葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制研究*

厲越，高凌卉，劉瑤萍，韓昌鵬

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200080；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200080

潰瘍性結(jié)腸炎是涉及異常免疫反應(yīng)的腸道慢性炎癥，臨床可表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、便血等。其累及部位主要涉及直腸和乙狀結(jié)腸，嚴(yán)重者可侵及整個(gè)結(jié)腸。潰瘍性結(jié)腸炎目前的治療方案已出現(xiàn)巨大進(jìn)步，維多珠單抗等藥物的出現(xiàn)為潰瘍性結(jié)腸炎患者帶來新的曙光。但目前潰瘍性結(jié)腸炎治療存在復(fù)發(fā)率高，療效不穩(wěn)定，價(jià)格較高等問題，給個(gè)人和社會(huì)帶來一定負(fù)擔(dān)。

中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎療效確切，給患者帶來新的選擇。葛根芩連湯出自張仲景《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草4味藥組成?！斗絼W(xué)》［1］載葛根芩連湯主治濕熱痢疾，表現(xiàn)為便膿血赤白相兼，且腹痛，里急后重較甚，有清熱燥濕、調(diào)和氣血之功，兼能通滯下行，已被廣泛應(yīng)用于治療腹瀉相關(guān)疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎等，并取得良好療效。許愛軍［2］使用葛根芩連湯聯(lián)合柳氮磺吡啶腸溶片治療潰瘍性結(jié)腸炎患者48例，結(jié)果顯示治療組患者療效（95.8%）明顯高于單純使用柳氮磺吡啶組（83.3%）。賀佳蓓等［3］分別使用葛根芩連湯和奧沙拉秦治療潰瘍性結(jié)腸炎患者共66例，結(jié)果表明治療組（葛根芩連湯組）在有效率和復(fù)發(fā)率方面均優(yōu)于對(duì)照組（奧沙拉秦組）。越來越多的臨床結(jié)果證實(shí)葛根芩連湯的良好療效。

葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎使用廣泛，臨床療效確切。但目前關(guān)于其作用機(jī)制的研究較少，且中藥治療疾病由于其多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，使得很難通過單純的實(shí)驗(yàn)研究證明其作用機(jī)制，這給中醫(yī)藥進(jìn)一步發(fā)展帶來阻礙。本文使用系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過搜索多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，研究潰瘍性結(jié)腸炎主要成分葛根、黃芩、黃連、甘草的作用機(jī)制，構(gòu)建葛根芩連湯和潰瘍性結(jié)腸炎之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，嘗試從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 葛根芩連湯有效成分及作用靶點(diǎn)篩選將葛根、黃芩、黃連、甘草輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析 平 臺(tái)［4］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），得到每一味中藥的成分。通過將篩選條件設(shè)定為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%［5］、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18［6］，進(jìn)一步篩選有效成分。將得到的有效成分錄入Excel文件。繼續(xù)按照此條件篩選中藥有效成分所對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，將所得結(jié)果錄入Excel文件中。在UNIPROT數(shù)據(jù)庫(kù)中下載注釋文件，匹配靶點(diǎn)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因名稱，得到葛根芩連湯的靶點(diǎn)基因。

1.2 潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)基因篩選使用人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards）檢索潰瘍性結(jié)腸炎的基因靶點(diǎn)。Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)大型的、多元化的整合數(shù)據(jù)庫(kù)，提供目前所有已經(jīng)證實(shí)的人類基因的信息。以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果保存為Excel表格文件。

1.3 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)將葛根芩連湯的靶點(diǎn)和潰瘍性結(jié)腸炎的靶點(diǎn)進(jìn)行整合，并去除重復(fù)基因和未經(jīng)證實(shí)的基因，得到中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在作用靶點(diǎn)。將所得結(jié)果輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)［7］，物種選擇“homo sapiens”，得到葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將所得結(jié)果保存為tsv格式文件，使用R語言分析核心靶點(diǎn)，與其他靶點(diǎn)連接次數(shù)最多者即為核心靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖將葛根芩連湯“成分-靶點(diǎn)”文件及“中藥-成分”文件分別導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖及“中藥-成分”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 功能分析使用R語言（3.6.3）中的Cluster-Profiler包［8］進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路分析，并使用EnrichPlot包進(jìn)行結(jié)果可視化。

基因本體論（gene ontology，GO）是對(duì)基因在不同維度和不同層次上的描述。對(duì)基因的描述一般包括3個(gè)層面，即細(xì)胞成分（cellular component，CC）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）。GO分析和KEGG分析基于超幾何分布檢驗(yàn)。通過GO富集分析和KEGG分析可得到在某些層面具有顯著富集的基因，有助于解釋基因的功能。

