柔肝化纖顆粒對(duì)肝纖維化模型大鼠肝臟炎癥因子的影響*

段桂姣，蘇曉文，農(nóng)小欣，符燕青，呂艷杭，王振常

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201

肝纖維化（hepaticfibrosis，HF）是多種慢性損肝因素致慢性肝病的發(fā)展過程，以肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）過度沉積、肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）激活為特征，具有高發(fā)病率及病死率等特點(diǎn)［1］。全世界慢性乙型肝炎患者約有2.4億人，曾感染過乙肝病毒的約有20億，每年約有65萬人因肝硬化、原發(fā)性肝癌及肝衰竭而死亡［2］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國慢性肝炎患者約3千萬人［3］，且廣西屬于乙肝病毒感染的高發(fā)地區(qū)及重災(zāi)區(qū)。藥物治療HF有干擾素或核苷（酸）類藥物等，可減輕肝臟損傷程度，阻止肝臟繼續(xù)受損，防止HF的發(fā)生。中醫(yī)藥對(duì)防治HF有明顯優(yōu)勢，特別是中醫(yī)復(fù)方（如化纖保肝方、鱉甲煎丸、化纖丸、大黃蟲丸等［4-7］），可降低HF患者肝臟炎癥因子水平及宿主免疫反應(yīng)等。

研究發(fā)現(xiàn)，肝臟受損后，其自身修復(fù)可引起HSC活化及腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-TNF，TNF-α）等炎癥因子高表達(dá)，這是HF的發(fā)病基礎(chǔ)［8］。中藥復(fù)方靶向拮抗促炎因子表達(dá)對(duì)延緩慢性肝炎、HF有重要意義。

柔肝化纖顆粒（壯肝逐瘀煎）是全國老中醫(yī)林沛湘教授及著名肝病專家關(guān)幼波教授在治療各種慢性肝病的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上總結(jié)的。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，此方不僅能誘導(dǎo)HSC凋亡，而且對(duì)慢性肝炎具有明顯改善作用［9］。因此，本研究探討柔肝化纖顆粒對(duì)肝臟炎癥因子的影響，為臨床通過中藥復(fù)方抗HF提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性Wistar大鼠120只，6～8周齡，體質(zhì)量（220±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0006）。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK（桂）2019-0001，分籠飼養(yǎng)并保持實(shí)驗(yàn)室溫度和相對(duì)濕度分別為20～24℃和40%～45%，保持通風(fēng)光照良好。飼料為標(biāo)準(zhǔn)固體混合無菌飼料，飲水為高壓滅菌蒸餾水，飼養(yǎng)期間每天日照12 h。本課題經(jīng)過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：20200006。

1.2 藥物與試劑柔肝化纖顆粒（江蘇天江藥業(yè)有限公司，組方：黃芪45 g，鱉甲30 g，牡蠣30 g，黃精20 g，枸杞子20 g，薏苡仁45 g，橘紅12 g，澤蘭30 g，雞內(nèi)金15 g，虎杖20 g，大棗15 g。批號(hào)：1832792、1807060、1806094、1805013、1812546、1813016、1902096、1806070、1840432、1830561、1806012）；秋水仙堿（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：H53020871）。戊巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H31020240）；體積分?jǐn)?shù)75%乙醇（日照海旭醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：T34855-2017）；四氯化碳（CCl4）（廣州光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：20151030）；花生油（益海嘉里食品營銷有限公司，批號(hào)：SC20145060200180）；40 ng·L-1多聚甲醛（南京試劑廠家，貨號(hào)：MFCD00003274）；膽固醇（鄭州明欣化廠產(chǎn)品有限公司，批號(hào)：111618-200301）；蘇木精-伊紅復(fù)染液（北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：GL0658）；TNF-α、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批 號(hào)：HY21650E、HY20075E、HY1005E）；TNF-α、TGF-β、IL-6、β-actin（美國Abcam公司，貨號(hào)：ab183218、ab215715、ab233706、ab8226）；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、PBS磷酸鹽緩沖液（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：P0016、P0012A、P0018A、P0021）；RNA酶抑制劑（上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：C6101）；熒光定量PCR試劑盒（常州百代生物科技有限公司，貨號(hào)：BL697A）。

1.3 儀器Fisher Multiskan FC型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；THUNDER型光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）；80-2B型離心沉淀機(jī)（上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司）；Costar型細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）；AEM 480型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（北京阿莫氏科技開發(fā)有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）；1575型洗板機(jī)（深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與造模將120只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿組（0.1 g·kg-1）及柔肝化纖顆粒低劑量組（2.5 g·kg-1）、柔肝化纖顆粒中劑量組（5 g·kg-1）、柔肝化纖顆粒高劑量組（10 g·kg-1），每組20只。除空白組外，其余組大鼠以CCl4復(fù)合因素復(fù)制HF模型［10-11］。第4周末，每組隨機(jī)處死1只大鼠，取肝右葉做病理切片，觀察大鼠的HF程度，判斷大鼠HF模型制備是否成功。模型制備成功后，各組大鼠給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行灌胃，空白組及模型組均給予同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周。

