)濃縮至呈粘稠狀，真空冷凍干燥24?h，獲得茯磚茶水提取物凍干粉，–80℃密封保存、備用。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

C57BL/6雌鼠60只，（SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20?g、4周齡），購(gòu)自長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：CXK（湘）2016-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物房溫度(25±1)℃，濕度40%～70%，光照時(shí)間12?h晝夜交替，自由供給飲用水和基礎(chǔ)飼料，飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分：粗蛋白24.3%、粗灰粉8.6%、粗脂肪7.5%、粗纖維3.5%、鈣1.2%、磷0.7%，含水量7.5%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，以體重權(quán)重為基礎(chǔ)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control）、10?mg·kg-1EGCG對(duì)照組（EGCG control）、高劑量茯磚茶對(duì)照組（HBT control，300?mg·kg-1）、DSS模型處理組（DSS）、DSS＋10?mg·kg-1EGCG處理組（DSS＋EGCG）、DSS＋低劑量茯磚茶處理組（DSS＋LBT，100?mg·kg-1）、DSS＋中劑量茯磚茶處理組（DSS＋MBT，150?mg·kg-1）、DSS＋高劑量茯磚茶處理組（DSS＋HBT，300?mg·kg-1），對(duì)照組每組5只小鼠（n=5），處理組每組9只小鼠（n=9）。所有小鼠接受5周試驗(yàn)。試驗(yàn)第1周，對(duì)照組小鼠全部自由飲用無(wú)菌水，處理組小鼠全部自由飲用含3% DSS的無(wú)菌水，以此建立UC小鼠模型。從第2周開(kāi)始，正常對(duì)照組及DSS模型組小鼠每天灌喂生理鹽水；EGCG對(duì)照組和DSS＋EGCG組每天灌喂劑量為10?mg·kg-1的EGCG；HBT、DSS＋LBT、DSS＋MBT、DSS＋HBT組小鼠每天分別灌喂劑量為300、100、150、300?mg·kg-1的茯磚茶水提取物，給茶處理4周。試驗(yàn)過(guò)程中每7?d對(duì)小鼠進(jìn)行腹部按摩刺激收集新鮮小鼠糞便于無(wú)菌EP管中，存于–20℃冰箱備用。第5周結(jié)束后，摘小鼠眼球取血，收集小鼠結(jié)腸組織備用。

1.5 小鼠體征指標(biāo)觀察

每組小鼠每日添加約50?g飼料，觀察小鼠進(jìn)食、活動(dòng)、毛發(fā)等生存狀態(tài)，記錄小鼠體重變化，觀察小鼠糞便性狀及糞便隱血、出血情況，評(píng)估結(jié)腸炎疾病指數(shù)（Disease activity index，DAI）。DAI評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，DAI評(píng)分=體重下降評(píng)分＋大便性狀評(píng)分＋大便隱血評(píng)分[22]。

1.6 小鼠結(jié)腸病理組織切片分析

取1～2?cm洗凈后的結(jié)腸組織用10%福爾馬林浸泡24?h，蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸病理組織學(xué)變化。

1.7 血清炎性因子檢測(cè)

小鼠眼球血收集于2?mL離心管中，4℃冰箱靜置1?h后，3?000?r·min-1離心20?min，收集上清液，按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子表達(dá)量。

1.8 結(jié)腸組織JAK2、STAT3基因表達(dá)分析

1.9 PCR-DGGE分析

1.9.1 小鼠糞便總DNA提取

按照TIANamp Stool DNA Kit的操作步驟對(duì)每周收集的小鼠糞便進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取，提取后的DNA于–20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9.2 細(xì)菌16?S rRNA基因擴(kuò)增

用帶有GC夾的特異性引物（表3）對(duì)細(xì)菌16?S rRNA基因V3可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25?μL：10×Tap mix buffer 2.5?μL，上、下游引物各1?μL，dNTP 2?μL，Taq酶0.25?μL，模板DNA 2?μL，ddH2O 16.25?μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5?min；95℃變性1?min，55℃退火30?s，72℃延伸1?min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7?min后放至4℃冰箱保存。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（DAI）

