甲基紫顯色法研究幾種常見中藥成分的抗氧化自由基活性及其機(jī)理*

郭新穎，顧 俊，陳 峰，戴志英，楊梅桂

（南通市疾病預(yù)防控制中心 理化科，江蘇 南通226007）

羥自由基（hydroxyl free radical，·OH）是機(jī)體中活性氧的一種，它不僅是維持正常生命過(guò)程的必需物質(zhì)，還是殺死紅細(xì)胞、降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物的元兇[1-3]。作為生物體的破壞者，在體內(nèi)自由基失衡的非正常的生理水平上，·OH通過(guò)攻擊生物大分子導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，從而引起人類的各種疾病[4-6]。因此，為清除體內(nèi)多余自由基，國(guó)內(nèi)外已將具有抗氧化成分的天然與合成類抗氧化劑的研究開發(fā)作為主要方向，尤其是對(duì)中藥進(jìn)行了大量研究[7-10]。本文從中藥提取物的的清除·OH的能力作為其主要抗氧化指標(biāo)，以甲基紫（methyl violet，MV）作為顯色劑，結(jié)合分光光度法的試驗(yàn)方法進(jìn)行了中藥清除·OH作用的初步研究，對(duì)可能產(chǎn)生的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了分析探討，以期對(duì)中藥進(jìn)行體外抗氧化活性相關(guān)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

UNICO7200型分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；CS501超級(jí)恒溫槽（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；PHS-3CpH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；量筒、稱量紙、玻璃攪拌棒、藥品勺、試劑瓶若干。

1.2 材料與試劑

甲基紫（5.15×10-5mol·L-1），F(xiàn)eSO4（1.5×10-4mol·L-1），H2O2（0.3%），Na2HPO4,檸檬酸，H3PO4，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中藥為市售。

Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制9.35mL 0.2mol·L-1Na2HPO4和10.65mL 0.1mol·L-1檸檬酸混合，HCl精確調(diào)至pH值為4.5。

1.3 試驗(yàn)原理

Fenton試劑反應(yīng)是目前已知的產(chǎn)生·OH的經(jīng)典方法，·OH是在整個(gè)反應(yīng)中起主要氧化作用的物質(zhì)，它與有機(jī)染料如染色劑、顯色劑、熒光劑、抗氧化劑等反應(yīng)的主要途徑是奪取氫原子、發(fā)生電子轉(zhuǎn)移以及產(chǎn)生加成反應(yīng)的過(guò)程。目前，公認(rèn)的鐵基Fenton體系的反應(yīng)方程式可簡(jiǎn)便表述為：

從以上反應(yīng)簡(jiǎn)式看出，反應(yīng)式中的整條反應(yīng)鏈實(shí)際上是在Fe2+的催化作用下將H2O2全部消耗生成H2O和O2的凈反應(yīng)，中間產(chǎn)物·OH可引發(fā)鏈反應(yīng)產(chǎn)生更多自由基來(lái)消耗目標(biāo)物。本試驗(yàn)是以甲基紫MV作為有機(jī)化合物，在酸性條件下顯色，反應(yīng)體系中·OH憑借極高的電負(fù)性（Ep=2.80V）有選擇性地進(jìn)攻甲基紫的高電子云密度點(diǎn)如-C=C-基團(tuán)，同時(shí)發(fā)生親電加成反應(yīng)，以甲基紫褪色作為反應(yīng)終點(diǎn)[11]。

1.4 計(jì)算公式

·OH清除率實(shí)驗(yàn)是體外抗氧化活性試驗(yàn)的一種常用的評(píng)價(jià)檢測(cè)方法，主要是利用顯色劑在含有·OH的反應(yīng)體系中會(huì)降低體系的吸光度，而吸光強(qiáng)度的降低程度又與·OH有著比較明顯的量效關(guān)系，因而可以根據(jù)這個(gè)原理間接地測(cè)定·OH的產(chǎn)生量，從而較為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)某一物質(zhì)的體外抗氧化活性[12]。

反應(yīng)體系清除率CR%的計(jì)算公式為：

其中，加入抗氧化劑的反應(yīng)體系吸光度值記作AS，未加入抗氧化劑的反應(yīng)體系吸光度值記作A，空白參比吸光度值記作A0，·OH反應(yīng)前后溶液的吸光度變化差值記作ΔA。計(jì)算結(jié)果用百分制（%）表示。