2.2 HE染色觀察肝臟病理變化每組隨機(jī)取3只大鼠，麻醉后，開腹取肝右葉，置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，脫水，封片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠肝臟的病理改變。

2.3 Western Blot法檢測肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)取3只大鼠，麻醉后，開腹取肝右葉。提取肝臟總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、曝光。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。

2.4 RT-PCR法檢測肝臟TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平每組隨機(jī)取3只大鼠，麻醉后，開腹取肝右葉。提取肝臟的總RNA，用微量紫外光度計(jì)測定其RNA的濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以備用。以β-actin為內(nèi)參，檢測目的基因的表達(dá)量。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法檢測肝臟TNF-α、TGF-β及IL-6水平將每組剩余的10只大鼠，麻醉后，開腹取肝右葉。將少量肝臟與生理鹽水按1∶9稀釋后，分別加入生物素標(biāo)記抗體、過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶液及終止液充分反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀檢測其吸光度值，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況空白組大鼠皮毛柔順緊密光亮，精神狀態(tài)良好，飲食正常，活潑好動(dòng)，體質(zhì)量增加；模型組大鼠皮毛卷曲稀松，無光澤，精神狀態(tài)差，飲食減少，活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕；柔肝化纖顆粒低、中、高劑量組大鼠皮毛光澤柔潤，活動(dòng)較正常，飲食及精神尚可，體質(zhì)量增加；秋水仙堿組大鼠皮毛光澤度、飲食、活動(dòng)度、精神狀態(tài)及體質(zhì)量均較模型組有改善。

3.2 大鼠肝臟病理損傷變化空白組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無壞死及炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肝臟少數(shù)纖維間隔形成，肝細(xì)胞形態(tài)紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤在肝小葉周圍；柔肝化纖顆粒低、中、高劑量組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)趨向正常，浸潤在肝小葉的炎癥細(xì)胞相對(duì)較少；秋水仙堿組大鼠肝臟無肝細(xì)胞水腫及壞死，炎癥細(xì)胞浸潤少，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)相對(duì)正常。見圖1。

圖1 大鼠肝臟病理變化（HE染色，×100）

3.3 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá)的影響與空白組比較，模型組大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒低、中、高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝臟TNFα、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。見圖2，表2。

表2 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表2 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá)的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 TNF-α TGF-β IL-6空白組0.464±0.035 0.531±0.011 0.346±0.053模型組 3 - 1.577±0.318* 1.763±0.325* 1.967±0.178*秋水仙堿組 3 0.1 0.937±0.095＃ 0.993±0.131＃ 0.784±0.157＃柔肝化纖顆粒低劑量組 3 2.5 1.353±0.510＃ 1.317±0.187＃ 1.763±0.325＃柔肝化纖顆粒中劑量組 3 5 1.334±0.325＃ 1.190±0.169＃ 1.097±0.177＃柔肝化纖顆粒高劑量組 3 10 0.634±0.083＃ 0.735±0.046＃ 0.593±0.082 3-＃

圖2 各組大鼠炎癥因子蛋白表達(dá)圖

3.4 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α mRNA、TGF-βmRNA及IL-6mRNA水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝臟TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒低、中、高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝臟TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平均顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平的影響（±s）

表3 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-αmRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 TNF-αmRNA TGF-βmRNA IL-6 mRNA空白組1.015±0.013 1.003±0.002 1.018±0.012模型組 3 - 1.838±0.272* 2.428±0.140* 1.748±0.150*秋水仙堿組 3 0.1 1.390±0.278＃ 1.655±0.037＃ 1.458±0.130＃柔肝化纖顆粒低劑量組 3 2.5 1.529±0.332＃ 1.958±0.216＃ 1.613±0.557＃柔肝化纖顆粒中劑量組 3 5 1.454±0.250＃ 1.742±0.161＃ 1.308±0.274＃柔肝化纖顆粒高劑量組 3 10 1.289±0.069＃ 1.415±0.232＃ 1.215±0.071 3-＃

3.5 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6水平的影響與空白組比較，模型組大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒低、中、高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6水平顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表4 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6水平的影響 （±s）