表2 JAK2、STAT3、GAPDH引物序列

表3 小鼠腸道菌群V3區(qū)通用引物序列

1.9.3 DGGE電泳

通過(guò)美國(guó)Bio-Rad公司DcodeTM突變檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）。使用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，凝膠濃度線性梯度為35%～65%（100%變性劑對(duì)應(yīng)7?mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺），電泳溫度60℃，電壓100?V，電泳時(shí)間10?h，電泳完畢后對(duì)DGGE凝膠進(jìn)行漂洗，溴化乙錠染色20?min，最后使用紫外光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像、拍照觀察。

1.9.4 特異條帶切膠回收與克隆測(cè)序

根據(jù)DGGE條帶圖譜，切取特異性凝膠條帶置于2?mL無(wú)菌EP管中，加入500?μL超純水沖洗3次，再加添加50?μL超純水，4℃冰箱中過(guò)夜保存。12?h后取出樣品，在4℃下3?000?r·min-1離心10?min，取10?μL上清液進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，此次使用的上游引物不帶GC夾。擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小及質(zhì)量。將擴(kuò)增的特異性條帶切膠回收、純化，按照pGM-T連接試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行腸道微生物的T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢測(cè)后，篩選陽(yáng)性克隆，委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶對(duì)小鼠體征指標(biāo)的影響

正常對(duì)照組、EGCG對(duì)照組和HBT對(duì)照組小鼠在整個(gè)試驗(yàn)期間精神狀態(tài)和飲食良好，毛發(fā)烏黑有光澤，糞便狀態(tài)正常、呈顆粒狀，體重平穩(wěn)增長(zhǎng)。DSS模型組、DSS＋EGCG組、DSS＋LBT組、DSS＋MBT組和DSS＋HBT組小鼠在DSS造模后，掉毛嚴(yán)重，精神萎靡不振、驚恐，大便血紅色、稀便，肛門(mén)有血跡，相對(duì)體重顯著降低（<0.05）；經(jīng)4周EGCG和不同劑量茯磚茶灌喂處理后，小鼠相對(duì)體重均增加，達(dá)到處理開(kāi)始水平，茯磚茶對(duì)UC小鼠相對(duì)體重的影響如圖1-A所示。

不同劑量茯磚茶對(duì)UC小鼠DAI的影響如圖1-B所示。正常對(duì)照組、EGCG對(duì)照組和HBT對(duì)照組小鼠DAI無(wú)顯著差異，說(shuō)明EGCG和茯磚茶對(duì)正常小鼠DAI沒(méi)有影響。經(jīng)EGCG和不同劑量茯磚茶灌喂后，與DSS模型組相比，DSS＋EGCG組、DSS＋LBT組、DSS＋MBT組和DSS＋HBT組小鼠DAI降低，最終接近正常對(duì)照組；其中，DSS＋MBT處理組小鼠灌喂茯磚茶1周后，DAI顯著降低（<0.05），說(shuō)明150?mg·kg-1劑量的茯磚茶對(duì)急性UC損傷有顯著的改善作用。

2.2 小鼠結(jié)腸病理組織分析

10?mg·kg-1EGCG和不同劑量茯磚茶對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織炎癥有不同的改善作用。由圖2可知，正常對(duì)照組小鼠的結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)完整，腸腺在黏膜肌層上部排列整齊；EGCG對(duì)照組和HBT對(duì)照組基本接近正常組；與正常對(duì)照組相比，DSS模型組小鼠結(jié)腸組織上皮不完整，上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞減少，腸腺損傷，在肌層和黏膜下層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS＋EGCG處理組和DSS＋MBT處理組的小鼠結(jié)腸組織最接近于正常對(duì)照組，說(shuō)明EGCG和茯磚茶對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織炎癥有一定改善作用。

圖2 茯磚茶對(duì)UC小鼠結(jié)腸病理組織切片的影響

2.3 茯磚茶對(duì)UC小鼠血清炎性因子的影響

IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子與腸道疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。茯磚茶對(duì)UC小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-含量的影響如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，DSS模型組小鼠血清中TNF-、IL-6、IL-8、IL-1和IFN-含量（＜0.01）極顯著上升。與DSS模型組相比，DSS＋EGCG處理組小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-和IFN-含量極顯著下降（<0.01）；DSS＋LBT組小鼠血清中IFN-和IL-1含量極顯著降低（<0.01）；DSS＋MBT組和DSS＋HBT組小鼠血清中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-、IFN-含量極顯著降低（<0.01），說(shuō)明EGCG及茯磚茶對(duì)UC小鼠的炎癥反應(yīng)有改善作用。

