基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥基因篩選及生物學(xué)功能分析

梁子豪，高雅楠，史麗云

南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，南京210000

肝內(nèi)膽管癌是繼肝細(xì)胞癌之后第二常見(jiàn)的原發(fā)性肝惡性腫瘤，在中國(guó)的發(fā)病率較高，且在亞洲范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。因其早期發(fā)現(xiàn)困難，大部分患者發(fā)現(xiàn)后已處于中晚期［2］，患者接受手術(shù)治療后五年生存率不到20%，即使切除充分，仍有超過(guò)50%的患者在切除后的第1年或第2年出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)［3］。所以，化療仍然是重要的治療手段，可以有效改善術(shù)后生存時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量。目前，肝內(nèi)膽管癌一線(xiàn)的化療藥以吉西他濱為主，但臨床發(fā)現(xiàn)有部分患者接受治療后出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象［4］，目前肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥的機(jī)制仍未明確。我們利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)信息，采用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥基因，分析了吉西他濱耐藥基因的生物學(xué)功能及相關(guān)信號(hào)通路；并探討了關(guān)鍵耐藥基因（MCC值排名前十）與肝內(nèi)膽管癌預(yù)后的關(guān)系，為探討肝內(nèi)膽管癌耐吉西他濱的機(jī)制提供新的線(xiàn)索，也為臨床聯(lián)合用藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）［5］獲得了肝內(nèi)膽管癌耐藥基因表達(dá)數(shù)據(jù)，其中MT-CHC01_rep1、MTCHC01_rep2為肝內(nèi)膽管癌吉西他濱敏感株、MTCHC01R1.5_rep1、MT-CHC01R1.5_rep2為 肝 內(nèi) 膽管癌吉西他濱耐藥株。檢測(cè)平臺(tái)為GPL6480。

1.2 肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥基因的篩選利用在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/）篩選吉西他濱耐藥和吉西他濱敏感的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系間差異表達(dá)基因（DEGs，肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥基因，簡(jiǎn)寫(xiě)為吉西他濱耐藥基因）。以P值＜0.05，|log（Foldchange）|＞2獲取差異表達(dá)基因，log（Foldchange）＞2為顯著性上調(diào)基因，log（Fold change）＜2為顯著性下調(diào)基因。

1.3 吉西他濱耐藥基因生物學(xué)功能及信號(hào)通路分析通過(guò)DAIVD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)吉西他濱耐藥基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。GO分析中包括細(xì)胞成分（CC）、生物過(guò)程（BP）和分子功能（MF）項(xiàng)［6］，P值＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪制條形圖及氣泡圖。

1.4 吉西他濱耐藥基因中的關(guān)鍵基因篩選及與肝內(nèi)膽管癌發(fā)生、預(yù)后的關(guān)系使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異化基因進(jìn)行分析同時(shí)構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)運(yùn)用Cytoscape軟件中的cytohubba插件來(lái)篩選關(guān)鍵基因［7］。篩選條件為MCC值排名前十。

通過(guò)GEPIA箱形圖分析研究了36個(gè)膽管癌組織樣品和9個(gè)正常組織樣品中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。以P值＜0.05為有顯著性差異?；赥CGA-COAD（The Cancer Genome Atlas-colon adenocarcinoma）和TCGA-READ（The Cancer Genome Atlas-rectum ade?nocarcinoma）數(shù)據(jù)集、利用GEPIA工具分析關(guān)鍵基因與肝內(nèi)膽管癌預(yù)后的關(guān)系。篩選標(biāo)準(zhǔn)：Group Cut?off：Median，Cutoff-High（%）：50，Cutoff-Low（%）：50。

2 結(jié)果

2.1 肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥基因共鑒定出肝內(nèi)膽管癌吉西他濱耐藥基因589個(gè)，上調(diào)314個(gè)，下調(diào)275個(gè)?；鹕綀D見(jiàn)圖1。