表4 柔肝化纖顆粒對(duì)HF模型大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6水平的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 TNF-α（pg·g-1） TGF-β（pg·g-1） IL-6（pg·g-1）10 - 18.56±1.27 48.31±19.81 123.47±5.13模型組 10 - 87.37±9.26* 153.96±41.05* 213.42±16.03*秋水仙堿組 10 0.1 41.43±5.47＃ 121.08±25.77＃ 159.59±9.15＃柔肝化纖顆粒低劑量組 10 2.5 69.64±7.18＃ 142.52±39.35＃ 168.39±12.77＃柔肝化纖顆粒中劑量組 10 5 57.39±6.03＃ 139.72±21.53＃ 175.22±10.64＃柔肝化纖顆粒高劑量組 10 10 32.46±3.81＃ 107.47±21.35＃ 135.72±7.84空白組＃

4 討論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)HF的臨床表現(xiàn)，將其歸屬為“脅痛”“黃疸”“肝著”“積聚”等范疇，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中HF不同階段的病理特征基本吻合。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HF的病位在肝，與脾、胃、腎、膽密切相關(guān)。HF發(fā)生的病因病機(jī)十分復(fù)雜，多因外感毒邪、痰瘀阻滯肝絡(luò)、濕熱蘊(yùn)結(jié)等所致［12-15］，加之飲食不節(jié)、饑飽無常、過度勞倦、正氣不足，致脾胃受損，土侮木，而傷及肝，出現(xiàn)肝失條達(dá)、氣郁化火、痰瘀及熱毒蘊(yùn)結(jié)等。因此，臨床常以活血化瘀、扶正補(bǔ)虛、疏肝解郁健脾、清熱滲濕等法進(jìn)行治療。肝藏血，主疏泄，當(dāng)肝失疏泄，肝氣郁結(jié)會(huì)影響血液的歸藏和運(yùn)行，即肝郁氣滯、氣機(jī)不暢，導(dǎo)致血液瘀滯肝絡(luò)，為HF的“瘀血”論奠定了基礎(chǔ)。瘀血參與HF的始終，既是HF的致病因素，又是其重要的病理產(chǎn)物。著名肝病醫(yī)家周培郁認(rèn)為，肝病的辨證論治重在“血瘀”；林沛湘教授認(rèn)為，HF的主要病機(jī)為“肝虛血瘀”，可見HF的形成與血瘀密切相關(guān)?；钛鲱愔兴幵诜乐温愿闻K損傷、慢性肝炎、HF等疾病具有重要臨床意義。

前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，柔肝化纖顆粒能從多層面抑制乙肝病毒復(fù)制及傳播，顯著改善慢性肝炎的臨床癥狀，延緩HF［16-18］。該方由黃芪、鱉甲、牡蠣、黃精、枸杞子、薏苡仁、橘紅、澤蘭、雞內(nèi)金、虎杖、大棗組成。方中黃芪［19］、鱉甲［20］、虎杖［21］、靈芝［22］、當(dāng)歸［23］、絞股藍(lán)［24］、三七［25］、黃精［26］等均可抑制HSC活化、促進(jìn)ECM降解、抑制肝臟炎癥反應(yīng)等，從而抑制HF的發(fā)生。

HF是一個(gè)動(dòng)態(tài)且可逆的過程。臨床研究認(rèn)為，HF形成的中心環(huán)節(jié)是HSC由靜止型轉(zhuǎn)化為激活型。在正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝內(nèi)的HSC會(huì)被激活；當(dāng)肝臟出現(xiàn)活動(dòng)性炎癥時(shí)，會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞過度分泌TGF-β、IL-6和TNF-α等炎癥介質(zhì)，肝細(xì)胞毒性增加，肝臟損傷程度也增加［27］。因此，抑制HSC的活化及減輕肝臟炎癥反應(yīng)在抗HF方面具有重要意義。臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢性肝臟損傷經(jīng)久不愈會(huì)導(dǎo)致HF發(fā)生率增加，而炎性因子的異常分泌與HF的形成密切相關(guān)［28］。促炎因子IL-6、TNF-α及TGF-β會(huì)激活HSC，導(dǎo)致HF發(fā)生；同時(shí)活化的HSC又能分泌多種趨化因子，促進(jìn)HF炎癥微環(huán)境的形成［29-30］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，柔肝化纖顆粒低、中、高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，肝臟TNF-α mRNA、TGF-βmRNA及IL-6 mRNA水平均顯著降低，肝臟TNF-α、TGF-β、IL-6水平顯著降低，肝臟病理損傷有所改善。由于HF的病因病機(jī)十分復(fù)雜，而柔肝化纖顆粒能否通過多靶點(diǎn)調(diào)控肝臟炎癥因子表達(dá)，仍需進(jìn)一步的研究。