2.4 茯磚茶對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織JAK2、STAT3基因相對(duì)表達(dá)量的影響

/信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，它的激活促進(jìn)了UC發(fā)展。茯磚茶對(duì)UC小鼠中、基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響如圖4所示。與正常對(duì)照組相比，DSS模型組小鼠結(jié)腸組織中、相對(duì)表達(dá)量極顯著上升（<0.01）；與DSS模型組相比，DSS＋EGCG組、DSS＋LBT組、DSS＋MBT組和DSS＋HBT組小鼠結(jié)腸組織中、相對(duì)表達(dá)量極顯著下降（<0.01）。其中，DSS＋MBT組和DSS＋HBT組接近正常組水平。由此可知，EGCG和茯磚茶均能抑制UC小鼠結(jié)腸、基因mNRA表達(dá)，可能通過(guò)抑制/信號(hào)通路來(lái)抑制UC小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

2.5 16?S rDNA的PCR擴(kuò)增

以GC-341f和534r為引物，選擇細(xì)菌16?S rRNA-V3區(qū)對(duì)不同時(shí)期小鼠糞便總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約250?bp的清晰條帶（圖5），符合DGGE分析。

注：*：與正常對(duì)照組相比，P<0.05。**：與正常對(duì)照組相比，P<0.01。#：與DSS模型組相比，P<0.05。##：與DSS模型組相比，P<0.01。下同

圖4 茯磚茶對(duì)UC小鼠JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

注：A1、A2為正常對(duì)照組；B1、B2為EGCG對(duì)照組；C1、C2為HBT對(duì)照組；D1、D2為DSS模型組；E1、E2為DSS＋EGCG組；F1、F2為DSS＋LBT組；G1、G2為DSS＋MBT組；H1、H2為DSS＋HBT組；M為Marker

2.6 DGGE指紋圖譜分析

EGCG和茯磚茶灌喂2周和4周后，小鼠腸道微生物DGGE指紋圖譜如圖6所示，不同時(shí)期EGCG和茯磚茶灌喂處理DGGE圖譜數(shù)據(jù)化處理如表4所示。DGGE圖譜中每一條亮帶代表至少一種微生物菌種，條帶的亮度表示細(xì)菌的豐富度，條帶越亮，表明該菌相對(duì)數(shù)量越多。因此，可根據(jù)條帶數(shù)量和豐富度評(píng)估茯磚茶對(duì)UC小鼠腸道微生物菌群的影響。由表4可知，DSS處理前，所有小鼠腸道微生物正常且基本無(wú)差異。經(jīng)DSS處理1周后，與正常對(duì)照組相比，各組小鼠腸道微生物多樣性減少，豐富度顯著降低（＜0.05）。經(jīng)EGCG和不同劑量茯磚茶灌喂處理1周后，與DSS處理1周結(jié)束時(shí)相比，各處理組小鼠腸道微生物種類(lèi)數(shù)量增加，其中DSS＋HBT組達(dá)顯著水平（＜0.05）；與DSS模型組相比，DSS＋EGCG組和DSS＋MBT組小鼠腸道微生物豐富度顯著提高（＜0.05）。灌喂處理2周后，與DSS處理1周結(jié)束時(shí)相比，DSS模型組和各處理組小鼠腸道微生物種類(lèi)數(shù)量增加，其中EGCG對(duì)照組與DSS＋HBT處理組中腸道微生物種類(lèi)數(shù)量比正常組及其他試驗(yàn)處理組豐富；與DSS模型組相比，DSS＋EGCG組、DSS＋MBT組和DSS＋HBT組小鼠腸道微生物豐富度顯著提高（＜0.05）。灌喂處理3周后，各處理組小鼠腸道微生物種類(lèi)數(shù)量及豐富度基本達(dá)到正常組水平。灌喂處理4周后，各組小鼠腸道微生物數(shù)量及豐富度基本一致，與DSS模型組相比，EGCG及茯磚茶處理組小鼠腸道微生物種類(lèi)數(shù)量更加豐富。

注：T0：DSS處理前。T1：DSS處理1周后。F1：灌喂第1周。F2：灌喂第2周。F3：灌喂第3周。F4：灌喂第4周。*表示與DSS處理前相比，差異顯著（<0.05），#表示與DSS處理1周后相比，差異顯著（<0.05）；a表示同一泳道內(nèi)與正常對(duì)照組相比，差異顯著（<0.05），b表示同一泳道內(nèi)與DSS模型組相比，差異顯著（<0.05）