2 結(jié)果

2.1 葛根芩連湯有效成分及靶點(diǎn)葛根共篩選出有效成分4個(gè)，黃芩共篩選出有效成分36個(gè)，黃連共篩選出有效成分14個(gè)，甘草有效成分7個(gè)，其中β-谷甾醇為葛根和黃芩共有成分，小檗堿和黃連堿為黃芩和黃連共有成分，槲皮素為黃連和甘草共有成分，共得到57個(gè)有效成分。每味中藥對(duì)應(yīng)有效成分的詳細(xì)信息見表1。進(jìn)一步篩選每個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，最終葛根共篩選到68個(gè)靶點(diǎn)蛋白，黃芩340個(gè)靶點(diǎn)蛋白，黃連223個(gè)靶點(diǎn)蛋白，甘草178個(gè)靶點(diǎn)蛋白。通過與UNIPROT注釋文件匹配，并去除重復(fù)后，共得到葛根芩連湯靶點(diǎn)基因194個(gè)。

表1 葛根芩連湯有效成分

2.2 潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞搜索GnenCards數(shù)據(jù)庫(kù)，共搜索到4 359個(gè)靶點(diǎn)基因。去掉相關(guān)性低的靶點(diǎn)及未經(jīng)驗(yàn)證的靶點(diǎn)，以relevence＜4為標(biāo)準(zhǔn)，最終共篩選得到1 273個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)將葛根芩連湯的194個(gè)靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎的1 273個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終共得到112個(gè)共有靶點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 疾病靶點(diǎn)和中藥靶點(diǎn)韋恩圖

將112個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到疾病蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。如圖2所示。圖2中每一個(gè)小球表示一個(gè)靶點(diǎn)，球中的結(jié)構(gòu)為該蛋白的3D結(jié)構(gòu)。不同顏色的連線表示不同的作用信息來源。紫色表示實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，紅色表示基因融合，藍(lán)色表示基因共發(fā)生，黑色為共表達(dá)。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，不同蛋白之間作用十分復(fù)雜，這也在一定程度上說明疾病發(fā)生的復(fù)雜性及中藥治療的多靶點(diǎn)性。

圖2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

使用R語言（3.6.3）分析核心靶點(diǎn)，結(jié)果如圖3所示，顯示前30個(gè)核心靶點(diǎn)。結(jié)果表明AKT1以90次的連接次數(shù)位于本網(wǎng)絡(luò)的首位，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、禽肉瘤病毒17轉(zhuǎn)化基因（v-Jun Avian Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog，JUN）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）等依次在后，其余核心靶點(diǎn)詳見圖3。

圖3 核心靶點(diǎn)條形圖

2.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件，共有37個(gè)有效成分和112個(gè)靶點(diǎn)。將文件導(dǎo)入Cytoscap軟件，得到網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。圖中綠色方塊表示成分，橙色圓形表示靶點(diǎn)。葛根有效成分中芒柄花黃素對(duì)應(yīng)28個(gè)靶點(diǎn)，其余成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較少。黃芩中漢黃芩素對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多，共有38個(gè)，其次是黃芩素，共有29個(gè)靶點(diǎn)，并且這2個(gè)成分都可作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1（Protein Kinase B，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶），次黃芩素還可作用于IL-6、JUN、CASP3等關(guān)鍵基因，表明其多靶點(diǎn)的治療作用，且影響關(guān)鍵基因，作用重大。黃芩素也可作用于AKT1、VEGFA、PTSG1等關(guān)鍵基因，也具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用，其余靶點(diǎn)β-谷甾醇、豆甾醇等也具有較多靶點(diǎn)。黃連共檢索到有效成分14個(gè)，其中槲皮素找到最多靶點(diǎn)，共有123個(gè)，這其中包括CASP3、IL-6、JUN、MYC、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等關(guān)鍵基因。

圖4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 功能分析

2.5.1 GO富集分析生物過程（Biological progress）共得到1 909個(gè)富集結(jié)果，主要包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性自由氧的反應(yīng)、對(duì)凋亡通路的調(diào)節(jié)、對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的影響、對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)胞分化的反應(yīng)等。

細(xì)胞成分（cellar component）共得到43個(gè)富集結(jié)果，主要包括轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、蛋白激酶復(fù)合體、細(xì)胞核、NAPDH復(fù)合體、細(xì)胞膜等。

分子功能（molecur function）共得到123個(gè)富集結(jié)果，主要包括細(xì)胞因子活動(dòng)、受體配體活動(dòng)、激酶調(diào)節(jié)、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體超家族、生長(zhǎng)因子受體等。

每個(gè)GO富集條目取前10條結(jié)果以氣泡圖展示，圓圈的大小表示基因富集的數(shù)量，同樣顏色由紅變藍(lán)表示P值逐漸增大，見圖5。

圖5 GO富集點(diǎn)圖

對(duì)于生物過程（BP）的富集結(jié)果，將P值由小到大前30個(gè)詞條的基因富集結(jié)果，以點(diǎn)陣圖的形式展現(xiàn)（按縱軸從原點(diǎn)起P值由小到大排列），可以直觀看出每個(gè)生物過程中富集的具體基因，有助于進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)基因間的相互聯(lián)系。詳見圖6。橫軸表示基因，縱軸表示BP條目，若基因在BP條目中，則用黑色實(shí)心方框表示。