1.5 樣品處理

中藥經(jīng)清洗晾干后用粉碎機(jī)粉碎。準(zhǔn)確稱取粉末5.0g，用50mL蒸餾水水浴加熱60min，過(guò)濾離心后得到中藥水提物，試驗(yàn)時(shí)取處理后的上清液1mL待測(cè)。

1.6 樣品測(cè)定

試驗(yàn)測(cè)定參照劉立明[13]的方法。在2支10mL比色管中按先后順序依次加入1.0mL 5.15×10-5mol·L-1MV溶液和1.0mL Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH值為4.5），一支作為試劑空白參比，另一支繼續(xù)加入1.0mL 1.5×10-4mol·L-1FeSO4溶液和1.0mL 0.3%的H2O2溶液作為反應(yīng)體系。兩體系溶液均定容至10.0mL，室溫放置5min后，在分光光度計(jì)上以582nm吸收波長(zhǎng)配1cm比色皿測(cè)定各體系吸光度變化值ΔA并計(jì)算清除率CR%。

2 結(jié)果與討論

2.1 體系吸收光譜

在pH值為4.5的弱酸性介質(zhì)中，分別測(cè)定MV和MV-Fe2+-H2O2溶液的吸收曲線，得到的兩種溶液吸收光譜圖。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單一MV溶液和MV-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系溶液的最大吸收波長(zhǎng)均在582nm附近且吸光度值不變，被氧化的MV-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系溶液吸光度明顯降低，但是最大吸收波長(zhǎng)并沒(méi)有變化，因此，本試驗(yàn)確定兩體系溶液的測(cè)定波長(zhǎng)為582nm。

2.2 試驗(yàn)影響因素分析

2.2.1 顯色劑用量的影響 由于顯色劑MV的濃度大小對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的觀察與檢測(cè)有較大影響，故有必要對(duì)MV的用量進(jìn)行考察。本試驗(yàn)選擇濃度為5.15×10-5mol·L-1的MV溶液，考察了MV溶液體積分別為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7個(gè)不同體積用量對(duì)體系吸光度的影響。結(jié)果見圖1。

圖1 顯色劑用量的影響Fig.1 Effect of different volume and dosage of chromogenic reagent

由圖1可見，ΔA值隨MV用量的逐漸增大而增加；當(dāng)用量達(dá)1.0mL時(shí)ΔA值最大，故本試驗(yàn)選用MV溶液1.0mL。

2.2.2 酸度的影響 分別配制pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0共7個(gè)pH值的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of pH

由圖2可知，在弱酸條件下有利于Fenton反應(yīng)中·OH的生成，故本試驗(yàn)選用pH值為4.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，按試驗(yàn)方法分別測(cè)定空白體系與反應(yīng)體系的吸光度差值ΔA。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，ΔA值隨酸度用量增加而增大；當(dāng)用量為1.0mL時(shí)，ΔA值趨于最大，綜合考慮將本試驗(yàn)緩沖溶液的用量定為1.0mL。

2.2.3 Fe2+用量的影響FeSO4作為反應(yīng)體系的反應(yīng)物濃度，F(xiàn)e2+的濃度會(huì)對(duì)·OH的產(chǎn)生量產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)選用1.5×10-4mol·L-1的FeSO4溶液，按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Fe2+體積分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7個(gè)不同用量對(duì)體系吸光度的影響進(jìn)行分析。結(jié)果見圖3。

圖3 Fe2+用量的影響Fig.3 Effect of different volume of Fe2+

由圖3可知，隨著FeSO4用量的增加，ΔA呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)；當(dāng)用量達(dá)到1.0mL時(shí)ΔA趨于穩(wěn)定。故本試驗(yàn)FeSO4溶液的用量為1.0mL。

2.2.4 H2O2用量的影響 ·OH的產(chǎn)量和反應(yīng)程度也受反應(yīng)物H2O2濃度的影響。分別加入體積為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7個(gè)不同用量的0.3% H2O2溶液，考察吸光度變化值ΔA。結(jié)果見圖4。