Note: T0: before DSS treatment. T1: after one week DSS treatment. F1: the 1st week of feeding. F2: the 2ed week of feeding. F3: the 3rd week of feeding. F4: the 4th week of feeding. * represents a significant difference compared to the before DSS treatment,<0.05. # represents a significant difference compared to the after one week DSS treatment,<0.05. "a" represents a significant difference compared to the control groups in the same lane,<0.05. "b" represents a significant difference compared to the DSS model groups in the same lane,<0.05

2.7 特異性條帶測(cè)序分析

對(duì)DGGE圖譜中特異性條帶進(jìn)行切膠測(cè)序，將結(jié)果通過(guò)NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表5所示?；厥諚l帶所代表的細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌同源性為96%～100%，可歸納為主要的八大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，分別為腸桿菌科、毛螺菌科、疣微菌科（）、螺桿菌科（）、乳桿菌科（）、紫單胞菌科（）、理研菌科（）和普雷沃氏菌科（）。

將與目的條帶對(duì)應(yīng)的序列導(dǎo)入16?S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)測(cè)序結(jié)果可知，DSS造模成功后，小鼠腸道中腸道疾病標(biāo)志性菌群、致病菌增加，如理研菌科、梭菌科梭狀芽孢桿菌（）、脫硫弧菌科嗜膽菌（）等。有益菌菌群減少，如腸桿菌科、紫單胞菌科、疣微菌科等。

在EGCG及不同劑量茯磚茶灌喂處理后，小鼠腸道微生物大部分恢復(fù)正常，腸道中益生菌數(shù)量增加，如紫單胞菌科、疣微菌科等。不同治療時(shí)期及不同處理組間存在特異性腸道微生物。EGCG及茯磚茶灌喂1周后，各處理組中毛螺菌科細(xì)菌增加。灌喂2周后，EGCG及DSS＋MBT組擬桿菌屬（）細(xì)菌增加，HBT組中毛螺菌科細(xì)菌增加，DSS＋LBT組和DSS＋HBT組中紫單胞菌科細(xì)菌增加，DSS＋EGCG組中出現(xiàn)約氏乳酸桿菌（）。灌喂3周后，DSS＋MBT組中出現(xiàn)有利于腸道健康的菌；DSS＋EGCG組及DSS＋HBT組中具有改善肥胖、減輕腸道炎癥等作用的疣微菌門(mén)艾克曼菌（）數(shù)量增加。灌喂4周后，DSS＋MBT處理組中疣微菌門(mén)艾克曼菌增加，DSS＋LBT組和DSS＋HBT組中出現(xiàn)格氏乳酸桿菌（）。上述結(jié)果說(shuō)明EGCG和茯磚茶對(duì)UC具有緩解及治療作用。

表5 DGGE特異性條帶測(cè)序結(jié)果

2.8 小鼠腸道菌群的聚類(lèi)分析

灌喂EGCG和不同劑量茯磚茶2周后，小鼠生存狀態(tài)顯著改善，且菌群多樣性顯著增加。對(duì)灌喂2周后的小鼠腸道菌群DGGE指紋圖譜進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖7所示，DSS模型組與HBT對(duì)照組各自聚為一簇；在馬氏距離0.63處，EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組、DSS＋LBT組與DSS＋MBT組、DSS＋EGCG組與DSS＋HBT組首先各自聚集，然后聚集為一大簇，與DSS模型組相距較遠(yuǎn)。由此可知，經(jīng)EGCG及不同劑量茯磚茶灌喂后，小鼠腸道菌群分布更為相似，而DSS模型組小鼠由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)治療處理，其腸道菌群分布與其他組小鼠具有顯著差別。

3 討論

腸道微生物菌群調(diào)節(jié)異常可促進(jìn)炎性腸病的發(fā)生和惡化[23]，通過(guò)糞便菌群移植、益生菌、益生元、膳食療法等可調(diào)節(jié)腸道菌群，進(jìn)行UC預(yù)防及治療[24]。茶因富含多酚類(lèi)化合物等成分，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎效果，對(duì)UC具有一定改善作用[25]。黑茶中的茯磚茶經(jīng)冠突散囊菌“發(fā)花”后，其化學(xué)組分發(fā)生了較大變化，分析發(fā)現(xiàn)茯磚茶含有茶褐素、茶多糖、有機(jī)酸、黃烷醇等諸多活性物質(zhì)[26-27]，以及吲哚類(lèi)生物堿等具有抗氧化性的冠突散囊菌代謝產(chǎn)物[28]。但茯磚茶是否對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型腸道炎癥及菌群產(chǎn)生積極改善作用，未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究從/炎性信號(hào)通路和腸道微生物角度探討了茯磚茶對(duì)UC的改善作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)UC導(dǎo)致的腸道損傷具有一定的修復(fù)和改善作用。

DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)生，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，增加如IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等促炎細(xì)胞因子釋放[29-30]，導(dǎo)致腸道黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，最終驅(qū)動(dòng)結(jié)腸炎向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)變[31]。/信號(hào)通路是炎癥發(fā)生的重要通路，參與了包括IBD在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制。JAK抑制劑對(duì)UC的治療有顯著療效[32]，抑制/信號(hào)通路可改善DSS誘導(dǎo)的UC病程[33]。此外，有研究表明結(jié)腸炎的炎癥影響了腸道中微生物的多樣性和豐富度[34]。本研究中小鼠結(jié)腸病理組織切片顯示，DSS造模后小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)損傷，并伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，在灌喂EGCG和茯磚茶后，結(jié)腸組織損傷得到一定程度改善，以10?mg·kg-1EGCG和150?mg·kg-1茯磚茶兩個(gè)處理組效果較好，但仍無(wú)法恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。此外本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎小鼠在DSS誘導(dǎo)后28?d，體內(nèi)炎性因子水平仍較高，IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子與正常對(duì)照組相比顯著提高，和基因表達(dá)未恢復(fù)到正常水平，仍存在炎癥和結(jié)腸組織損傷。這與Konarska等[35]和Liu等[36]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明UC一旦發(fā)生，即使生存狀態(tài)已恢復(fù)，但體內(nèi)炎癥水平和部分結(jié)腸組織仍存在損傷。灌喂EGCG和茯磚茶后，小鼠血清炎性因子和、基因表達(dá)基本回歸正常水平。由此可知，通過(guò)攝入具有抗炎作用的茯磚茶，對(duì)改善UC炎癥具有顯著作用。

圖7 小鼠腸道菌群DGGE圖譜UPGMA聚類(lèi)分析

PCR-DGGE技術(shù)是一種廣泛用于腸道微生物菌群多樣性分析及菌群結(jié)構(gòu)變化研究的便捷方法[37]，通過(guò)對(duì)單個(gè)特異條帶測(cè)序，可鑒定微生物群體關(guān)系；圖譜中條帶數(shù)量代表小鼠腸道中微生物種類(lèi)多少，條帶亮度表示該菌群相對(duì)數(shù)量的多寡，菌群多樣性越高，各類(lèi)細(xì)菌之間關(guān)聯(lián)就越密切，豐富度越高，說(shuō)明該菌相對(duì)數(shù)量越多，一定程度說(shuō)明了菌群的穩(wěn)定性與定植抵抗力[38]。本研究通過(guò)茯磚茶對(duì)DSS誘導(dǎo)UC小鼠腸道微生物DGGE的指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，DSS誘導(dǎo)炎癥性腸病導(dǎo)致小鼠腸道微生物多樣性及群落豐富度發(fā)生改變，經(jīng)EGCG和茯磚茶治療后，致病菌減少，益生菌增加，腸道微生物菌群得到改善。