圖6 生物過程富集點(diǎn)陣圖

2.5.2 KEGG通路分析使用clusterprofiler包進(jìn)行KEGG通路分析，共富集到150條通路。這些通路大多與炎癥相關(guān)，例如Inflammatory bowel disease、IL-17信號(hào)通路、TNFα信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，還有部分通路與腫瘤密切相關(guān)，如VEGF信號(hào)通路、PD1檢查點(diǎn)、P53信號(hào)通路等。KEGG通路富集結(jié)果展示如圖7。圖8展示了葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的靶點(diǎn)在Inflammatory bowel disease通路中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，葛根芩連湯可通過調(diào)節(jié)NFκB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等，發(fā)揮對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。

圖7 KEGG通路富集結(jié)果圖

圖8 Inflammatory bowel disease通路圖

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎作為一種自身免疫性的慢性腸道炎癥，尋找高效、安全的治療方法是臨床醫(yī)師的首要任務(wù)。潰瘍性結(jié)腸炎傳統(tǒng)治療方法包括5-氨基水楊酸類藥物、類固醇激素類等，但都存在療效不滿意、易復(fù)發(fā)等問題。中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎歷史悠久，中醫(yī)古籍中雖沒有“潰瘍性結(jié)腸炎”這一病名，但古代醫(yī)家治療“泄瀉”“腸風(fēng)”“下利”等多有心得，為后人留下寶貴的財(cái)富。葛根芩連湯為仲景名方，被廣泛用于治療腹瀉相關(guān)疾病，臨床用于治療潰瘍性結(jié)腸炎取得良好療效。葛根芩連湯方中葛根辛甘、涼，可入脾胃經(jīng)，既能解表，又可調(diào)理脾胃，清熱止痢，黃芩、黃連苦寒燥濕，黃芩用于上中二焦，黃連用于中下二焦，二者相互配合，增加利濕之功效，甘草和中，制約三藥之苦寒。全方共奏清熱利濕，解表止痢之功效。

本文通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到葛根芩連湯有效靶點(diǎn)194個(gè)，與潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)匹配后，共得到葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)112個(gè)。AKT1作為本次研究中與其他基因聯(lián)系最為緊密的基因，已被證實(shí)在潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸黏膜中表達(dá)明顯增高［9］，且在結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后中具有重要意義［10］。VEGFA也被證實(shí)可在多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［11-13］，并可影響細(xì)胞自噬等過程［14］，對(duì)炎癥也有一定影響。IL-6、IL-10、IL-1B等白細(xì)胞介素家族成員廣泛出現(xiàn)于炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡等研究中，對(duì)于各種自身免疫性疾病及腫瘤性疾病都有重要意義。環(huán)氧合酶是負(fù)責(zé)前列腺素合成的限速酶，在某些組織中諸如內(nèi)皮、腎臟、大腦和腫瘤細(xì)胞等中表達(dá)，與細(xì)胞黏附增加，表型改變，對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性和腫瘤血管生成有關(guān)。

GO富集分析結(jié)果較多，且主要集中在生物過程條目中。涉及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)活性自由氧的反應(yīng)、氧化供能、細(xì)胞膜通透性、多種激酶調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)等。且每個(gè)靶點(diǎn)可在不同條目中發(fā)揮作用，多個(gè)條目之間也可發(fā)生相互作用，表明葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的復(fù)雜作用機(jī)制，尚需更好的實(shí)驗(yàn)方法解決這種多途徑同時(shí)作用的情況。

KEGG通路分析表明，葛根芩連湯可廣泛影響多種經(jīng)典信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，例如IL-17信號(hào)通路、TNF-α信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在此不做贅述。另外，葛根芩連湯還可作用于p53、colorectal cancer等通路，表明其對(duì)腫瘤具有一定的調(diào)節(jié)作用，值得進(jìn)一步研究。在富集到的Inflammatory bowel disease通路中，有多種經(jīng)典信號(hào)通路共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如NF-κB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路，以及白細(xì)胞介素超家族、T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等。不同作用環(huán)節(jié)具體發(fā)揮的功能也不同，既有促進(jìn)也有抑制，還存在目前未確定的機(jī)制，需進(jìn)一步研究。且潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病在發(fā)病機(jī)制中存在多種重合，在治療時(shí)也有許多類似的方法，這在一定程度上給研究者和臨床醫(yī)生減輕了負(fù)擔(dān)。

本文利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法探索了治瀉名方葛根芩連湯的可能作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，結(jié)果表明，葛根芩連湯可通過多種靶點(diǎn)、多種生物學(xué)過程及通路，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用。從大數(shù)據(jù)角度說明葛根芩連湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療的有效性，同時(shí)也為進(jìn)一步研究潰瘍性結(jié)腸炎提供新的思路，期待中藥在治療此類疾病方面取得更大的進(jìn)步。