圖1 耐藥基因火山圖

2.2 吉西他濱耐藥基因的生物學(xué)功能上調(diào)吉西他濱耐藥基因富集于BP 40條，CC 34條，MF 36條。下調(diào)吉西他濱耐藥基因富集于BP 24條，CC 17條，MF 16條。在生物學(xué)過(guò)程中，上調(diào)吉西他濱耐藥基因主要參與DNA復(fù)制、修復(fù)，以及細(xì)胞有絲分裂等過(guò)程；富集于細(xì)胞核中；影響組蛋白結(jié)合、蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚體結(jié)合和染色質(zhì)結(jié)合等生物學(xué)功能。下調(diào)吉西他濱耐藥基因則主要參與血管生成、低氧應(yīng)答、線(xiàn)粒體自噬、自噬體組裝和骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程；主要分布在外泌體，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空隙；影響血紅素結(jié)合、電壓門(mén)控離子通道、肝素結(jié)合、氧化還原酶和類(lèi)固醇激素受體活性等生物學(xué)功能。在KEGG富集分析中，上調(diào)吉西他濱耐藥基因主要富集在DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、嘌呤嘧啶代謝、錯(cuò)配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)和酪氨酸代謝相關(guān)通路；下調(diào)吉西他濱耐藥基因則主要富集于谷氨酸能、γ-氨基丁酸能通路和Rap1信號(hào)通路。

2.3 關(guān)鍵基因及其與肝內(nèi)膽管癌發(fā)生、預(yù)后的關(guān)系上調(diào)吉西他濱耐藥基因中的關(guān)鍵基因?yàn)镸CM3、細(xì)胞分裂蛋白45（（CDC45）、微小染色體維持蛋白2（MCM2）、CDC6、MCM4、FEN1、微小染色體維持蛋白6（MCM6）、PCNA、EXO1和WDHD1。相比正常組織，腫瘤組織中的MCM2，MCM6，CDC45均高表達(dá)（P均＜0.05），而ATF3無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

下調(diào)吉西他濱耐藥基因中的關(guān)鍵基因?yàn)閂EG?FA、FOS、EGR1、DUSP1、ITGB1、ATF3、GABARA?PL1、FOSB、MAP1LC3A、ULK1。其中上調(diào)的關(guān)鍵基因中的CDC45、MCM2、MCM6高表達(dá)的肝內(nèi)膽管癌患者生存率低，下調(diào)基因中ATF3高表達(dá)的肝內(nèi)膽管癌患者生存率較高，見(jiàn)圖2。

圖2 不同關(guān)鍵基因表達(dá)的肝內(nèi)膽管癌預(yù)后生存曲線(xiàn)

3 討論

目前，美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)推薦吉西他濱、順鉑、氟尿嘧啶作為膽管癌的臨床化療方案，然而吉西他濱的耐藥問(wèn)題，是導(dǎo)致治療失敗的關(guān)鍵因素。吉西他濱進(jìn)入人體代謝為吉西他濱二磷酸鹽和吉西他濱三磷酸鹽［8］。其中吉西他濱二磷酸鹽通過(guò)抑制核糖核酸還原酶，減少DNA合成原料三磷酸脫氧核苷產(chǎn)生，從而抑制DNA的合成；吉西他濱三磷酸鹽則與脫氧三磷酸胞苷競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到DNA鏈上，同時(shí)吉西他濱二磷酸鹽可以發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)吉西他濱三磷酸鹽與DNA的結(jié)合，抑制DNA進(jìn)一步合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。

我們通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥株相較于敏感株，有589個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因314個(gè)、下調(diào)基因275個(gè)。富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要參與DNA復(fù)制、修復(fù)，細(xì)胞有絲分裂等過(guò)程。下調(diào)基因主要參與血管生成、低氧應(yīng)答、線(xiàn)粒體自噬、自噬體組裝等過(guò)程，目前的研究表明抑制自噬可以導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種化學(xué)藥物的敏感性，降低化療對(duì)于腫瘤的作用［10］。提示吉西他濱耐藥株可能通過(guò)上調(diào)DNA修復(fù)與復(fù)制相關(guān)基因，下調(diào)自噬相關(guān)基因，從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。

在差異基因中進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵基因MCM2、MCM6、CDC45和ATF3，發(fā)現(xiàn)其在肝內(nèi)膽管癌的吉西他濱耐藥和患者生存情況中發(fā)揮重要作用。MCM2和MCM6是MCM家族成員，MCM2-7可以相互作用形成功能性DNA解旋酶，觸發(fā)DNA合成的初始步驟［11］，促進(jìn)細(xì)胞的復(fù)制。無(wú)限復(fù)制是腫瘤細(xì)胞的特征之一，MCM蛋白被認(rèn)為與癌癥發(fā)展密切相關(guān)，可以作為多種腫瘤的標(biāo)志物，同時(shí)也被認(rèn)為與腫瘤的預(yù)后相關(guān)［12］。目前在多種腫瘤組織和癌癥細(xì)胞中檢測(cè)到MCM家族蛋白高表達(dá)［13-14］。MCM2-7復(fù)合物被激活時(shí)，CDC45會(huì)被招募到MCM2-7復(fù)合物的尾部，激活其解旋酶活性，從而促進(jìn)DNA的復(fù)制。過(guò)量的MCM家族蛋白表達(dá)被認(rèn)為可以對(duì)DNA復(fù)制的穩(wěn)定性起到保護(hù)作用［15］。而CDC45的突變會(huì)顯著降低MCM復(fù)合物的解旋酶活性［16］。