小鼠經(jīng)DSS造模后，腸道內(nèi)微生物多樣性顯著降低；有益菌菌群腸桿菌科、紫單胞菌科、疣微菌科等減少，小鼠腸道致病類(lèi)細(xì)菌增加，理研菌科、梭菌科梭狀芽孢桿菌、脫硫弧菌科、腸道沙門(mén)氏菌（）等細(xì)菌的出現(xiàn)，標(biāo)志著腸道疾病的發(fā)生與惡化[39-40]。經(jīng)EGCG和不同劑量茯磚茶治療處理后，大部分小鼠腸道微生物恢復(fù)正常，腸道中毛螺菌科、紫單胞菌科、疣微菌科等益生菌數(shù)量增加。此外，DSS+EGCG、DSS+MBT和DSS+HBT處理組中分別出現(xiàn)約氏乳酸桿菌、菌、格氏乳酸桿菌，及共同含有的疣微菌門(mén)艾克曼菌等益生菌，明顯改善了小鼠腸道環(huán)境，抑制腸道炎癥發(fā)展，使UC小鼠的癥狀得到有效緩解，與Stenman等[41-43]的研究結(jié)果一致。其中，高劑量茯磚茶對(duì)UC有明顯緩解作用，與胡安愷等[18]研究結(jié)果相符。DGGE指紋圖譜UPGMA聚類(lèi)分析表明，DSS模型組單獨(dú)聚為一類(lèi)；HBT對(duì)照組聚為一類(lèi)，可能是由于茯磚茶擁有獨(dú)特的減肥降脂和腸道調(diào)節(jié)的生理功能，導(dǎo)致其與正常對(duì)照組在分類(lèi)上存在一定差別；EGCG對(duì)照組和正常對(duì)照組小鼠腸道菌群較為相似；DSS＋LBT組和DSS＋MBT組小鼠腸道菌群較為相似；DSS＋EGCG組和DSS＋HBT組小鼠腸道菌群較為相似。

綜上所述，DSS誘導(dǎo)的UC可導(dǎo)致小鼠炎癥水平升高、結(jié)腸組織受損，腸道微生物菌群發(fā)生改變，嚴(yán)重影響小鼠生存質(zhì)量，EGCG和茯磚茶在一定程度上改善了UC小鼠體內(nèi)炎癥水平和腸道菌群的變化、修復(fù)腸道損傷。本研究從/炎性信號(hào)通路和腸道微生物的角度探討了茯磚茶對(duì)UC的改善作用，為茯磚茶的藥理功能研究提供了一定理論基礎(chǔ)。

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Effects of Fu Brick Tea on Inflammation and Intestinal Microflora Diversity in Mice with DSS-induced Ulcerative Colitis

HUANG Xiangxiang1, TAN Ting1, YU Lijun1,2,3*, WANG Kunbo1,2,3, HUANG Jian'an1,2,3, XU Shiyu1, LIU Zhonghua1,2,3*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In this study, we investigated the effects of Fu brick tea on the anti-inflammationand intestinal microflora of ulcerative colitis (UC) mice induced by Dextran sulfate sodium (DSS). Sixty C57BL/6 female mice were randomly divided into the normal control group, 10?mg·kg-1EGCG control group, high dose brick tea (300?mg·kg-1, HBT) control group, DSS model group, DSS＋10?mg·kg-1EGCG group, DSS＋low dose brick tea (100?mg·kg-1, LBT) group, DSS＋middle dose brick tea (150?mg·kg-1, MBT) group and DSS＋HBT group, with the control groups n=5 and the treatment groups n=9. After 1 week of DSS modeling, the mice were gavaged for 4 weeks. The mice were executed after 5 weeks of the treatments. The histopathological changes of mice colon were observed, and the disease activity index (DAI) of mice colitis was assessed. The levels of IL-6, IL-8, IL-1, TNF-and IFN-inflammatory factors in mice serum and the expression levels ofandgenes in mice colon tissues were measured. The intestinal microflora of mice was analyzed by PCR-DGGE and clone sequencing techniques. The results show thatcompared with the DSS model group, the quality of survival and colonic tissue morphology of mice were significantly improved after feeding EGCG and different concentrations of brick tea, and the levels of inflammatory factors IL-6, IL-8, IL-1, TNF-and IFN-in mice serum were significantly reduced (<0.05). Moreover, the expressions ofandgenes were significantly reduced (<0.05) JAK2/STAT3 inflammatory signaling pathway was inhibited; and intestinal microflora diversity and richness were increased significantly. The dominant bacterial flora in different treatment groups werechangedaswell. In conclusion, Fu brick tea can ameliorate DSS-induced UC injury by inhibiting/inflammatory signaling pathway and modulating intestinal microflora diversity.

Fu brick tea, ulcerative colitis, inflammation factors, intestinal microflora diversity, PCR-DGGE

S571.1；R574.1

A

1000-369X(2021)05-681-14

2021-02-23

2021-04-15

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1604403）、湖南省科技廳黑茶重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2017NK2180）、湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201910537089）、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系

黃翔翔，男，博士研究生，主要從事茶葉功能成分及藥理研究。*通信作者：yulijun_tea@qq.com；larkin-liu@163.com

（責(zé)任編輯：黃晨）