圖4 H2O2用量的影響Fig.4 Effect of different volume of H2O2

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，ΔA隨著H2O2用量的增加而增大；當(dāng)用量超過(guò)1.0mL時(shí)，ΔA吸光度值變化不大，故本實(shí)驗(yàn)選用H2O2溶液1.0mL。2.2.5反應(yīng)時(shí)間的影響 試驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間分別為1、2、4、6、8和10min共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)體系的吸光度變化值ΔA影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0~5min內(nèi)，吸光度隨時(shí)間的增大而增大，5min后ΔA值基本無(wú)變化。故本試驗(yàn)測(cè)定時(shí)間選為5min。

2.3 中藥提取物的抗氧化活性

本試驗(yàn)以抗·OH清除能力作為評(píng)價(jià)中藥體外抗氧化活性的性能指標(biāo)，對(duì)當(dāng)歸、山楂、葛根、菊花和枸杞等5種中藥水提取物的抗·OH清除能力（以清除率計(jì)）進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 5種中藥提取物對(duì)·OH的體外清除作用（n=6）Tab.1 Scavenging effects of extracts in 5 TCMs（n=6）

由表1可見，5種中藥水提物都有一定程度的抗·OH清除能力，但清除能力大小有較大差別，5種中藥·OH清除能力及清除率數(shù)值從大到小依次為：當(dāng)歸45.28%，山楂42.17%，葛根38.58%，菊花33.41%，枸杞12.94%。5種中藥·OH清除能力的不同反映了其各自抗氧化能力的大小，這表明5種中藥水提物存在不同組分的抗氧化活性物質(zhì)，也間接證明了這5種中藥抗氧化能力的大小或可與各物質(zhì)所含有的不同抗氧化成分有關(guān)。

2.4 中藥抗氧化的機(jī)理

探討近年來(lái)所有生化研究中的芬頓（Fenton）反應(yīng)型中，已知的幾種中藥主要抗氧化成分最受關(guān)注的是黃酮類化合物，因其結(jié)構(gòu)式中含有若干個(gè)苯環(huán)三碳鏈（C6-C3-C6）骨架和酚羥基（直接與芳香烴相連的羥基，R-OH），且目前已知的多數(shù)中藥提取物中均可分離出具有較強(qiáng)的清除自由基能力的黃酮類物質(zhì)[14]。鑒于此，本試驗(yàn)所選取的5種中藥均具有抗氧化成分黃酮類，認(rèn)為這幾種中藥中的黃酮類化合物可以通過(guò)直接與芳香烴相連的羥基（酚羥基，R-OH）與·OH反應(yīng)生成穩(wěn)定化合物中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑或與鐵基金屬離子絡(luò)合降低催化反應(yīng)速率，通過(guò)以上作用機(jī)制來(lái)清除體系·OH。也有研究指出，中藥的加入之所以能夠防止機(jī)體過(guò)氧化，是因?yàn)橹兴幊煞种械狞S酮類化合物以氫鍵形式發(fā)生反應(yīng)[15]，通過(guò)阻止體系的不飽和鍵與·OH上的不成對(duì)電子接觸或反應(yīng)，以此降低過(guò)氧化程度，使中藥的抗氧化能力得到有效保護(hù)。同時(shí)，本文以甲基紫-芬頓體系（MVFenton）作為體外模擬試驗(yàn)體系中，發(fā)揮主要催化作用的是Fe2+，·OH處于激發(fā)態(tài)且?guī)в幸粋€(gè)不成對(duì)電子，F(xiàn)e2+的加入會(huì)將·OH催化分解為H2O2，從而抑制·OH的過(guò)氧化作用。以上反應(yīng)機(jī)理與本文對(duì)中藥的抗氧化機(jī)理的研究相一致。

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)選擇MV作為試驗(yàn)顯色體系，以中藥的抗·OH清除率作為評(píng)價(jià)中藥的抗氧化活性指標(biāo)，對(duì)5種中藥水提物進(jìn)行體外抗氧化活性的比較分析，對(duì)中藥在體外的抗氧化性能的反應(yīng)機(jī)制及其機(jī)理研究進(jìn)行了初步探索。以上試驗(yàn)結(jié)論可以為在體內(nèi)的中藥作為抗氧化劑抗氧化作用和生理功效的關(guān)系研究提供相關(guān)理論參考?？傊?，中藥作為天然藥物的來(lái)源，因其毒副作用小、安全性高，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于中藥成分的復(fù)雜性，抗氧化機(jī)理研究等尚處于初步探索階段，針對(duì)中藥抗氧化成分分析及其作用機(jī)制尚有待于更加深入的試驗(yàn)研究。