化療作為臨床治療腫瘤的主要手段，主要通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷及復(fù)制來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。MCM2、MCM6和CDC45可 能 是 通 過(guò) 形 成CDC45-MCM-GINS（CMG）復(fù)合物從而促進(jìn)DNA的復(fù)制與修復(fù)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)MCM家族蛋白高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，抑制MCM2可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性［17］。而通過(guò)抑制MCM4和MCM7引起MCM復(fù)合物抑制也可以增強(qiáng)胰腺導(dǎo)管癌對(duì)5-氟尿嘧啶和吉西他濱的敏感性［18］。

核糖核苷酸還原酶（RR）在維持脫氧核糖核苷酸庫(kù)中發(fā)揮重要作用。下調(diào)RR減少吉西他濱與脫氧胞苷之間的競(jìng)爭(zhēng)，從而增強(qiáng)了吉西他濱的作用。因此可通過(guò)抑制RR亞基M1（RRM1）來(lái)增強(qiáng)吉西他濱的作用，該基因的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致吉西他濱耐藥［19］。這與我們發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥株中RRM1明顯上升的結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)MCM2-7復(fù)合物可以調(diào)控RRM1的表達(dá)，這可能也是MCM2和MCM6引起吉西他濱耐藥的原因。

臨床研究表明，二甲雙胍可以選擇性抑制MCM2從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療的敏感性［20］；此外上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）被認(rèn)為是吉西他濱耐藥的關(guān)鍵原因之一，有研究表明MCM2-7復(fù)合物的形成可以顯著促進(jìn)EMT的發(fā)生［21］。二甲雙胍和吉西他濱聯(lián)合使用則可以抑制EMT的發(fā)生，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性［22］。中藥組分大黃素可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞EMT同時(shí)增強(qiáng)腫瘤對(duì)于吉西他濱的敏感性，增強(qiáng)吉西他濱的效果［23-24］，這可能是通過(guò)抑制MCM復(fù)合物誘導(dǎo)的RRM1表達(dá)引起的。

下調(diào)基因ATF3是ATF/環(huán)AMP反應(yīng)元件結(jié)合（ATF/CREB）轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，可以被缺氧、DNA損傷等多種應(yīng)激因素激活，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程。近年發(fā)現(xiàn)ATF3在多種腫瘤中可以起到影響化療藥物敏感性的作用。HASIM等［25］發(fā)現(xiàn)使用ATF3誘導(dǎo)劑可以顯著增強(qiáng)阿霉素對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的毒性作用、提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。此外吉西他濱可以通過(guò)促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，引起腫瘤細(xì)胞死亡。為了減輕ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，腫瘤細(xì)胞上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2），催化谷胱甘肽（GSH）生成，引發(fā)對(duì)吉西他濱的耐藥［26］。ATF3可以通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo-TAZ pathway通路，抑制Nrf2-Keap1的保護(hù)作用，從而促進(jìn)腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性［27-28］。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析肝內(nèi)膽管癌耐藥株差異基因，發(fā)現(xiàn)其主要通過(guò)上調(diào)DNA復(fù)制及修復(fù)相關(guān)基因，抑制自噬相關(guān)基因，引起肝內(nèi)膽管癌對(duì)吉西他濱耐藥。進(jìn)一步篩選出其中關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因中的關(guān)鍵基因?yàn)镸CM3、CDC45、MCM2、CDC6、MCM4、FEN1、MCM6、PCNA、EXO1和WDHD1。下調(diào)基因中的關(guān)鍵基因?yàn)閂EG?FA、FOS、EGR1、DUSP1、ITGB1、ATF3、GABARA?PL1、FOSB、MAP1LC3A、ULK1。我們發(fā)現(xiàn)MCM2、MCM6、CDC45在腫瘤組織中高表達(dá)，其中MCM2、MCM6、CDC45高表達(dá)肝內(nèi)膽管癌患者生存率低，而ATF3高表達(dá)的患者生存率高。提示MCM2、MCM6、CDC45可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生及發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。但基于生物信息學(xué)自身局限性，結(jié)論仍有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。